背景技術：

布魯氏菌病(Brucellosis簡稱為布病)是由布魯氏菌(Brucella)引起的人畜共患傳染病。人感染布病主要來于患病動物及其產品。我國與人類布病有關的傳染源主要是患病羊、牛，但以羊種布魯氏菌危害最為嚴重(朱良全et al.微生物學通報,2015(01):171～177；吳清民.獸醫(yī)導刊,2011(09):46～47)。

血清學方法是當前診斷動物布病的主要方法，而疫苗接種是預防動物布病的重要手段。布病已有的血清學診斷主要基于檢測抗布魯氏菌脂多糖抗體，由于我國現(xiàn)有動物布病疫苗株(S2、A19和M5)與野毒感染株均屬于光滑型菌株，均誘導機體產生抗脂多糖抗體，因而無法通過現(xiàn)有血清學方法區(qū)分疫苗免疫和自然感染(毛開榮,等.動物布魯氏菌病診斷技術.中國農業(yè)出版社，2014.)。

不過，強弱毒布魯氏菌感染宿主后的血清學抗體應答出現(xiàn)明顯差異，為從血清學上篩選區(qū)分自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷抗原提供了一些背景和線索。如已有研究表明，強毒感染布魯氏菌后，7天可檢測到抗體，15天抗體水平達到最高，其凝集抗體滴度達到1：3000，隨后開始下降，60天后抗體水平已經低于7天時的抗體水平，而240天后抗體為陰性(Gao XL.et al Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences,2015,39:271～278)。而布魯氏菌疫苗S2免疫綿羊后，2周后開始檢測到抗體，第30天抗體水平達到最高，其滴度為1：120，隨后開始下降，至180天后抗體為陰性。上述顯示的免疫與自然感染血清之間的差異信息為鑒別診斷點的篩選開辟了新思路。

據報道，膜蛋白占據病原微生物總蛋白質的大約30％～40％，不僅是治療藥物和疫苗開發(fā)的主要靶點所在，而且含有保護性抗原成分，因而成為布魯氏菌診斷抗原和藥物治療靶點研究的重點對象(胡劍飛，等.疾病監(jiān)測,2010(05):380～389；吳朔,等.免疫學雜志,2008(04):385～388)。由于免疫蛋白組學方法可顯示蛋白血清學反應差異信息，并可運用生物信息學技術作為高通量篩選的技術平臺，從膜蛋白中獲取大量可能的鑒別診斷抗原信息，從而破解疫苗免疫與自然感染的難題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有血清學方法無法區(qū)分布魯氏菌疫苗免疫抗體和自然感染抗體難題，提供具有鑒別診斷價值的布魯氏菌基因表達產物，運用免疫學方法，從而實現(xiàn)疫苗免疫抗體及自然感染抗體的鑒別診斷。

本發(fā)明技術方案

1.一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2，其特征在于：該產物是由布魯氏菌S2株基因編號(GI)為490823642的基因，表達為“糖苷水解酶家族43(glycoside hydrolase family 43)”；該基因長度：1068bp；其表達產物的蛋白分子量約37.5kDa，其基因序列為基因序列1。

2.本發(fā)明所述的一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟：

(1)基因篩選：從布魯氏菌S2株基因組中，通過免疫蛋白組學方法，篩選鑒定出上述權利1的基因；

(2)基因表達：通過設計的引物(序列2和序列3)，經過常規(guī)PCR克隆擴增，將其置于pGEX6p-1載體中誘導表達；

(3)表達產物純化：通過谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱與谷胱甘肽梯度洗脫法純化表達產物，獲得所需抗原，被命名為BLSJ-2。

3.本發(fā)明所述的一種布魯氏菌診斷標識作用基因的表達產物BLSJ-2的應用，其特征在于將該基因PCR克隆擴增，其表達產物作為抗原。該抗原可作為區(qū)分動物布魯氏菌疫苗免疫和自然感染血清檢測抗原。

