本發(fā)明涉及一種高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)，又稱抗微生物肽，是由細菌特定基因編碼產(chǎn)生的一類小分子多肽，具有廣譜抗菌性。抗菌肽最早是20世紀80年代從惜比古天蠶(Hyatophora cecropia)中發(fā)現(xiàn)的?？咕闹饕飳W作用是其可殺滅包括革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌在內(nèi)的多種細菌，具有抗菌譜廣，殺菌速度快的特點。除了抑制和殺死細菌外，還具有抗真菌、抗病毒、抑制或殺傷腫瘤細胞、殺滅引起瘧疾、利什曼病等疾病的寄生蟲、抗原蟲等作用。抗菌肽通過物理滲透的方式作用于細菌細胞膜，使細胞膜出現(xiàn)孔狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致菌體細胞內(nèi)容物泄露，菌體細胞死亡。抗菌肽獨特的抑菌機制使其成為醫(yī)療、食品、畜牧等領(lǐng)域抗生素有前景的替代物質(zhì)。目前，上千種抗菌肽已經(jīng)從各種動植物體中提取出來，但作為抗生素替代品的抗菌肽卻很少。限制抗菌肽成為抗生素替代物的原因有以下兩個方面：一方面是抗菌肽的毒性，比如對紅細胞造成溶血，或?qū)φｓw細胞具有殺害作用，也就是細胞選擇性低，那么，尋找一種提高抗菌肽細胞選擇性的方法勢在必行。細胞選擇性是抗菌肽對不同細胞的不同選擇性作用，也就是對有害微生物有抑制或殺傷作用，而對正常細胞沒有毒性作用?？咕牡闹委熤笖?shù)是評價其細胞選擇性的關(guān)鍵性指標?？咕牡闹委熤笖?shù)越大，抗菌肽的細胞選擇性就越高，說明該抗菌肽成為抗生素替代品的可行性越大。第二個方面是生產(chǎn)成本問題。目前對于抗菌肽的結(jié)構(gòu)功能研究，主要通過化學合成的方法獲得抗菌肽，氨基酸數(shù)目越多，合成成本越高，所以，細胞選擇性高的抗菌小肽成為人們研究的熱點。

短桿菌肽是由短芽孢桿菌中提取的一類物質(zhì)的總稱，如短桿菌肽A，短桿菌肽B，短桿菌肽C，短桿菌肽D，短桿菌肽S等。短桿菌肽S(Gramicidin S，GS)是Bacillus brevis分泌的由10個氨基酸組成的環(huán)狀肽類抗生素(Val-Orn-Leu-^DPhe-Pro-Val-Orn-Leu-^DPhe-Pro)。短桿菌肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)對其活性是非常重要的，線性化的GS的活性只有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的十分之一。短桿菌肽S是環(huán)形抗菌肽，它具有以下特征：1)一個大的薄片狀的柔性的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；2)同時具有一個極性和非極性的表面；3)若干帶正電荷的側(cè)鏈基團伸出這個平面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明提供一種高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3及其制備方法和應(yīng)用，該抗菌活性較高而細胞毒性相對較低。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3，其序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：如上所述的一種高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3的制備方法包括如下步驟：

1)選用堿性帶正電荷的精氨酸和脂肪族疏水性氨基酸以及芳香族脯氨酸，由肽鍵連接形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，根據(jù)環(huán)形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n，n＝3，設(shè)計獲得環(huán)形抗菌肽OIR3；

2)采用固相化學合成法，然后經(jīng)過反相高效液相色譜純化和質(zhì)譜鑒定后，完成環(huán)形抗菌肽OIR3的制備。

如上所述的一種高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3，在制備治療革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明在短桿菌肽S結(jié)構(gòu)與功能研究基礎(chǔ)上，根據(jù)環(huán)形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n(n＝1、2和3)，全新設(shè)計環(huán)形抗菌肽OIR1(Ile Arg Pro Ile Arg Pro)、OIR2(Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Pro)和OIR3(Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro)。精氨酸是帶正電荷的堿性氨基酸，與細菌細胞膜發(fā)生靜電吸引作用，脂肪族疏水性氨基酸異亮氨酸，可與細菌表明的磷脂發(fā)生疏水性作用，破壞細菌的磷脂膜，從而產(chǎn)生生物學活性。通過本方法制備的抗菌肽的實驗技術(shù)簡單，對得到的抗菌肽進行抗菌和溶血活性檢測，發(fā)現(xiàn)OIR3不但對大腸桿菌、綠膿桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌六種菌種有明顯的抑制作用，而且具有很低的溶血活性。因而，綜合來看，OIR3是一種具有較高應(yīng)用價值的抗菌肽。

