本發(fā)明屬于蘋果育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蘋果炭疽菌葉枯病(Glomerella Leaf Spot，GLS)是一種流行性很強的真菌病害，短時間內(nèi)即可造成大量葉片干枯脫落，嚴(yán)重時造成二次開花，也侵染果實引起壞死性斑點(Leite et al.1988；González&Sutton,1999；González,2003；wang et al.2012；宋清等2012)。對該病進行有效藥物防治較為困難。培育抗病品種是解決該問題的有效途徑。由于蘋果雜種樹有較長的童期，導(dǎo)致傳統(tǒng)育種周期很長。因此利用DNA分子標(biāo)記進行早期選擇對提高篩選效率和育種效率有著極其重要的意義。

先前的研究結(jié)果表明，蘋果對炭疽菌葉枯病的抗性是由隱性單基因控制的(Dantas et al.2009；劉源霞等，2015)。本課題組利用11個SSR標(biāo)記構(gòu)建了蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點的遺傳連鎖圖譜，將其定位于蘋果第15條染色體上，位于標(biāo)記SSR0304673和SSR0405127之間，遺傳距離為1.3cM，物理距離為500kb。

大量存在于基因組DNA序列的SNP和InDel標(biāo)記，已被廣泛應(yīng)用于圖位克隆、基因定位、動植物遺傳多樣性的鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域(Jander et al.2002；Schnabel et al.2005；王巖等,2009；王明軍等，2010)。隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，利用全基因組重測序(whole genome re-sequencing,WGR)技術(shù)結(jié)合混合分組分析法(bulked segregant analysis,BSA)可高效檢測出通過雙親雜交建立的后代群體中導(dǎo)致表型變異的QTL和突變位點(Abe et al.2012；Takagi et al.2013)，并且可以識別大量的SNP和InDel位點,從而進行SNP及InDel標(biāo)記的開發(fā)，獲得基因區(qū)SNP及InDel標(biāo)記，為后續(xù)遺傳圖譜的構(gòu)建及基因定位奠定基礎(chǔ)。

分子標(biāo)記輔助選擇育種(marker assisted selection，MAS)作為一種高效的現(xiàn)代分子育種技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于作物遺傳改良和品種選育。它是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，來鑒定不同個體的基因型，從而進行輔助選擇育種。與通過表現(xiàn)型間接對基因型進行選擇的傳統(tǒng)育種方法相比，MAS育種能有效結(jié)合基因型與表型鑒定結(jié)果，避免選育過程中的盲目性和不可預(yù)測性，從而顯著提高選擇的準(zhǔn)確性和育種效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用全基因組重測序技術(shù)與BSA分析相結(jié)合的方法獲得的SNP及InDel位點，開發(fā)SNP及InDel引物，并通過HRM技術(shù)進行篩選與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點緊密連鎖的SNP和InDel標(biāo)記，進一步縮小抗病基因位點的區(qū)域范圍，為基因克隆提供有價值的遺傳信息。技術(shù)方案如下：

首先本發(fā)明提出一種與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記，包括6個SNP標(biāo)記以及5個InDel標(biāo)記，分別為SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336，SNP4432，InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305及InDel4334；用于擴增上述標(biāo)記的引物分別為：

SNP3955-R和SNP3955-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.1、2所示；

SNP4236-R和SNP4236-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.3、4所示；

SNP4257-R和SNP4257-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.5、6所示；

SNP4299-R和SNP4299-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.7、8所示；

SNP4336-R和SNP4336-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.9、10所示；

SNP4432-R和SNP4432-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.11、12所示；

InDel4199-R和InDel4199-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.13、14所示；

InDel4227-R和InDel4227-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.15、16所示；

InDel4254-R和InDel4254-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.17、18所示；

InDel4305-R和InDel4305-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.19、20所示；

InDel4334-R和InDel4334-F核苷酸序列分別如SEQ ID No.21、22所示。

優(yōu)選的，所述SNP標(biāo)記SNP4236，InDel標(biāo)記InDel4227以及InDel4254與R_gls基因位點共分離。

優(yōu)選的，SNP標(biāo)記SNP4236，InDel標(biāo)記InDel 4254和InDel4227可應(yīng)用于田間栽培品種、品系、種質(zhì)資源以及雜種后代幼苗對炭疽菌葉枯病抗性的鑒定。

優(yōu)選的，SNP標(biāo)記SNP4236和InDel標(biāo)記InDel4254鑒定抗病感病的準(zhǔn)確率分別為98.0％，96.0％。

本發(fā)明還提出一種與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記的篩選方法，包括如下步驟：

S1，通過全基因組重測序以及結(jié)合R_gls基因初步定位結(jié)果，篩選出位于R_gls基因兩側(cè)的SNP和InDel標(biāo)記位點，并設(shè)計出SNP引物和InDel引物；