本發(fā)明的詳細描述

1.鑒別診斷標識基因的篩選

(1)采用免疫蛋白組學技術，選擇我國應用最廣泛的布魯氏菌疫苗株S2和我國布病影響嚴重的羊血清為研究對象，從S2株膜蛋白中篩選出鑒別診斷抗原基因信息。

(2)各用30份布病陰性健康羊(Nm)、30份S2免疫羊(Sm)，以及30份臨床布病感染羊陽性混合血清(Zm)，分別與S2株膜蛋白二維電泳膠(2DE)進行免疫印跡(Western-blot)，尋找S2膜蛋白與不同狀態(tài)(感染/免疫/陰性)綿羊血清反應差異點，共尋找到113個差異蛋白點。選擇免疫反應差異較大的30個蛋白點進行基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜鑒定及生物信息學分析，共鑒定出14個蛋白。

(3)將3種混合血清(感染/免疫/陰性)分別與S2膜蛋白進行免疫共沉淀(IP)，并對IP結合物進行高通量質譜鑒定(Q-Exactive質譜儀)及生物學信息分析，獲得182個候選蛋白點。對2種方法鑒定出的所有蛋白進行功能分析，共挑選出8個體外鑒別診斷的候選靶點。

(4)構建8個候選靶蛋白原核表達質粒，將表達蛋白分別與3種混合血清進行免疫印跡(Western-blot)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，篩選到一個具有鑒別診斷效果的基因(糖苷水解酶家族43，glycoside hydrolase family 43)鑒別診斷效果明顯。

2.基因產物的表達

(1)培養(yǎng)繁殖布魯氏菌S2株，提取其基因組。

(2)以序列2和序列3分別為上下游引物，按常規(guī)PCR方法進行基因擴增，

上游引物EcoRI:GAATTC為5’-aaGAATTCat gggtttcagc cgcaaac-3’27(序列2)；

下游引物XhoI:CTCGAG為5’-atCTCGAGtc attttacggt ttccgcaag-3’29(序列3)。

(3)基因擴增條帶，經在1％瓊脂糖凝膠電泳中檢測片段與預期的大小一致，并將獲得的重組質粒送公司測序與美國國家生物技術信息中心(NCBI)上公布的基因序列進行比對，符合率為100％。

(4)篩選到的陽性重組質粒轉化到商品化的E.coLi BL21(DE3)感受態(tài)細胞后，用1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，然后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，其重組蛋白分子量大小分別與理論大小基本一致。

3.表達產物的純化

(1)誘導表達的蛋白，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定為包涵體。

(2)將該包涵體經梯度脲素(4.5M、3.5M、2.5M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M)的透析復性緩沖液于4℃，按常規(guī)方法進行梯度透析復性。

(3)運用谷胱甘肽S轉移酶(GST)融合蛋白純化柱按其說明書方法進行純化。

4.表達產物作為診斷抗原的應用

將目的蛋白(糖苷水解酶家族43，glycoside hydrolase family 43)用谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱純化后獲得的產物命名為BLSJ-2，作為酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)包被抗原，對30份感染血清及656份免疫羊場血清樣品進行檢測，其建立的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)對感染樣本檢出率為87％。

附圖說明

圖1 S2膜蛋白雙相電泳及與不同免疫狀態(tài)綿羊血清的免疫印跡(Western-blot)結果圖中：圖A為S2膜蛋白雙相電泳結果，圖B-D依次為膜蛋白分別與布病陰性健康綿羊混合血清(Nm)、S2免疫綿羊混合血清(Sm)、自然感染綿羊混合血清(Zm)的免疫印跡(Western-blot)結果。圖E為圖B-D所有點疊加分析結果。

圖2 S2膜蛋白免疫共沉淀結果1為陰性血清(Nm)的IP混合物；2為S2免疫血清的IP混合物(Sm)；3為自然感染血清(Zm)的IP混合物。

圖3 豬布魯氏菌S2株抗原基因PCR擴增結果圖中注：泳道M：Marker。泳道1-8為編號1-8的基因。

圖4 8種重組蛋白誘導表達圖譜圖中：M，蛋白質分子量標準(Protein molecular weight marker)；1-8，為1-8#候選蛋白；U，未誘導菌體蛋白；W，誘導全菌蛋白；S，上清；P，沉淀

圖5 6種重組候選蛋白分別與三種血清的免疫印跡(Western-blot)

圖6 3#重組純化蛋白BLSJ-2(糖苷水解酶家族43，glycoside hydrolase family 43)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果圖中：M：蛋白質分子量標準；3，3#候選蛋白；P，沉淀；Pu，純化的蛋白。

