本發(fā)明涉及一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
自俄國生物學(xué)家梅契尼柯夫發(fā)現(xiàn)乳酸菌的重要作用以來，乳酸菌及乳酸菌飲料在世界各國的應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)普及，人們對(duì)它的認(rèn)識(shí)越來越深入。國內(nèi)外大量動(dòng)物和臨床試驗(yàn)證明，乳酸菌對(duì)人和動(dòng)物都有較好的保健和治療功效，其主要作用有：改善胃腸道功能，維持腸道菌群平衡。乳酸菌是腸道常在菌，可以改變動(dòng)物腸道內(nèi)環(huán)境，抑制有害菌繁殖，調(diào)整胃腸道菌群平衡。畜禽服用乳酸菌后，乳酸菌通過黏附素與腸黏膜細(xì)胞緊密結(jié)合，在腸黏膜表面定植占位，成為生理屏障的主要組成部分，從而達(dá)到恢復(fù)宿主抵抗力，修復(fù)腸道菌群屏障、治愈腸道疾病的作用。如果這個(gè)屏障遭到抗生素或其他因素的破壞，宿主喪失了對(duì)外來菌抵抗力，會(huì)使具有耐藥性的腸內(nèi)菌異常增殖而取代優(yōu)勢(shì)菌的位置，造成腸道內(nèi)微生態(tài)平衡的失調(diào)。其次，乳酸菌能夠?yàn)闄C(jī)體提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，乳酸菌能直接為宿主提供可利用的必需氨基酸和各種維生素，還可提高礦物元素的生物活性，進(jìn)而達(dá)到為宿主提供必需營養(yǎng)物質(zhì)、增強(qiáng)動(dòng)物的營養(yǎng)代謝、直接促其生長(zhǎng)的作用，也可以加強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。再次，乳酸菌具有提高免疫力的作用，一方面能明顯激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，另一方面由于它能在腸道定植，相當(dāng)于天然自動(dòng)免疫，還能刺激腹膜巨噬細(xì)胞、誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素、促進(jìn)細(xì)胞分裂、產(chǎn)生抗體及促進(jìn)細(xì)胞免疫等，所以能增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫反應(yīng)，提高機(jī)體的抗病能力。最后，乳酸菌對(duì)一些低溫菌和腐敗菌有很好的抑制作用，可用于防治腹瀉、下痢、腸炎、便秘和由于腸道功能紊亂引起的多種疾病以及皮膚炎癥。
綜上，乳酸菌對(duì)動(dòng)物體的健康起到舉足輕重的作用，然而乳酸菌在動(dòng)物腸道內(nèi)要充分發(fā)揮其作用，必須保證乳酸菌是活性菌。而目前市售的乳酸菌產(chǎn)品保質(zhì)時(shí)間短，常溫下活菌量下降迅速，動(dòng)物飲用后收不到良好的效果，不能滿足人們對(duì)液態(tài)乳酸菌的需求。而現(xiàn)有技術(shù)中，為了避免這些問題，往往采用培養(yǎng)基來延長(zhǎng)乳酸菌活菌的存活期、提高乳酸菌的生物活性。培養(yǎng)基是供微生物、植物組織和動(dòng)物組織生長(zhǎng)和維持用的人工配制養(yǎng)料，一般含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無機(jī)鹽、維生素和水等，有的還含有抗菌素、色素、激素和血清。而現(xiàn)有的用來延長(zhǎng)乳酸菌活菌存活期的培養(yǎng)基的效果不甚理想，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求。所以，亟需一種可以有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉、能使乳酸菌的性質(zhì)更穩(wěn)定、生物活性更強(qiáng)、儲(chǔ)存更長(zhǎng)久的有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基及其制備方法。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，其活性成分由以下重量份數(shù)的原料制成：蛋白胨0.08-0.12份、酵母浸粉0.08-0.12份、甘露寡糖1.5-2.5份、脫脂奶粉0.16-0.24份、脫脂豆粕0.5-0.7份、七水硫酸鎂0.05-0.07份、七水硫酸錳0.025-0.035份、玉米漿干粉1.5-2.5份、復(fù)合添加劑0.008-0.012份、磷酸二氫鈉0.025-0.035份、檸檬酸鈉0.25-0.35份、檸檬酸0.2-0.3份、乙酸鈉0.08-0.12份、吐溫80為0.08-0.12份、釀酒酵母0.04-0.06份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
優(yōu)選的，各活性成分的重量份數(shù)為：蛋白胨0.1份、酵母浸粉0.1份、甘露寡糖2份、脫脂奶粉0.2份、脫脂豆粕0.6份、七水硫酸鎂0.06份、七水硫酸錳0.03份、玉米漿干粉2份、復(fù)合添加劑0.01份、磷酸二氫鈉0.03份、檸檬酸鈉0.3份、檸檬酸0.25份、乙酸鈉0.1份、吐溫80為0.1份、釀酒酵母0.05份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