S2，利用BSA法及HRM技術(shù)分析對設(shè)計的引物進行篩選驗證，從而篩選出與R_gls基因位點連鎖的6個SNP標(biāo)記及5個InDel標(biāo)記，即權(quán)利要求1中所述的SNP標(biāo)記SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel標(biāo)記InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。

此外，本發(fā)明還提出利用分子標(biāo)記精細定位R_gls基因位點的方法，包括如下步驟：

S1，通過全基因組重測序以及結(jié)合R_gls基因初步定位結(jié)果，篩選出位于R_gls基因兩側(cè)的SNP和InDel標(biāo)記位點，并設(shè)計出SNP引物和InDel引物；

S2，利用BSA法及HRM技術(shù)分析對設(shè)計的引物進行篩選驗證，從而篩選出與R_gls基因位點連鎖的6個SNP標(biāo)記及5個InDel標(biāo)記，即權(quán)利要求1中所述的SNP標(biāo)記SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432以及InDel標(biāo)記InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4305和InDel4334。

S3，利用SNP標(biāo)記SNP3955，SNP4236，SNP4257，SNP4299，SNP4336和SNP4432，以及InDel標(biāo)記InDel4199，InDel4227，InDel4254，InDel4334對重組個體的基因型和抗病表型進行分析，將基因R_gls位點定位于InDel4199和SNP4257之間，物理距離為58kb。

此外，本發(fā)明還提出一種上述分子標(biāo)記在蘋果抗炭疽菌葉枯病分子育種的應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點為：

1.首先，本發(fā)明利用全基因組重測序技術(shù)開發(fā)出的SNP及InDel標(biāo)記，結(jié)合R_gls基因初步定位結(jié)果，選出在R_gls基因兩側(cè)的SNP和InDel標(biāo)記，通過HRM曲線分析技術(shù)對18個SNP位點和30個InDel位點進行了分析，篩選出6個SNP及5個InDel標(biāo)記與R_gls基因位點緊密連鎖。

2.本發(fā)明利用篩選出的6個SNP標(biāo)記和5個InDel標(biāo)記對R_gls基因位點進行了精細定位，將R_gls基因位點定位于InDel4199和SNP4257之間，物理距離由500kb縮小為58kb。

3.此外，本發(fā)明篩選出的標(biāo)記InDel4227、SNP4236和InDel4254表現(xiàn)出與R_gls基因位點共分離，兩個共分離標(biāo)記SNP標(biāo)記SNP4236和InDel標(biāo)記InDel4254鑒定抗病感病的準(zhǔn)確率分別為98.0％，96.0％，可以應(yīng)用于田間栽培品種、品系、種質(zhì)資源以及雜種后代幼苗對炭疽菌葉枯病抗性的鑒定。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作一簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為SNP3955標(biāo)記在F₁群體上的PCR擴增的HRM圖；

圖2為SNP4236標(biāo)記在F₁群體上的PCR擴增的HRM圖；

圖3為SNP4257標(biāo)記在F₁群體上的PCR擴增的HRM圖；

圖4為SNP4432標(biāo)記在F₁群體上的PCR擴增的HRM圖；

圖5為InDel4305標(biāo)記在F₁群體上的PCR擴增的HRM圖；

圖6為抗炭疽菌葉枯病基因R_gls位點的精細定位，R_gls基因位點被重組個體限定在標(biāo)記InDel4199和SNP4257之間。

圖7為室內(nèi)接種4d后部分品種(系)對炭疽菌葉枯病的抗性表現(xiàn)；

圖8為SNP4236標(biāo)記在不同品種(系)中擴增的HRM圖；

圖9為InDel4254標(biāo)記在不同品種(系)中擴增的HRM圖。

具體實施方式

1材料與方法

1.1基因組DNA的提取與抗感DNA池的構(gòu)建

以2009年定植于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果試驗基地(山東省膠州市)的207株‘金冠’ב富士’的F₁雜交群體和50個田間栽培品種和品系(50個田間栽培品種和品系列于表2)做為試材。經(jīng)過人工離體接種鑒定，雜交群體中抗病植株為93株，感病植株為114株。品種(系)中抗病植株為33株，感病植株為17株。

每個單株取嫩葉0.2g，液氮速凍，-70℃保存。參考Doyle and Doyle(1987)及Cullings(1992)提取基因組DNA的CTAB法，并加以改進。利用NanoDrop 2000分光光度計測定DNA的純度和濃度，并將濃度稀釋到10ng·μl^-1。

按BSA分析方法的要求，選取10份高抗單株的DNA等量混合構(gòu)建DNA抗池；選取10份高感單株的DNA等量混合構(gòu)建DNA感池(劉源霞等，2015)。