本發(fā)明涉及生物材料資源信息

本發(fā)明中涉及的微生物資源是豬種布魯氏菌弱毒株S2株(CVCC70502株)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(請見請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄(第二版)，中國農業(yè)科學技術出版社，2002年，p145)。

本發(fā)明的積極效果

本發(fā)明涉及一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ-2及其制備方法。目的是針對現(xiàn)有血清學方法無法區(qū)分布魯氏菌疫苗免疫抗體和自然感染抗體難題，提供具有鑒別診斷價值的布魯氏菌基因表達產物，運用免疫學方法，從而實現(xiàn)疫苗免疫抗體及自然感染抗體的鑒別診斷。

實施例

以下實施例為更好的說明本發(fā)明，不對本發(fā)明構成限制。

實施例1

——鑒別診斷抗原蛋白點的篩選研究

采用免疫蛋白組學方法從S2株膜蛋白中篩選鑒別診斷抗原。各用30份布病陰性健康羊、30份S2免疫羊，以及30份臨床布病感染羊陽性混合血清，分別與S2株膜蛋白二維電泳膠(2D)進行免疫印跡(Western-blot)，尋找S2膜蛋白與不同布病狀態(tài)(感染/免疫/陰性)綿羊血清反應差異，共尋找到113個差異蛋白點。選擇免疫反應差異較大的30個蛋白點進行基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜鑒定及生物信息學分析，共鑒定出14個蛋白，這些蛋白承擔13類分子功能、參與組成6類細胞組分和13類生物學過程。將3種混合血清(感染/免疫/陰性)分別與S2膜蛋白進行免疫沉淀(IP)，并對結合物進行高通量質譜(Q-Exactive)鑒定，獲得182個候選蛋白點，這些蛋白行使129類分子功能、參與組成91類細胞組分和137類生物學過程。對2種方法鑒定出的所有蛋白進行功能分析，共挑選出8個體外鑒別診斷的候選靶點(編號1#-8#)。

構建8個候選靶蛋白原核表達質粒，除1#(轉運蛋白/transporter)與5#(細胞分裂蛋白FtsH/cell division protein FtsH)外，6個蛋白成功表達。將表達蛋白分別與3種混合血清進行免疫印跡(Western-blot)和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測，篩選出3#(糖苷水解酶家族43，glycoside hydrolase family 43)鑒別診斷效果明顯。

1.布魯氏菌S2株菌液制備、膜蛋白提取及定量

布魯氏菌S2株種子液制備參考《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》((農業(yè)部獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程(二〇〇〇版).北京:化學工業(yè)出版社,2000，本發(fā)明以下簡稱《規(guī)程》)方法進行，膜蛋白提取參照曲勍等推薦方法進行(曲勍,等.吉林大學學報(醫(yī)學版),2009(05):805～811)。膜蛋白濃度定量，按照考馬斯亮藍(Bradford)蛋白定量(Thermo Pierce貨號：23236蛋白定量試劑盒)方法進行。

2.S2株膜蛋白雙相電泳和免疫印跡(western-blot)結果

2個不同批次實驗之間的凝膠蛋白點匹配率達80％以上。在預實驗中首先采用固定化pH 3～10梯度的膠條進行一向分離,發(fā)現(xiàn)蛋白都主要集中位于pH 4～7。因此,選用了固定化pH 4～7梯度的膠條進行一向分離,用12.5％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行雙向電泳(圖1A)，用不同血清孵育的免疫印跡(Western-blot)(圖1B-1D)。電泳圖掃描成圖之后通過PDquest8.0軟件,將不同血清孵育的免疫印跡(Western-blot)曝光的圖比對,以確定免疫反應蛋白的差異。根據圖1E結果,結合PDquest 8.0軟件分析結果，總共能分辨出262個蛋白差異點。選取30個灰度值差異明顯的蛋白點，經膠內酶切及質譜鑒定。

3.雙相電泳(2DE)及基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜分析鑒定數據列表

該30個點中所反應的灰度值列表(表1)如下。Nm為膜蛋白與正常綿羊血清免疫反應的灰度值，Sm為膜蛋白與免疫綿羊血清反應的灰度值，Zm為膜蛋白與自然感染綿羊血清的灰度值。比值為免疫與自然感染之間灰度值的比值。

表1 30個蛋白點與3種不同血清反應的灰度值差異信息列表

/:無數據.