上述有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
(1)將玉米漿干粉置于攪拌槽中，加入4-6倍玉米漿干粉質(zhì)量的8℃-12℃的凈化水，攪拌成糊狀，放置20-30分鐘后，加入2-4倍玉米漿干粉質(zhì)量的15℃-20℃的凈化水，攪拌均勻；
(2)依次將蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脫脂奶粉、脫脂豆粕、七水硫酸鎂、七水硫酸錳、步驟(1)所得產(chǎn)物、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、吐溫80和釀酒酵母放入燒杯中，加入0.6-0.8倍混合物質(zhì)量的15℃-18℃的凈化水，攪拌均勻，得混合液；
(3)將復(fù)合添加劑中的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠按質(zhì)量比為2：2：3：1：1：2的比例混合均勻，加入到80-100倍復(fù)合添加劑質(zhì)量的純凈水中，充分混勻溶解；
(4)將步驟(3)中所得產(chǎn)物加入到步驟(2)中盛有混合液中的燒杯中，混合均勻，將混合均勻后的盛有混合物料的燒杯置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上，小火加熱，邊加熱邊用玻璃棒順時(shí)針攪拌25-35分鐘，停止加熱；
(5)往步驟(4)所得產(chǎn)物中加入質(zhì)量濃度為5％-7％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.4-5.8；
(6)將步驟(5)所得產(chǎn)物高壓滅菌18-22分鐘，即得該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基。
所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2。
所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g，是將釀酒酵母置于釀酒酵母液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得，其中釀酒酵母液體培養(yǎng)基的成分為蛋白胨0.5份、甘露寡糖1份、酵母浸出物0.3份、麥芽汁0.3份。
步驟(6)的高壓滅菌具體步驟為：待蒸氣壓力為1.05kg/cm2-1.15kg/cm2時(shí)保持恒壓，待水蒸氣的溫度上升至120℃-122℃時(shí)，保持恒溫下滅菌18-22分鐘，停止加壓，待壓力降為0后釋放水蒸氣。
用法：將一種或多種乳酸菌的種子液加入到本發(fā)明有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基中，在35℃-40℃的溫度下培養(yǎng)。
本發(fā)明所采用的各活性成分的藥用性能如下所示：
蛋白胨：蛋白胨是將肉、酪素或明膠用酸或蛋白酶水解后干燥而成的粉劑，富含有機(jī)氮化合物、維生素和糖類，可以作為微生物培養(yǎng)基的主要原料，為微生物提供C源、N源、生長(zhǎng)因子等營養(yǎng)物質(zhì)。
酵母浸粉：酵母浸粉是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母為原料，經(jīng)自溶、酶解、濃縮、干燥等工藝制成的一種富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、核酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分的生物培養(yǎng)基產(chǎn)品。酵母浸粉營養(yǎng)成分比例協(xié)調(diào)，能為微生物發(fā)酵培養(yǎng)提供全面均衡的營養(yǎng)。
甘露寡糖：甘露寡糖是從酵母培養(yǎng)細(xì)胞壁中提取的一類新型抗原活性物質(zhì)，不僅具有低熱、穩(wěn)定、安全無毒的良好理化性質(zhì)，而且具有保護(hù)腸道和提高免疫力的作用。
脫脂奶粉：脫脂奶粉是將鮮牛奶脫去脂肪再干燥而成的粉末狀產(chǎn)品，所含蛋白質(zhì)不低于非脂乳固體的34％，含有豐富的營養(yǎng)因子。脫脂奶粉的脂肪含量較少，易保存，不易發(fā)生氧化作用。
脫脂豆粕：脫脂豆粕是指大豆經(jīng)浸油后剩余的副產(chǎn)品，含有46％的蛋白質(zhì)、鉀、鈣等無機(jī)鹽和碳水化合物，利用它可制成多種多樣的特色食品。脫脂豆粕作為一種高蛋白質(zhì)，是制作牲畜與家禽飼料的主要原料，還可以用于制作糕點(diǎn)食品，健康食品以及化妝品和抗菌素原料。
七水硫酸鎂：七水硫酸鎂為四角粒狀或菱形晶體，無色透明，易溶于水，微溶于乙醇和甘油。在本發(fā)明中與七水硫酸錳一起為培養(yǎng)乳酸菌提供必需的微量元素。
七水硫酸錳：七水硫酸錳是采用氧化錳和碳酸錳浸取提液濃縮而成的粉紅色的粉末。在本發(fā)明中與七水硫酸鎂一起為培養(yǎng)乳酸菌提供必需的微量元素。
玉米漿干粉：玉米漿干粉是以鮮玉米漿為原料經(jīng)低溫瞬間加熱噴霧干燥而成的粉末，其蛋白質(zhì)、微量元素含量高。玉米漿是微生物生長(zhǎng)很普遍應(yīng)用的有機(jī)氮源，它還能促進(jìn)青霉素等抗生素的生物合成。在生物發(fā)酵過程中作水溶性植物蛋白及水溶性維生素等營養(yǎng)元素補(bǔ)充劑。