1.2 SNP及InDel引物的設(shè)計

根據(jù)基因R_gls位點的初步定位結(jié)果及通過全基因組重測序技術(shù)所獲得的與蘋果抗炭疽菌葉枯病相關(guān)的SNP及InDel位點，篩選出位于第15條染色體上的4.1Mb-4.7Mb區(qū)域內(nèi)的18個SNP和30個InDel候選位點，并在候選位點兩側(cè)進行引物設(shè)計。引物設(shè)計的主要參數(shù)為：產(chǎn)物大小60-160bp；引物退火溫度(Tm)在55-65℃之間，且上、下游引物Tm相差不大于2℃；引物GC含量為45％-55％。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3高分辨率熔解曲線分析

PCR擴增和高分辨率熔解曲線分析在480 Ⅱ熒光定量PCR儀(Roche)上進行。反應(yīng)試劑來自480 High Resolution Melting Master試劑盒。反應(yīng)體系為15μl，內(nèi)含10ng·μl^-1的基因組DNA 1.0μl，1×Master Mix 7.5μl，2.0mmol·l^-1MgCl₂ 1.5μl，左右引物為0.2μmol·l^-1各0.5μl。

PCR擴增程序采用李煒等(2015)所用的程序：95℃預(yù)變10min，然后按95℃變性10min，55℃退火15s，72℃延伸10s進行45個循環(huán)。擴增產(chǎn)物HRM檢測程序為：95℃1min，40℃1min，65℃1s，在65℃升溫至95℃的過程中，以25次·℃^-1的頻率收集熒光信息，最后降溫至40℃。利用480的Gene Scanning軟件(1.5version)進行高分辨率熔解曲線分析。

1.4SNP、InDel標(biāo)記的篩選驗證及基因R_gls位點的精細定位

用18對SNP及30對InDel引物在親本和抗感基因池中篩選，將出現(xiàn)不同分型的引物在分離群體上進行驗證，以確定該標(biāo)記是否與目的基因連鎖。

將篩選的多態(tài)性標(biāo)記在重組個體上的基因型表現(xiàn)與重組個體的抗病表型進行統(tǒng)一分析，對抗炭疽菌葉枯病基因R_gls位點進行精細定位，縮小抗病基因位點的范圍，為后續(xù)的候選基因篩選及圖位克隆提供準(zhǔn)確的信息。

1.5分子標(biāo)記可靠性驗證

利用與抗炭疽菌葉枯病基因R_gls位點緊密連鎖的2個分子標(biāo)記對50個品種(系)進行基因型驗證，通過與表型鑒定結(jié)果比對，以確定分子標(biāo)記的可靠性。

2結(jié)果與分析

2.1 SNP及InDel標(biāo)記的篩選

通過對設(shè)計的引物進行BSA篩選，獲得了與R_gls基因位點連鎖的6個SNP及5個InDel標(biāo)記，分別為SNP3955、SNP4236、SNP4257、SNP4299、SNP4336、SNP4432和InDel4199、InDel4227、InDel4254、InDel4305、InDel4334，如表1所示。

2.2 SNP及InDel標(biāo)記的驗證

將獲得的11個標(biāo)記在207株F₁分離群體上檢驗其與抗炭疽菌葉枯病基因的連鎖情況，結(jié)果表明，這11個標(biāo)記的擴增子熔解曲線形狀明顯不同，可據(jù)此區(qū)分抗病型和感病型植株(圖1-圖5所示)。

2.3基因R_gls位點的精細定位

將從全基因組重測序中篩選出并經(jīng)群體驗證的與R_gls位點緊密連鎖6個SNP及4個InDel標(biāo)記(InDel4305標(biāo)記在染色體上的物理位置與遺傳位置不符，未用于精細定位分析)，共10個標(biāo)記與重組個體基因型及表型進行分析。在已獲得的初步定位的R_gls位點基礎(chǔ)上進一步將基因R_gls位點定位于InDel4199和SNP4257之間，物理距離由500kb縮小為58kb(圖6所示)。

表1 SNP、InDel引物篩選

2.4不同蘋果品種(系)對炭疽菌葉枯病的抗性表現(xiàn)

通過室內(nèi)人工接種對50個品種(系)進行抗性鑒定(表2)。鑒定結(jié)果表明，在50個蘋果品種(系)中，有33個抗病品種(系)，17個感病品種(系)，抗感表現(xiàn)差異明顯(圖7)。