4.基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜鑒定結果

結果顯示，共鑒定到29個點，其中有9個點(其中涉及轉錄調控活性3個，DNA復制3個，胞質大核糖體亞基1個，沒有功能的2個)，因C.I.值低于90而不可信。20個點處于可信區(qū)，其按生物信息學本體分可分為3類，分子功能(Molecular Function)7個點，細胞組分(Cellular Component)3個點，生物學過程(Biological Process)12個點。其中有2個點涉及的氧化還原酶活力的功能既可歸為分子功能又可歸為生物學過程分類中。

5.免疫共沉淀結果

根據蛋白A/G磁珠(protein A/G beads)能與IgG抗體F_C段進行非特異性共價結合的特性，將3種不同混合血清抗體分別結合到蛋白A/G磁珠(protein A/G beads)中，然后再將上述混合物與S2膜蛋白結合，根據抗原抗體反應原理，3種不同血清分別與膜蛋白結合形成混合物，其電泳圖見圖2。

6.免疫沉淀獲得質譜點信息及經生物信息學功能分析獲得的可能診斷靶點信息

通過天然抗體與非變性抗原進行免疫學反應，其捕捉的點較多，共284個點。比較所鑒定的蛋白點在不同血清免疫沉淀(IP)混合物中的豐度，其中54個蛋白點與陰性血清(Nm)存在非特異性反應。在剩余230個與陰性血清不存在非特異性反應的蛋白點中，有50個蛋白點僅與S2免疫血清(Sm)反應；有63個蛋白點僅與自然感染血清(Zm)反應；與免疫及自然感染血清均有反應的蛋白點117個，其中S2血清和自然感染血清IP混合物中的豐度之比(Sm/Zm)>1.5的蛋白點有12個，Sm/Zm<0.67的蛋白點有57個?？梢姽茶b定到可能的鑒別診斷抗原蛋白182個。

通過Uniprot基因本體(Gene Ontology)數據庫的檢索，免疫沉淀/高通量質譜(IP/QE)鑒定的182個可能的鑒別診斷抗原蛋白，按其生物信息學的基因本體(Gene Ontology)分可分為3類?？梢?，182個蛋白行使129類不同的分子功能(Molecular Function)，參與組成91類細胞組分(Cellular Component)，參與137種不同生物學過程(Biological Process)。經功能及定位信息分析獲得的可能診斷靶點信息列表見表2。

表2經過免疫沉淀/高通量質譜(IP/QE)分析的可能診斷靶點信息列表

*,通過與豬布魯氏菌S2進行序列比對獲得。

篩選出8個蛋白，其功能可能與布魯氏菌的免疫原性、毒力、布魯氏菌與宿主相互作用、細胞外膜蛋白轉運有關(見表2)。由此選擇這8個蛋白，作為可能的鑒別診斷靶點進行進一步驗證。

根據二維電泳/免疫印跡/基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜和免疫沉淀/高通量質譜分別獲得的可能的鑒別診斷抗原蛋白，初步確定8個蛋白點有望成為體外診斷的靶點，其中二維電泳/免疫印跡/基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜途徑獲得1個點，為轉運蛋白；免疫沉淀/高通量質譜途徑獲8個點，分別為轉運蛋白、膜蛋白(肽聚糖相關脂蛋白)、HlyD家族分泌蛋白(HlyD family secretion protein)、膜蛋白(26kDa周質腔免疫蛋白)、細胞分裂蛋白FtsH、細胞膜生物合成蛋白OmpA、假想蛋白(脂蛋白)、凝集素。其中免疫沉淀/高通量質譜所獲得的兩個點與二維電泳/免疫印跡/基質輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-TOF)質譜所獲得的一個點重復，即轉運蛋白。