復(fù)合添加劑：本發(fā)明中的復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠按照質(zhì)量比為2：2：3：1：1：2的比例混合而成。羧甲基纖維素鈉本身是一種增稠劑，可有效提高產(chǎn)品的均一度，羧甲基纖維素鈉與明膠及果膠可以形成共凝聚物，也可以與膠原形成復(fù)合物，能沉淀某些帶正電的蛋白。骨粉是將哺乳動(dòng)物組織和骨頭經(jīng)過煉油、干燥和粉碎后的產(chǎn)品，主要成分是磷酸三鈣、骨膠和脂肪。海藻酸鈉凝膠小球內(nèi)部為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，乳酸菌經(jīng)其部分包埋后，其熱穩(wěn)定性和耐久儲(chǔ)存性都明顯提高。王漿酸(10-HDA)是從蜂王漿中分離出一種有機(jī)酸，是一種特殊的不飽和有機(jī)酸，是一種白色晶體，熔點(diǎn)64℃，性質(zhì)比較穩(wěn)定，有很好的殺菌、抑菌作用和抗癌、抗放射的功能，在低溫或高溫的環(huán)境中可以長(zhǎng)時(shí)間的存放且其結(jié)構(gòu)也不會(huì)出現(xiàn)破壞或消失的現(xiàn)象。本發(fā)明中將羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠混合使用，單位粘度要比羧甲基纖維素鈉高2-3倍。
磷酸二氫鈉：本發(fā)明所用的磷酸二氫鈉為酸堿緩沖劑，磷酸二氫鈉為無色斜方晶結(jié)晶，主要用于制革、處理鍋爐水，作為品質(zhì)改良劑和制焙粉，在食品工業(yè)、發(fā)酵工業(yè)中作緩沖劑和發(fā)酵粉原料，還用作飼料添加劑、洗滌劑及染助劑等。
檸檬酸鈉：檸檬酸鈉是一種白色晶體狀的有機(jī)化合物，在食品、飲料工業(yè)中用作風(fēng)味劑、穩(wěn)定劑；在醫(yī)藥工業(yè)中用作抗血凝劑、化痰藥和利尿藥；在洗滌劑工業(yè)中作為無毒洗滌劑的助劑等。在本發(fā)明中與檸檬酸和乙酸鈉等一同為培養(yǎng)乳酸菌提供生長(zhǎng)因子,其有效成分還能維持均衡滲透壓，抑制雜菌。
檸檬酸：檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，在室溫下為無色半透明晶體或白色顆?；虬咨Y(jié)晶性粉末，無臭，易溶于水。在本發(fā)明中與檸檬酸鈉和乙酸鈉等一同為培養(yǎng)乳酸菌提供生長(zhǎng)因子,其有效成分還能維持均衡滲透壓，抑制雜菌。
乙酸鈉：乙酸鈉是無色無味的結(jié)晶體，主要用于印染工業(yè)、醫(yī)藥、照相、電鍍、化學(xué)試劑及有機(jī)合成等。在本發(fā)明中與檸檬酸鈉和檸檬酸等一同為培養(yǎng)乳酸菌提供生長(zhǎng)因子,其有效成分還能維持均衡滲透壓，抑制雜菌。
吐溫80：吐溫80在本發(fā)明中為表面活性劑，吐溫80為淡黃色至橙黃色的粘稠液體，味微苦略澀，吐溫80中的親脂成份包括不飽和脂肪酸等。
釀酒酵母：釀酒酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類，傳統(tǒng)上用于制作面包和饅頭等食品及釀酒。在本發(fā)明中為培養(yǎng)乳酸菌提供碳源、氮源。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，以蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脫脂奶粉、脫脂豆粕、七水硫酸鎂、復(fù)合添加劑、檸檬酸、乙酸鈉、釀酒酵母等原料精制而成。其中，釀酒酵母與甘露寡糖等一起為培養(yǎng)乳酸菌提供碳源和氮源；七水硫酸鎂和七水硫酸錳一起為培養(yǎng)乳酸菌提供多種必需的微量元素；檸檬酸鈉、檸檬酸和乙酸鈉為培養(yǎng)乳酸菌提供生長(zhǎng)因子,其成分還能維持均衡滲透壓，抑制雜菌。諸原料相互協(xié)同，能使液態(tài)乳酸菌在常溫下長(zhǎng)時(shí)間都能保持較高活菌量，且操作簡(jiǎn)便，原料易得，成本低廉，能使乳酸菌的性質(zhì)更穩(wěn)定、生物活性更強(qiáng)、儲(chǔ)存更長(zhǎng)久。
該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，使用的釀酒酵母能分泌營養(yǎng)物質(zhì)并增強(qiáng)乳酸菌的活力，延緩乳酸菌的衰亡時(shí)間，同時(shí)與甘露寡糖等一起為培養(yǎng)乳酸菌提供碳源和氮源，而且甘露寡糖同時(shí)具有β-1，3葡聚糖和β-1，6葡聚糖功能的，有效增加了乳酸菌攝取碳源的渠道，從而增加了活菌量。該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，使用脫脂奶粉的同時(shí)也配合使用了脫脂豆粕，不但能滿足乳酸菌生長(zhǎng)過程中所需的蛋白質(zhì)，而且能夠?yàn)槿樗峋纳L(zhǎng)提供足夠的豐富的營養(yǎng)因子，從而在保證乳酸菌營養(yǎng)成分的同時(shí)，有效地降低了成本，同時(shí)提高了培養(yǎng)效果。該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，使用了搭配合理的復(fù)合添加劑，所述復(fù)合添加劑為一定比例的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物。