2.5不同標(biāo)記對抗感品種(系)的鑒定

圖8所示，在HRM圖中，可以看出標(biāo)記SNP4236和InDel4254能夠很清楚的區(qū)分出抗感植株。

2.6標(biāo)記準(zhǔn)確性鑒定

兩個共分離標(biāo)記SNP標(biāo)記SNP4236和InDel標(biāo)記InDel4254對33個抗病品種(系)和17個感病品種(系)驗證的結(jié)果顯示(表2)，2個標(biāo)記在基因型鑒定結(jié)果中與表型鑒定結(jié)果不相符的品種(系)分別為1個和2個，鑒定抗病感病的準(zhǔn)確率分別為98.0％，96.0％，可以應(yīng)用于田間栽培品種、品系、種質(zhì)資源以及雜種后代幼苗對炭疽菌葉枯病抗性的鑒定。

表2 2個分子標(biāo)記對蘋果栽培品種和品系的抗病性的鑒定結(jié)果

HRM分析技術(shù)是近年來國際上新興的一種用于檢測基因突變，進行基因分型和SNP分析的技術(shù)方法。通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況，來判斷是否存在SNP位點。SNP位點因堿基不同會使雙鏈DNA的TM值發(fā)生變化，因而形成不同的融解曲線形狀，熒光染料從局部解鏈的DNA分子上釋放，從熒光強度與時間曲線上就可以判斷是否存在SNP，而且不同SNP位點、雜合子與純合子等都會影響熔解曲線的峰形，因此HRM分析能夠有效區(qū)分不同SNP位點及不同的基因型(Wittwer,2009)。該技術(shù)具有三個突出的優(yōu)勢：一是高通量、高靈敏度、高特異性、低成本且不受檢測位點的限制；二是操作簡單、快捷、節(jié)省時間成本；三是閉管操作，無污染且DNA不受損傷，熔解分析后還可以進行凝膠電泳或測序分析。

精細定位通常采用的方法是側(cè)翼分子標(biāo)記法，對于有參基因組植物來說，就是根據(jù)對目的基因的初步定位結(jié)果，選擇位于目的基因兩側(cè)的分子標(biāo)記之間的堿基，用于設(shè)計合適的分子標(biāo)記。篩選出的與目的基因連鎖的分子標(biāo)記，通過鑒定更大的群體來確定發(fā)生交換的重組單株，最終找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，從而實現(xiàn)對目的基因的精細定位。精細定位是圖位克隆策略中重要的一步,可以通過開發(fā)新的分子標(biāo)記，整合原來已有的遺傳圖譜來進行圖譜加密，以實現(xiàn)對目的基因的精細定位。

本發(fā)明利用全基因組重測序技術(shù)開發(fā)出的SNP及InDel標(biāo)記，結(jié)合R_gls基因初步定位結(jié)果，選出位于R_gls基因兩側(cè)的SNP和InDel標(biāo)記，通過HRM曲線分析技術(shù)對18個SNP位點和30個InDel位點進行了分析，篩選出6個SNP及5個InDel標(biāo)記與R_gls基因位點緊密連鎖。并選擇其中的10個標(biāo)記用于R_gls基因位點的精細定位，其中標(biāo)記InDel4227、SNP4236和InDel4254表現(xiàn)出與R_gls基因位點共分離。

本發(fā)明利用2個與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點共分離的分子標(biāo)記SNP4236和InDel4254對50個田間栽培品種和青島農(nóng)業(yè)大學(xué)選育出的優(yōu)系進行了抗炭疽菌葉枯病的基因型鑒定，并結(jié)合其抗病的表型鑒定對2個標(biāo)記的準(zhǔn)確性進行了分析，結(jié)果表明2個標(biāo)記的準(zhǔn)確率分別為98.0％和96.0％，可以應(yīng)用于田間栽培品種、品系、種質(zhì)資源以及雜種后代幼苗對炭疽菌葉枯病抗性的鑒定。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 與蘋果抗炭疽菌葉枯病基因位點緊密連鎖的分子標(biāo)記及應(yīng)用

<130>

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccttaaaag ccatggaaga g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttctgcata aaaacctcgc a 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcttatcata aaaagcaaga ccac 24

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atcatataat tgtgtaattt agtagaaca 29

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagtcataa gccacaacga g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagctttga agcatccaat t 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggttatacat agaggcactt agagc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcacaaaact tagatcaaag atgag 25

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agttcgttct tttccgttgc t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcggtcctga ttcaggtaca g 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgaggagcaa acgatagtca g 21

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

attggtctcc gaattagaag tcc 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

attgtgaaac cttgattggg 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gagattatcc ttattttgtg gg 22

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agcgttgcta tgcttctaat g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

aagatggaaa tggtatgtga t 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ataaagtcac ttctagcaca aata 24

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cgaaaaacgc tttacttagg 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gtaaactcat taaattatgc ttg 23

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

tgctttactc cgattcttc 19

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atactatgag gtgaaggatt taa 23

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

gtatcttcta cattatcttt cgtg 24