實施例2

——鑒別診斷抗原蛋白點基因信息的確定

將2種方法獲得的候選蛋白點，與美國國家生物技術信息中心(NCBI)網站公布的S2基因組信息中表達蛋白進行比對，獲得各候選蛋白點對應基因信息見表3(含基因名稱信息、基因編號、基因長度、蛋白分子量等)，隨后分別設計引物運用PCR進行基因克隆，獲得原核表達產物(表3、圖3、圖4)，分別與布魯氏菌免疫血清和布魯氏菌自然感染血清用免疫印跡(Western-blot)及間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)驗證其鑒別診斷價值(圖5、表4)。

1. 8個候選的鑒別診斷抗原(表3)，分別編號#1-#8，后文表述中均以蛋白編號代替詳細蛋白名稱。

表3 8個候選基因靶點的詳細信息及上下游引物

2.PCR擴增和原核表達

以S2基因組DNA為模板，獲得擴增的8個基因的PCR產物。圖3電泳結果表明8個基因均出現(xiàn)特異性擴增條帶，目的片段與預期的大小一致，獲得的重組質粒送公司測序后與美國國家生物技術信息中心(NCBI上提供的各自基因序列進行比對，符合率為100％，其插入的方向均正確，可以用于進一步的)誘導表達。

篩選到的陽性重組質粒轉化到E.coLi BL21(DE3)感受態(tài)細胞后，用1mM IPTG誘導表達，所收集的菌體經超聲破碎后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，結果發(fā)現(xiàn)1#和5#候選蛋白不表達，其余6個重組蛋白都均以包涵體形式表達。各重組蛋白分子量大小分別與理論大小基本一致(圖4)。

3.重組蛋白與三種血清的免疫印跡(Western-blot)

將除了1#和5#之外的6種重組蛋白，將離心分離的含有6種重組蛋白的沉淀(P)分別與布病陰性混合血清(N_m)、S2免疫混合血清(S_m)和自然感染混合血清(Z_m)進行Western-blot(圖5)，發(fā)現(xiàn)其中3#候選蛋白與免疫血清和自然感染血清的反應強度存在較強差異。

4.重組蛋白與三種血清的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)反應

除了采用免疫印跡(Western-blot)檢測候選蛋白與三種血清的免疫反應性之外，還采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法進一步進行驗證。

表4不同包被的抗原蛋白血清樣品檢測結果

從表4看出，將除了1#和5#之外的6種蛋白，即離心分離的含有6種重組蛋白的沉淀(P)用6M尿素溶解懸浮，用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至1μg/mL，進行間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測發(fā)現(xiàn)3#在S2免疫與布病陰性血清反應OD_450nm基本一致，而與自然感染血清差異明顯，表明3#蛋白具有具有鑒別診斷效果。因此篩選出具有區(qū)分免疫與自然感染血清起到鑒別診斷基因標識信息見表5。

表5篩選出的鑒別診斷標識基因的詳細信息表

實施例3

——3#(糖苷水解酶家族43，glycoside hydrolase family 43)鑒別診斷效果驗證

1.利用谷胱甘肽S轉移酶(GST)親和層析柱與谷胱甘肽梯度洗脫法純化重組蛋白8#，得到純度90％以上的純化目的蛋白(圖6)。

2.純化的3#重組蛋白布病抗體酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測結果

將純化的3#重組蛋白以常規(guī)條件：任選3種單份陰性/免疫/感染血清及1份陰性/免疫/感染血清混合血清，分別用pH9.6的碳酸鹽緩沖液將純化的重組蛋白抗原稀釋至100ng/mL，4℃包被過夜，10％脫脂奶作為封閉液封閉2h，將血清用PBS作1∶50稀釋，用磷酸鹽緩沖液(PBS)對酶標二抗進行1∶5000稀釋，其他步驟同常規(guī)程序，然后進行OD_450nm檢測。檢測結果見表6

表6 3#重組蛋白對不同血清的酶聯(lián)免疫吸附測定結果

從表6看出，3#重組蛋白(即為BLSJ-2)在免疫與感染之間的反應確實有明顯的差異。而且陰性及S2免疫血清之間的反應值較低，自然感染反應的值較高。

實施例4

——間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法的建立及臨床血清樣本檢測

1.反應條件的優(yōu)化

(1)包被液、包被抗原濃度及血清稀釋度優(yōu)化結果

將3#重組純化蛋白為抗原，將其包被液設置為中性的PBS，堿性碳酸鹽緩沖液，酸性的檸檬酸緩沖液?？乖瓭舛仍O置為20ng/mL，100ng/mL，500ng/mL等3個稀釋度，血清濃度設置為1∶50，1∶100和1∶200。通過棋盤試驗進行篩選，以背景值最低，而且感染/免疫比值最大，確定為最適濃度。純化的3#重組蛋白抗原其抗原包被液、抗原包被濃度及血清稀釋度條件優(yōu)化結果見表7。