羧甲基纖維素鈉是一種增稠劑，可有效提高產(chǎn)品的均一度，羧甲基纖維素鈉與明膠及果膠可以形成共凝聚物，也可以與膠原形成復(fù)合物，能沉淀某些帶正電的蛋白，海藻酸鈉凝膠小球內(nèi)部為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，乳酸菌經(jīng)其部分包埋后，其熱穩(wěn)定性和耐久儲(chǔ)存性明顯提高；王漿酸有很好的殺菌、抑菌作用和抗癌、抗放射的功能，在低溫或高溫的環(huán)境中可以長(zhǎng)時(shí)間的存放且其結(jié)構(gòu)也不會(huì)出現(xiàn)破壞或消失的現(xiàn)象，本發(fā)明中使用王漿酸可以對(duì)大腸桿菌等雜菌產(chǎn)生抑制作用，而乳酸菌本身耐酸性較好，不會(huì)受到影響，王漿酸的使用不但保證了食品安全性，而且防止了有害菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，從而促進(jìn)了乳酸菌活菌數(shù)的增長(zhǎng)；本發(fā)明中將羧甲基纖維素鈉與海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠混合使用，單位粘度要比羧甲基纖維素鈉高2-3倍，而且可有效避免出現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)和乳酸菌處于懸浮狀態(tài)的現(xiàn)象，從而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)被充分利用，進(jìn)而延長(zhǎng)了活性乳酸菌的保存期。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于此。
實(shí)施例1：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，取下述重量份數(shù)的原料制備而成(每份取30g)：蛋白胨0.08份、酵母浸粉0.08份、甘露寡糖1.5份、脫脂奶粉0.8份、脫脂豆粕0.5份、七水硫酸鎂0.05份、七水硫酸錳0.025份、玉米漿干粉1.5份、復(fù)合添加劑0.008份、磷酸二氫鈉0.025份、檸檬酸鈉0.25份、檸檬酸0.2份、乙酸鈉0.08份、吐溫80為0.08份、釀酒酵母0.04份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
上述有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基的制備方法，采用如下步驟：
(1)將玉米漿干粉置于攪拌槽中，加入4倍玉米漿干粉質(zhì)量的8℃的凈化水，攪拌成糊狀，放置20分鐘后，加入2倍玉米漿干粉質(zhì)量的15℃的凈化水，攪拌均勻；
(2)依次將蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脫脂奶粉、脫脂豆粕、七水硫酸鎂、七水硫酸錳、步驟(1)所得產(chǎn)物、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、吐溫80和菌落密度為2×105cfu/g的釀酒酵母(是將釀酒酵母置于釀酒酵母液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得，其中釀酒酵母液體培養(yǎng)基的成分為蛋白胨0.5份、葡萄糖1份、酵母浸出物0.3份、麥芽汁0.3份)放入燒杯中，加入0.6倍混合物質(zhì)量的17℃的凈化水，攪拌均勻，得混合液；
(3)將復(fù)合添加劑中的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠按質(zhì)量比為2：2：3：1：1：2的比例混合均勻，加入到80倍復(fù)合添加劑質(zhì)量的純凈水中，充分混勻溶解；
(4)將步驟(3)中所得產(chǎn)物加入到步驟(2)中盛有混合液中的燒杯中，混合均勻，將混合均勻后的盛有混合物料的燒杯置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上，小火加熱，邊加熱邊用玻璃棒順時(shí)針攪拌25分鐘，停止加熱；
(5)往步驟(4)所得產(chǎn)物中加入質(zhì)量濃度為5％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.4；
(6)將步驟(5)所得產(chǎn)物高壓滅菌(待蒸氣壓力為1.08kg/cm2時(shí)保持恒壓，待水蒸氣的溫度上升至120℃時(shí)，保持恒溫下滅菌18分鐘，停止加壓，待壓力降為0后釋放水蒸氣)18分鐘，即得該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基。
用法：將某種或多種乳酸菌的種子液加入到所得的有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基中，在37℃的溫度下培養(yǎng)。
實(shí)施例2：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，其活性成分由以下重量的原料制成(每份取15g)：蛋白胨0.12份、酵母浸粉0.12份、甘露寡糖2.5份、脫脂奶粉1.2份、脫脂豆粕0.7份、七水硫酸鎂0.07份、七水硫酸錳0.035份、玉米漿干粉2.5份、復(fù)合添加劑0.012份、磷酸二氫鈉0.035份、檸檬酸鈉0.35份、檸檬酸0.3份、乙酸鈉0.12份、吐溫80為0.12份、釀酒酵母0.06份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
