本發(fā)明涉及一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

大腸桿菌是一類廣泛存在于自然界并能引起人和動物共同感染的人畜共患病病原，依其致病機制可分為3類：共生型、腸內(nèi)致病型和腸外致病型。大腸桿菌病主要是由病原大腸埃希氏菌引起的一種急性、多形性、腸道型傳染病。在獸醫(yī)臨床上，由于病源性大腸桿菌的血清型、免疫狀態(tài)、生理機能以及豬的日齡等存在差異，常見的豬大腸桿菌病分為3種，即3日齡仔豬黃痢、7～10日齡仔豬白痢和30日齡仔豬水腫病。豬大腸桿菌病在世界各地均有發(fā)生，而仔豬黃、白痢是豬場中最為常見的傳染病，其發(fā)病率、死亡率均居仔豬疫病之首，已給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大危害和嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。大腸桿菌病發(fā)生后多采用抗生素類藥物進(jìn)行治療，但是由于抗生素的廣泛及不合理使用，細(xì)菌耐藥性問題日益嚴(yán)重，特別是多重耐藥性問題更加突出。為防治該病，國內(nèi)外已研制出多種類型的基因工程菌苗和多價滅火菌苗，但由于大腸桿菌的血清型復(fù)雜及各地區(qū)流行菌株的不同，免疫效果尚不甚理想，一般以自制的滅火菌苗效果為佳。

為了解和掌握各地區(qū)大腸桿菌的耐藥程度，并為臨床上有效防治藥物的篩選提供依據(jù)，有必要對采集樣本中致病性大腸桿菌進(jìn)行生化和血清型鑒定。而一般性鑒定程序為：分離培養(yǎng)→挑取可疑菌落→純培養(yǎng)→革蘭氏染色、鏡檢→生化試驗。鑒定步驟為：將病料用生理鹽水稀釋，并接種于普通培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，觀察細(xì)菌生長情況和菌落特征，挑取單菌落接種于麥康凱瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h后，再挑取紅色、中等大小的光滑菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，染色情況、形態(tài)和大小等均符合大腸桿菌特征的菌株初步判定為大腸桿菌，挑取疑似菌株進(jìn)行吲哚試驗、MR試驗、VP試驗、H₂S試驗、三糖鐵試驗和糖發(fā)酵試驗，結(jié)合生化試驗結(jié)果最終判定菌株屬種。但是該方法的鑒定結(jié)果尚不夠準(zhǔn)確，尤其是分離純化操作中菌落形態(tài)模糊，不利于挑取分離。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，該方法采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基分離純化病料菌株，生長出的菌落形態(tài)清晰，便于挑取分離，操作簡便，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，誤差小。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)細(xì)菌分離培養(yǎng)：將采集的樣品接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后取菌液劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，挑取單個或成對的紅色菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況，挑取單個或成對的紫黑色菌落備用；

2)革蘭氏染色、鏡檢；

3)生化鑒定試驗；

步驟1)中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7～8g，牛肉膏2～2.5g，氯化鈉3.5～4g，蒸餾水750mL，pH值7.0～7.4；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨12～18g，牛膽鹽3.5～4g，氯化鈉3.5～4g，瓊脂10～15g，乳糖7～8g，中性紅0.01～0.03g，蒸餾水750mL，pH值7.0～7.4；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7.5～8.5g，乳糖7～8g，磷酸氫二鉀1.2～1.8g，瓊脂15～20g，2％伊紅水溶液12～18mL，0.5％美藍(lán)水溶液10～15mL，蒸餾水750mL，pH值7.2～7.4。

優(yōu)選的，步驟1)中營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化鈉3.8g，蒸餾水750mL，pH值7.2；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨15g，牛膽鹽3.8g，氯化鈉3.8g，瓊脂12g，乳糖7.5g，中性紅0.02g，蒸餾水750mL，pH值7.2；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，瓊脂18g，2％伊紅水溶液15mL，0.5％美藍(lán)水溶液12mL，蒸餾水750mL，pH值7.3。

步驟1)中培養(yǎng)的溫度為36～38℃，培養(yǎng)時間15～20h。優(yōu)選的，于溫度37℃下培養(yǎng)18h。

步驟2)中革蘭氏染色主要包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四步操作。具體操作為：將挑取的菌落涂片固定，先用草酸銨結(jié)晶紫初染，再用碘液媒染，脫色后用復(fù)紅染液復(fù)染。

步驟2)中鏡檢為：用香柏油覆蓋涂菌部位，顯微鏡下觀察染色情況和細(xì)菌形態(tài)，挑取革蘭氏陰性菌待用。

步驟3)中生化鑒定采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管(如腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司)。具體操作見試劑盒說明書。