附圖說明

圖1為抗菌肽OIR3的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

實施例1

環(huán)形抗菌肽OIR1的氨基酸序列為：

Ile Arg Pro Ile Arg Pro

1 5 6

環(huán)形抗菌肽OIR2的氨基酸序列為：

Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Pro

1 5 10

環(huán)形抗菌肽OIR3的氨基酸序列為：

Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro

1 5 10 14

根據(jù)環(huán)形肽模板(IleArg)nPro(IleArg)n(n＝1、2和3)設(shè)計得到抗菌肽OIR1、OIR2和OIR3。

實施例2

將上述兩個抗菌肽使用多肽合成儀進行合成，方法為固相化學合成法，具體步驟為：

1)抗菌肽的制備從C端到N端逐一進行，通過多肽合成儀來完成。首先將Fmoc-X(X是每個抗菌肽的C端第一個氨基酸)接入到Pro+2cl2樹脂，然后脫去Fmoc基團后得到X-Pro+2cl2樹脂；再將Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y為每個抗菌肽C端第二個氨基酸)；按照這個程序依次從C端合成到N端，直至合成完畢，得到脫去Fmoc基團的側(cè)鏈保護的樹脂；

在上述得到的肽樹脂中，加入切割試劑，20℃避光下反應(yīng)2小時，過濾；沉淀TFA(三氟乙酸)洗滌，將洗液與上述濾液混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再加入10倍左右體積的預(yù)冷DMF(二氯甲烷)溶液，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g離心10min，收集沉淀，再用DMF溶液洗滌沉淀，HBTU(六氟磷酸酯)，NMM(N-甲基嗎琳),反應(yīng)30分鐘，真空干燥，得到多肽，再切割得到環(huán)好的粗品。

使用0.2mol/L硫酸鈉(磷酸調(diào)節(jié)至pH7.5)進行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，過濾，C18反相常壓柱，采用梯度洗脫(洗脫劑為甲醇和硫酸鈉水溶液按照體積比為30:70～70:30混合)，流速為1ml/min，檢測波為220nm，收集主峰，凍干；再利用反相C18柱進一步純化，洗脫液A為0.1％TFA/水溶液；洗脫液B為0.1％TFA/乙腈溶液，洗脫濃度為25％B～40％B，洗脫時間為12min，流速為1ml/min，再同上收集主峰，凍干；

抗菌肽的鑒定：將上述得到的抗菌肽經(jīng)過電噴霧質(zhì)譜法分析，質(zhì)譜圖中顯示的分子量(見附圖)與表一中的理論分子量基本一致，抗菌肽的純度大于95％。

表1抗菌肽的設(shè)計

實施例3

對設(shè)計并合成得到的抗菌肽通過體外抑菌和溶血活性試驗進行比較檢測；

抗菌活性的測定：將肽配置成為一定儲存液以備使用。利用微量肉湯稀釋法測定幾種抗菌肽的最小抑菌濃度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作為稀釋液，使用二倍稀釋法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μl置于96孔細胞培養(yǎng)板中，然后分別添加等體積的待測菌液(～10⁵個/ml)于各孔中。分別設(shè)置陽性對照(含有菌液而不含有抗菌肽)和陰性對照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒溫培養(yǎng)20h，以肉眼未見孔底部有混濁現(xiàn)象的即為最小抑菌濃度。

檢測結(jié)果見表2。通過表2可以看出，OIR3對于革蘭氏陰性和陽性菌表現(xiàn)出較強的抑菌活性。

表2抗菌肽的抑菌和溶血活性

溶血活性的測定：采集人的新鮮血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mlPBS溶液中，1000g離心5min，收集紅細胞；用PBS洗滌3遍，再用10ml PBS重懸；取50μL紅細胞懸液與50μL用PBS溶解的不同濃度的抗菌肽溶液混合均勻，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育1h；l h后取出，4℃、1000g離心5min；取出上清液用酶標儀在570nm處測光吸收值；每組取平均值，并比較分析。其中50μL紅細胞加50μl PBS作為陰性對照；50μL紅細胞加50μl 0.1％Tritonx-100作為陽性對照。最小溶血濃度是抗菌肽引起10％溶血率時的抗菌肽濃度。

檢測結(jié)果見表2。溶血濃度越大，表明溶血活性越?。煌ㄟ^表2可以看出，OIR1、OIR2和OIR3在檢測范圍內(nèi)均沒有溶血活性。

以上結(jié)果顯示，隨著IleArg基本單元的二元疊加，抗菌活性顯著提高，溶血活沒有變化。綜合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通過治療指數(shù)(溶血濃度與抑菌濃度的比值)來更全面的評價各個抗菌肽的細胞選擇性。由表2可以看出，OIR3具有較高的治療指數(shù)，表明設(shè)計得到的OIR3抗菌肽具有較高的替代抗生素的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學

<120>高細胞選擇性的環(huán)形抗菌肽OIR3及其制備方法和應(yīng)用

<160> 1

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ile Arg Ile Arg Ile Arg Pro Ile Arg Ile

1 5 10

Arg Ile Arg Pro

11 14