(1)將玉米漿干粉置于攪拌槽中，加入6倍玉米漿干粉質(zhì)量的12℃的凈化水，攪拌成糊狀，放置30分鐘后，加入4倍玉米漿干粉質(zhì)量的20℃的凈化水，攪拌均勻；
(2)依次將蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脫脂奶粉、脫脂豆粕、七水硫酸鎂、七水硫酸錳、步驟(1)所得產(chǎn)物、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、吐溫80和菌落密度為2×105cfu/g的釀酒酵母(是將釀酒酵母置于釀酒酵母液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得，其中釀酒酵母液體培養(yǎng)基的成分為蛋白胨0.5份、葡萄糖1份、酵母浸出物0.3份、麥芽汁0.3份)放入燒杯中，加入0.7倍混合物質(zhì)量的17℃的凈化水，攪拌均勻，得混合液；
(3)將復(fù)合添加劑中的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠按質(zhì)量比為2：2：3：1：1：2的比例混合均勻，加入到100倍復(fù)合添加劑質(zhì)量的純凈水中，充分混勻溶解；
(4)將步驟(3)中所得產(chǎn)物加入到步驟(2)中盛有混合液中的燒杯中，混合均勻，將混合均勻后的盛有混合物料的燒杯置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上，小火加熱，邊加熱邊用玻璃棒順時(shí)針攪拌35分鐘，停止加熱；
(5)往步驟(4)所得產(chǎn)物中加入質(zhì)量濃度為7％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.8；
(6)將步驟(5)所得產(chǎn)物高壓滅菌(待蒸氣壓力為1.13kg/cm2時(shí)保持恒壓，待水蒸氣的溫度上升至122℃時(shí)，保持恒溫下滅菌22分鐘，停止加壓，待壓力降為0后釋放水蒸氣)22分鐘，即得該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基。
用法同實(shí)施例1。
實(shí)施例3：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，其活性成分由以下重量的原料制成(每份取25kg)：蛋白胨0.09份、酵母浸粉0.09份、甘露寡糖1.8份、脫脂奶粉0.9份、脫脂豆粕0.55份、七水硫酸鎂0.055份、七水硫酸錳0.028份、玉米漿干粉1.8份、復(fù)合添加劑0.009份、磷酸二氫鈉0.028份、檸檬酸鈉0.28份、檸檬酸0.23份、乙酸鈉0.09份、吐溫80為0.09份、釀酒酵母0.045份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
(1)將玉米漿干粉置于攪拌槽中，加入5倍玉米漿干粉質(zhì)量的10℃的凈化水，攪拌成糊狀，放置25分鐘后，加入3倍玉米漿干粉質(zhì)量的18℃的凈化水，攪拌均勻；
(2)依次將蛋白胨、酵母浸粉、甘露寡糖、脫脂奶粉、脫脂豆粕、七水硫酸鎂、七水硫酸錳、步驟(1)所得產(chǎn)物、磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉、檸檬酸、乙酸鈉、吐溫80和菌落密度為2×105cfu/g的釀酒酵母(是將釀酒酵母置于釀酒酵母液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得，其中釀酒酵母液體培養(yǎng)基的成分為蛋白胨0.5份、葡萄糖1份、酵母浸出物0.3份、麥芽汁0.3份)放入燒杯中，加入0.7倍混合物質(zhì)量的17℃的凈化水，攪拌均勻，得混合液；
(3)將復(fù)合添加劑中的羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠按質(zhì)量比為2：2：3：1：1：2的比例混合均勻，加入到90倍復(fù)合添加劑質(zhì)量的純凈水中，充分混勻溶解；
(4)將步驟(3)中所得產(chǎn)物加入到步驟(2)中盛有混合液中的燒杯中，混合均勻，將混合均勻后的盛有混合物料的燒杯置于鋪有石棉網(wǎng)的電爐上，小火加熱，邊加熱邊用玻璃棒順時(shí)針攪拌30分鐘，停止加熱；
(5)往步驟(4)所得產(chǎn)物中加入質(zhì)量濃度為6％的HCl溶液，調(diào)節(jié)pH值為5.6；
(6)將步驟(5)所得產(chǎn)物高壓滅菌(待蒸氣壓力為1.1kg/cm2時(shí)保持恒壓，待水蒸氣的溫度上升至121℃時(shí)，保持恒溫下滅菌20分鐘，停止加壓，待壓力降為0后釋放水蒸氣)20分鐘，即得該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基。
用法同實(shí)施例1。
實(shí)施例4：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，其活性成分由以下重量的原料制成(每份取25kg)：蛋白胨0.11份、酵母浸粉0.11份、甘露寡糖2.2份、脫脂奶粉1.1份、脫脂豆粕0.65份、七水硫酸鎂0.065份、七水硫酸錳0.032份、玉米漿干粉2.2份、復(fù)合添加劑0.011份、磷酸二氫鈉0.032份、檸檬酸鈉0.32份、檸檬酸0.27份、乙酸鈉0.11份、吐溫80為0.11份、釀酒酵母0.055份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