步驟3)中生化鑒定為大腸桿菌的菌株進(jìn)行菌種保存。具體操作為：將菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后取菌液與滅菌的甘油混合制成甘油菌，于溫度-20℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中豬源大腸桿菌的分離鑒定主要包括細(xì)菌分離培養(yǎng)、革蘭氏染色及鏡檢和生化鑒定試驗三步操作，該方法操作簡單、耗時短，成本低，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。其中細(xì)菌分離培養(yǎng)依次采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，生長出的菌落形態(tài)清晰，便于挑取分離。

附圖說明

圖1為實施例1中菌落形態(tài)圖；

圖2為鏡檢細(xì)菌的形態(tài)圖。

具體實施方式

下述實施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。

實施例1

豬源大腸桿菌的分離鑒定方法，包括以下步驟：

1)采集樣品：從某縣規(guī)?；i場中采集未斷奶、腹瀉仔豬糞便40份樣；

2)細(xì)菌分離培養(yǎng)：將采集的豬糞便樣品分別接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放置于搖床上于37℃、150rpm下培養(yǎng)18h，培養(yǎng)后用無菌接種棒挑取少量的菌液劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察菌落的生長情況，并挑取粉紅色、單個或成對的菌落接種于伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，觀察菌落的生長情況，挑取紫黑色、單個或成對的菌落待用，采集的40份樣品共分離得到17株菌；

上述營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨7.5g，牛肉膏2.3g，氯化鈉3.8g，蒸餾水750mL，pH值7.2；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨15g，牛膽鹽3.8g，氯化鈉3.8g，瓊脂12g，乳糖7.5g，中性紅0.02g，蒸餾水750mL，pH值7.2；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的組成為：蛋白胨8g，乳糖7.5g，磷酸氫二鉀1.5g，瓊脂18g，2％伊紅水溶液15mL，0.5％美藍(lán)水溶液12mL，蒸餾水750mL，pH值7.3；

結(jié)果表明：分離培養(yǎng)的菌落均符合大腸桿菌的菌落形態(tài)(見圖1，圖中A為麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，B為伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上得菌落形態(tài))；

3)革蘭氏染色：將挑取的菌落通過火焰進(jìn)行涂片固定，在玻片上滴加2滴草酸銨結(jié)晶紫溶液，染色1min，用自來水沖洗，再滴加2滴碘液，染色1min，用自來水沖洗，并用吸水紙吸干玻片，連續(xù)滴加95％乙醇溶液脫色，30s后水洗，用吸水紙吸干玻片，最后滴加2滴復(fù)紅染液，復(fù)染1min，用自來水沖洗；

鏡檢：染色后，用香柏油覆蓋涂菌部位，并將玻片置于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡找到菌，再換用高倍物鏡觀察染色情況和細(xì)菌形態(tài)；

染色和鏡檢結(jié)果表明：17株菌均為革蘭氏陰性菌，并且符合大腸桿菌的細(xì)菌形態(tài)(見圖2)，兩端鈍圓、單個或成對，微小短桿狀；

4)生化鑒定試驗：采用腸桿菌科細(xì)菌生化編碼微量鑒定管(購自杭州天和微生物試劑有限公司)對上述17株菌進(jìn)行鑒定，具體操作為：分別取細(xì)菌生化鑒定管用砂輪劃痕從鑒定管中間折斷，鑒定管兩端分別作為空白組和試驗組，用無菌棒挑取單個或成對的疑似大腸桿菌菌落接種于鑒定管試驗組的一端，使菌落與生化鑒定管中的檢測液充分混合均勻，斷口處用封口膠密封；將密封好的鑒定管置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18h后，觀察生化管兩端顏色變化，根據(jù)編碼值檢索腸桿菌科細(xì)菌生化編碼冊(包括葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖、衛(wèi)茅醇、苯丙氨酸、尿素、枸椽酸鹽等測試項目)，判定菌株的種屬特性；

生化鑒定結(jié)果表明：17株菌均符合大腸桿菌的基本生化特性，其中葡萄糖反應(yīng)為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，葡萄糖、鳥氨酸、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖等反應(yīng)結(jié)果均呈陽性，賴氨酸、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、枸櫞酸鹽等反應(yīng)結(jié)果大多呈陰性，判定17株菌為大腸桿菌；

5)菌種保存：用無菌棒挑取單個或成對的大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，放置于搖床上于37℃、150rpm下培養(yǎng)18h；在新鮮菌液中按體積比1:1加入滅菌的甘油(體積分?jǐn)?shù)20％)，混合均勻后得到10％的甘油菌，再置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)試驗驗證，本發(fā)明中分離鑒定方法準(zhǔn)確、可靠，耗時短，分離得到的豬源大腸桿菌不易被污染。

在本發(fā)明的其他實施例中，營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的組成可在各組分取值范圍內(nèi)任意調(diào)整，培養(yǎng)的溫度、時間也可在相應(yīng)范圍內(nèi)任意調(diào)整。