表7 3#抗原蛋白包被液、抗原濃度以及抗體稀釋度篩選結果

從表7看出，3#蛋白適合包被液為碳酸鹽緩沖液；最適抗原包被濃度均為100ng/mL，血清稀釋度均為為1∶50。

(2)封閉液及酶標二抗稀釋度優(yōu)化結果

根據上述結果，進一步對封閉液及酶標二抗?jié)舛冗M行優(yōu)化，分別設置牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶及魚明膠作為封閉液，將酶標二抗分別作1∶10000及1∶20000稀釋，通過棋盤試驗進行篩選，以背景值最低，而且感染/免疫比值最大，確定為最適濃度。其具體結果見表8。

表8不同封閉液、酶標二抗?jié)舛群Y選結果

從表8看出，3#蛋白(BLSJ-2)最適封閉液為10％脫脂奶，其最適酶標二抗?jié)舛确謩e為1∶10000。

(3)反應時間及顯色時間的優(yōu)化分別見表9和表10。

將反應時間設置為0.5h和1h進行比較，另將顯色15min，20min和30min進行比較，選擇Zm/Sm較大值，作為最適參數。

表9反應時間優(yōu)化

表10顯色時間優(yōu)化

從表9和表10看出，3#重組蛋白酶聯(lián)免疫吸附測定反應0.5h與反應1h基本一致，另0.5h反應其Zm/Sm略高；3#重組蛋白顯色30min，其效果好于15min及20min。

(4)鑒別診斷抗原間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法檢測免疫血清的臨界值(Cut-off)

運用3#重組蛋白作為抗原建立的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法，分別檢測30份S2免疫血清，計算其平均值及方差。

表11 3#重組抗原建立的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法

2.在臨床羊場血清中的應用

運用已建立的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法對30份用于免疫蛋白組學已知臨床感染單份樣本檢測及來自免疫的4個羊場656份樣本進行檢測。結果見表12。

表12臨床檢測血清樣本

注：分母為檢測樣品數量；分子為判斷陽性樣品數量。對于鑒別診斷純化抗原判為陽性，即為臨床感染樣品；對于抗脂多糖的間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法判為陽性，即為免疫或自然感染血清。