制備方法與用法同實(shí)施例3。
實(shí)施例5：該有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，其活性成分由以下重量的原料制成(每份取25kg)：蛋白胨0.1份、酵母浸粉0.1份、甘露寡糖2份、脫脂奶粉1份、脫脂豆粕0.6份、七水硫酸鎂0.06份、七水硫酸錳0.03份、玉米漿干粉2份、復(fù)合添加劑0.01份、磷酸二氫鈉0.03份、檸檬酸鈉0.3份、檸檬酸0.25份、乙酸鈉0.1份、吐溫80為0.1份、釀酒酵母0.05份；所述復(fù)合添加劑為羧甲基纖維素鈉、海藻酸鈉、骨粉、王漿酸、瓜爾豆膠和黃原膠的混合物，且質(zhì)量比為羧甲基纖維素鈉：海藻酸鈉：骨粉：王漿酸：瓜爾豆膠：黃原膠＝2：2：3：1：1：2；所述釀酒酵母的菌落密度為2×105cfu/g。
制備方法與用法同實(shí)施例3。
試驗(yàn)例：
針對(duì)本發(fā)明所得一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基，發(fā)明人做了效果對(duì)比實(shí)驗(yàn)。
將保加利亞乳桿菌置于乳酸菌種子液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)，得乳酸菌種子液。其中乳酸菌種子液體培養(yǎng)基的具體成分為：蛋白胨1份、牛肉膏1份、酵母提取物0.5份、磷酸氫二鉀0.2份、檸檬酸三銨0.2份、乙酸鈉0.5份、葡萄糖2份、吐溫80 0.1份、七水硫酸鎂0.06份、四水硫酸錳0.025份。
分別取本發(fā)明所得有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基(實(shí)施例1-5)作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組采用3種形式的培養(yǎng)基，分別為：對(duì)照組1采用經(jīng)典配方MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基，每升MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基配方(g/L)：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨[(NH4)2HC6H5O7]2.0g、葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g、吐溫80為1.0mL、乙酸鈉(CH3COONa·3H2O)5.0g、磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)2.0g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58g、硫酸錳(MnSO4·H2O)0.25g、瓊脂18.0g、蒸餾水1000mL；pH為6.2-6.6。對(duì)照組2所用培養(yǎng)基是購自青島海博生物技術(shù)有限公司的，其配方為(g/L)：蛋白胨10.0；牛肉浸粉5.0；酵母浸粉4.0；葡萄糖20.0；磷酸氫二鉀2.0；檸檬酸三銨2.0；醋酸鈉5.0；硫酸鎂0.2；硫酸錳0.05；瓊脂15.0；吐溫80為1.0；pH6.2±0.2；25℃。對(duì)照組3所用培養(yǎng)基是在本發(fā)明培養(yǎng)基的成分中減去羧甲基纖維素鈉和王漿酸后所制備而成的。
1.1本發(fā)明培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌菌量的影響
分別將0.25倍培養(yǎng)基質(zhì)量的混合乳酸菌種子液加入到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的相應(yīng)的培養(yǎng)基中，在37℃的溫度下培養(yǎng)36小時(shí)，無菌分裝，同時(shí)分別測(cè)定乳酸菌菌落數(shù)，然后分別在25℃、4℃、37℃環(huán)境下儲(chǔ)存9個(gè)月，在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定乳酸菌菌量，同時(shí)測(cè)定25℃雜菌生長(zhǎng)情況(以大腸桿菌作為雜菌代表進(jìn)行統(tǒng)計(jì))；在25℃第4天時(shí)選取發(fā)酵液，分別于底部、1/4、2/4、/3/4、頂部5個(gè)高度抽樣，測(cè)定該部位發(fā)酵產(chǎn)品密度，并求平均值，具體情況見表1-表5所示：
表1不同時(shí)間點(diǎn)的乳酸菌菌量(單位：cfu/g，25℃)
由表1，在25℃下，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的效果，兩組效果有顯著性差異(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組中的乳酸菌的死亡率與對(duì)照組的相比有大幅下降，其中，采用實(shí)施例5所得的有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第270天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)仍為5.8×107cfu/g，符合GB 19302-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《發(fā)酵乳》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；而采用對(duì)照組所使用的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第270天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)分別降低為0、1.2×102cfu/g和9.8×102cfu/g。顯然，本發(fā)明所得一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基比現(xiàn)有的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基以及現(xiàn)有技術(shù)中改良的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基的延長(zhǎng)乳酸菌存活期效果顯著。同時(shí)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組3的具體情況，實(shí)驗(yàn)組(實(shí)施例1-5)所用的培養(yǎng)基中添加了羧甲基纖維素鈉和王漿酸，而對(duì)照組3所用的培養(yǎng)基中未添加這些成分，由表1中的具體數(shù)值可以看出，使用本發(fā)明所得培養(yǎng)基(實(shí)施例1-5)的乳酸菌活菌在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)都有較高的含量，乳酸菌的死亡率與對(duì)照組3相比有大幅下降。
表2不同時(shí)間點(diǎn)的乳酸菌菌量(單位：cfu/g，4℃)
由表2，在4℃下，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的效果，兩組效果有顯著性差異(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組中的乳酸菌的死亡率與對(duì)照組的相比有大幅下。其中，采用實(shí)施例5所得的有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第270天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)仍為6.3×107cfu/g，符合GB 19302-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《發(fā)酵乳》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；而采用對(duì)照組所使用的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第270天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)分別降低為0、1.5×102cfu/g和1.3×103cfu/g。顯然，本發(fā)明所得一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基比現(xiàn)有的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基以及現(xiàn)有技術(shù)中改良的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基的延長(zhǎng)乳酸菌存活期效果顯著。同時(shí)，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組3的具體情況，實(shí)驗(yàn)組(實(shí)施例1-5)所用的培養(yǎng)基中添加了羧甲基纖維素鈉和王漿酸，而對(duì)照組3所用的培養(yǎng)基中未添加這些成分，由表2中的具體數(shù)值可以看出，使用本發(fā)明所得培養(yǎng)基(實(shí)施例1-5)的乳酸菌活菌在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)都有較高的含量，乳酸菌的死亡率與對(duì)照組3相比有大幅下降。
表3不同時(shí)間點(diǎn)的乳酸菌菌量(單位：cfu/g，37℃)
由表3，在37℃下，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的效果，兩組效果有顯著性差異(p＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組中的乳酸菌的死亡率與對(duì)照組的相比有大幅下。其中，采用實(shí)施例5所得的有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第21天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)仍為5.7×106cfu/g，而采用對(duì)照組所使用的培養(yǎng)基培養(yǎng)混合乳酸菌種子液后第17天時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)就均降低為0。顯然，本發(fā)明所得一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基比現(xiàn)有的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基、現(xiàn)有技術(shù)中改良的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基以及其他組份的培養(yǎng)基的延長(zhǎng)乳酸菌存活期效果顯著。由表3中的具體數(shù)值可以看出，使用本發(fā)明所得培養(yǎng)基(實(shí)施例1-5)的乳酸菌活菌在每個(gè)設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)都有較高的含量。