從表12看出，3#重組蛋白檢出已知感染的30份血清的檢出率達到86.7％。

序列表

　　<110> 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所

　　<120> 一種布魯氏菌診斷標識作用的基因表達產物BLSJ-2及其制備方法

　　<130>

　　<160> 17

　　<170> Patentin version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 1068

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：布魯氏菌S2株（GI）490823642的基因

　　<400> 1

atgggtttca gccgcaaaca atggatcgtt gcaggcgcaa ttgtcgttct cgctgcgggc 60

ggctattatg ccttgcaggc gatgaatggc agcgggctgc cggacgggat tgccagcggc 120

aatggccgcg tcgaggcggt tgaaatcgat atttccacga aaagccccgg ccgcatccgt 180

gaaatttttg caaatgaagg cagtttcgtc aaagcgggcg atgttctggc ccgcatggac 240

acggaccagc ttgaaagcca gtaccggcag gcgaaggcac aattgcgccg ggcggaaatc 300

ggtatcgata cggcacaaag ccttgtgacg cagcggcagg cagaacatgc ggcggccgaa 360

gcgaccgttg cccagcggga agcccagctt gatgcagcac agcgccgtct ggcccgttcc 420

cggcaattgt cggaatcgcg gactgtctcg cagcaggttc tggatgacga tcgcgcaacc 480

gcgcaaggcg cggaagccgc cgtcggtgcg gccaaggcgc agcttgcagc aacggacgcg 540

gccataggtg ccgccaaggc gcaggttgtg gatgcgcaag cctctgtcga agctgccaag 600

gccgctattg ccgccattga ggcggatttg agggacgcaa ccttgaccgc gcccaagccg 660

ggccgtgtgc aatatcgtgt ggcacagccc ggcgaagtgc tttcagcagg cgggcgcgtg 720

cttaatctgg tggacctcag cgatgtttcc atgaccttct tcctgcccac ggcgcaggcg 780

gggcgcgtgg caatcggagc cgatgcccgc atcgttctcg atgctgcgcc gcaatatgtc 840

atcccggcca aggtcagctt cgtggccgat gtcgcccagt tcacgccgaa aacggtcgag 900

agcgaggaag agcgccagaa gctgatgttc cgcgtcaagg caaagattcc gcagatcctt 960

ttacagaaat atattcagca ggtgaaaacc ggcttgcccg gcgttgccta tgtcaagctt 1020

gcccctgatg ccggatggcc gaagaacctt gcggaaaccg taaaatga 1068

　　<210> 2

　　<211> 27

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增（GI）490823642基因的上游引物EcoRI GAATTC

　　<400> 2

　　aaGAATTCat gggtttcagc cgcaaac 27（序列2）

　　<210> 3

　　<211> 29

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增（GI）490823642基因的下游引物XhoI: CTCGAG

　　<400> 3

　　atCTCGAGtc attttacggt ttccgcaag 29（序列3）

　　<210> 4

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489056667基因的上游BamHI：GGATCC

　　<400> 4

　　ggGGATCCat gaggtacacg gtgttcaaag 30（序列4）

　　<210> 5

　　<211> 29

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489056667基因的下游引物XhoI：CTCGAG

　　<400> 5

　　aaaCTCGAGt cagcggccat caggcgtac 29（序列5）

　　<210> 6

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489056820基因的上游引物EcoRI: GAATTC

　　<400> 6

　　ttGAATTCat gcgccgtatc cagtcgattg 30（序列6）

　　<210> 7

　　<211> 28

　　<212> DNA

　　<213>人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489056820基因的下游引物XhoI: CTCGAG

　　<400> 7

　　tttCTCGAGt taccgtccgg ccccgttg 28（序列7）

　　<210> 8

　　<211> 34

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489054409基因的上游引物EcoRI: GAATTC

　　<400> 8

　　aatGAATTCa tgaacactcg tgctagcaat tttc 34（序列8）

　　<210> 9

　　<211> 34

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489054409基因的下游引物XhoI: CTCGAG

　　<400> 9

　　cctCTCGAGt tacttgattt caaaaacgac attg 34（序列9）

　　<210> 10

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增490822055基因的上游引物SalI: GTCGAC

　　<400> 10

　　gggGTCGACa tgaatccgaa ctatcgcaac 30（序列10）

　　<210> 11

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增490822055基因的下游引物NotI：GCGGCCGC

　　<400> 11

　　tttGCGGCCG Cttattgcgg ctgcggtttc 30（序列11）

　　<210> 12

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：引物擴增490824872基因的上游引物EcoRI: GAATTC

　　<400> 12

　　ggGAATTCat gctgaagaaa accggtattg 30（序列12）

　　<210> 13

　　<211> 26

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增490824872基因的下游引物下游XhoI: CTCGAG

　　<400> 13

　　tttCTCGAGt caggctccgc gtagcg 26（序列13）

　　<210> 14

　　<211> 28

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489053693基因的上游引物EcoRI: GAATTC

　　<400> 14

　　gaaGAATTCa tgcggaaaat ggcgcttg 28（序列14）

　　<210> 15

　　<211> 32

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489053693基因的下游引物XhoI: CTCGAG

　　<400> 15

　　tttCTCGAGc tatcggcggc agcgtgctcg ag 32（序列15）

　　<210> 16

　　<211> 31

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489055761基因的上游引物EcoRI: GAATTC

　　<400> 16

　　ccGAATTCat gaacagcttc aggaaaactt g 31（序列16）

　　<210> 17

　　<211> 30

　　<212> DNA

　　<213> 人工序列

　　<223> 對人工序列的描述：擴增489055761基因的下游引物XhoI: CTCGAG

　　<400> 17

　　ccgCTCGAGt ttaacgagaa taaggcgaac 30（序列17）