綜上，由表1-3可以看出，無論是在25℃、4℃還是37℃的溫度下，本發(fā)明所得一種有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基均比現(xiàn)有的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基、現(xiàn)有技術(shù)中改良的MRS乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基以及其他培養(yǎng)基的延長(zhǎng)乳酸菌存活期效果顯著。而且，由表3可知，本發(fā)明所得培養(yǎng)基可以在極端溫度(37℃)的條件下將保質(zhì)期提高到3個(gè)周，大大方便了用戶的使用。
表4不同時(shí)間點(diǎn)的大腸菌群數(shù)(單位：cfu/g，25℃)
注：-表示嚴(yán)重超標(biāo)，不再計(jì)數(shù)。
經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的效果，兩組效果有顯著性差異(p＜0.05)，由表4可以看出，實(shí)驗(yàn)組中的大腸菌群數(shù)遠(yuǎn)比對(duì)照組的大腸菌群數(shù)少。其中，在第5天時(shí)，本發(fā)明所的培養(yǎng)基均未出現(xiàn)大腸菌，第7天時(shí)也只有實(shí)施例3所得培養(yǎng)基中有少量大腸菌出現(xiàn)，而對(duì)照組在第3天就有大腸菌出現(xiàn)，且在第5天數(shù)時(shí)就有大量的大腸菌出現(xiàn)?？梢酝茢喑鐾鯘{酸的加入使得本發(fā)明所得培養(yǎng)基控制大腸桿菌增殖效果更加顯著(羧甲基纖維素鈉是一種增稠劑，王漿酸有很好的殺菌、抑菌作用，本發(fā)明中使用王漿酸可以對(duì)大腸桿菌等雜菌產(chǎn)生抑制作用，而乳酸菌本身耐酸性較好，不會(huì)受到影響)，有效防止了有害菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，從而促進(jìn)乳酸菌活菌數(shù)的增長(zhǎng)。
表5發(fā)酵液不同高度產(chǎn)品密度(25℃，第4天)
經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的效果，兩組效果有顯著性差異(p＜0.05)，在第4天時(shí)選取發(fā)酵液，分別于底部、1/4、2/4、/3/4、頂部5個(gè)高度抽樣，測(cè)定該部位發(fā)酵產(chǎn)品密度。從標(biāo)準(zhǔn)差大小可以明顯看出，實(shí)驗(yàn)組各高度的密度基本相同，其差異來自于測(cè)量誤差，而且符合正態(tài)分布。而對(duì)照組隨高度的升高，密度逐漸下降，趨勢(shì)十分明顯，標(biāo)準(zhǔn)差為1.9×10-3-2.2×10-3，明顯大于實(shí)驗(yàn)組的0.3×10-3-0.4×10-3。可見，由于羧甲基纖維素鈉的加入大大增加了發(fā)酵產(chǎn)物的均一性(王漿酸有很好的殺菌、抑菌作用，本發(fā)明中使用王漿酸可以對(duì)大腸桿菌等雜菌產(chǎn)生抑制作用；而羧甲基纖維素鈉是一種增稠劑，可有效提高產(chǎn)品的均一度，羧甲基纖維素鈉與明膠及果膠可以形成共凝聚物，也可以與膠原形成復(fù)合物，能沉淀某些帶正電的蛋白，海藻酸鈉凝膠小球內(nèi)部為蜂窩狀結(jié)構(gòu)，乳酸菌經(jīng)其部分包埋后，其熱穩(wěn)定性和耐久儲(chǔ)存性明顯提高)，防止了底部菌體密度過大造成營養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)，而使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)均充分利用。
綜上，從表1-表5可以得出，本發(fā)明所得有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基能有效提高液態(tài)乳酸菌中乳酸菌的存活率，能使乳酸菌的性質(zhì)更穩(wěn)定、生物活性更強(qiáng)、儲(chǔ)存更長(zhǎng)久，易于儲(chǔ)存，在使用過程中因含有足夠的活性乳酸菌而充分發(fā)揮其治療及保健作用。本發(fā)明所得有效延長(zhǎng)乳酸菌存活期的培養(yǎng)基對(duì)在保健食品和動(dòng)物添加劑領(lǐng)域的推廣和使用具有重要意義。
最后應(yīng)說明的是，實(shí)施例只是本發(fā)明最優(yōu)的具體實(shí)施方式而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。