本發(fā)明屬于農業(yè)生物技術領域，尤其涉及一種油菜素內酯生物合成基因DWF5突變體的篩選方法。

背景技術：

植物激素在植物細胞內產生的一類極低濃度的活性物質。它們在植物細胞生長分裂、組織器官的分化、開花結實、成熟與衰老、種子休眠與萌發(fā)及環(huán)境適應與抵抗等方面起著不可或缺的作用，調節(jié)著植物生長發(fā)育與環(huán)境適應的各個方面。近年來，人們通過外源施加生長激素來調控農作物使其高產、高抗、優(yōu)質獲得了重要進展。目前，人們了解和應用得最多的幾大類激素包括生長素、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸、乙烯、油菜素內酯、水楊酸、茉莉酸等。這幾大類植物激素都是簡單小分子化合物，但其生理效應卻十分重要復雜。其中，油菜素內酯發(fā)現(xiàn)得較晚，但已廣泛應用于作物葉片大小、產量、株高和抗性調節(jié)。作為一種甾醇類物質，油菜素內酯作用于植物生長發(fā)育和環(huán)境適應的各個方面。因此，研究油菜素內酯對于農作物株型調節(jié)、高產、高抗等方面具有重要的理論價值和實用意義。

油菜素內酯合成或信號缺失突變體表現(xiàn)出典型的矮小、黑暗中去黃化、推遲開花、雄性不育、根短小等表型(Clouse and Sasse 1998)。突變體的發(fā)現(xiàn)加快了油菜素內酯的作用機理研究和廣泛應用。自從油菜素內酯受體BRI1通過誘變獲得該基因突變體后，大量BRI1弱缺失突變體被發(fā)現(xiàn)，它們表現(xiàn)出半矮小表型，與強突變體最大的優(yōu)勢是具有可育性，方便進行遺傳操作(Li and Chory 1997；Noguchi et al.1999)。比如，bri1-5是最早發(fā)現(xiàn)的bri1弱突變體，通過甲烷磺酸乙酯(EMS)誘變而得，在油菜素內酯機理研究中應用得最為廣泛的弱突變體之一。bri1-5是BRI1蛋白胞外結構域半胱氨酸對中第69位氨基酸由酪氨酸取代半胱氨酸而導致(Noguchi et al.1999)。此外，bri1-6、bri1-7、bri1-8、bri1-9是另外幾個通過EMS誘變導致氨基酸替換而得的bri1弱突變體(Noguchi et al.1999)。bri1-6是第644位甘氨酸突變成天冬氨酸而致，bri1-7是第613位甘氨酸突變成絲氨酸而致，bri1-8是第983位精氨酸突變成天冬酰胺而致，bri1-9是第622位絲氨酸突變成苯丙氨酸所致。bri1-301是一個由于第989位甘氨酸突變成異亮氨酸而成(Xu et al.2008)。bri1-120是由于第339位絲氨酸突變成苯丙氨酸而致(Shang et al.2011)。

在過去二十年中，科學家們借助模式植物擬南芥中bri1相關突變體發(fā)現(xiàn)了大量BR合成和信號途徑中的新成員。例如，用遺傳方法篩選bri1-5的遺傳抑制子發(fā)現(xiàn)了油菜素內酯信號轉導途徑中的重要成員BRS1、BAK1、BRL1、BSU1(Li et al.2001；Li et al.2002；Mora-García et al.2004；Zhou et al.2004)。bes1-D作為bri1-119的遺傳抑制子被發(fā)現(xiàn)(Yin et al.2002)，atbs-D是在br1-301背景下被發(fā)現(xiàn)(Wang et al.2009；Kang et al.2010)。通過對bri1-5的遺傳抑制子的篩選，人們獲得了調控油菜素內酯合成關鍵限速酶的轉錄因子TCP1(Guo et al.2010)，以及發(fā)現(xiàn)了油菜素內酯分解代謝途徑中的關鍵酶BEN1(Yuan et al.2007)。

目前為止，研究發(fā)現(xiàn)油菜素內酯合成途徑關鍵調控酶DET2、DWF4、CPD、CYP90C1/ROT3、CYP90D1、BR6OX2/CYP85A2催化油菜素內酯中間前體物質的轉化(Fujioka et al.1997；Choe et al.1998；Kim et al.1998；Shimada et al.2003；Kim et al.2005；Ohnishi et al.2012)。然而，僅有少量弱突變體在模式植物擬南芥中被發(fā)現(xiàn)，det2-1在Col背景下得到，是在第二條染色體上32.9位置(position)(Chory et al.1991)，det2-28和det2-101為兩個EMS誘變突變體(Li et al.2001；Guo et al.2010)。油菜素內酯合成突變體br6ox2、cyp85a2-1、cyp85a2-2、cyp85a2-3均表現(xiàn)出半矮小表型(Nomura et al.2005)。

然而，由于油菜素內酯合成途徑基因突變體的缺乏，有關油菜素內酯合成和信號研究由此變得較為遲緩。因此，構建一些油菜素內酯合成途徑關鍵基因的可育突變體對于油菜素內酯合成和代謝途徑的研究及油菜素內酯更為廣泛的應用顯得非常重要。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術問題，本發(fā)明提供一種油菜素內酯生物合成基因DWF5突變體的篩選方法，該方法培育簡單，且能快速檢測油菜素內酯主要合成基因突變體的突變體位點，篩選出需要的植株。

解決以上技術問題的本發(fā)明中的一種油菜素內酯生物合成基因DWF5突變體的篩選方法，其特點在于：包括以下步驟：

(1)將pBIB-BASTA用電激法轉化根癌農桿菌中，pBIB-BASTA和根癌農桿菌的質量用量比為1：100，在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2天生長菌落，待菌落大小為2mm左右進行下一步實驗；

(2)挑取上一步得到的菌落在LB液體培養(yǎng)基中26-29℃進行擴大培養(yǎng)46-50小時，待OD600＝0.5～0.8時進行下一步侵染轉化；

(3)用浸花法將pBIB-BASTA T-DNA轉化入擬南芥野生型，得T0型；

pBIB-BASTA T-DNA的序列圖譜如圖5。

(4)獲得T1代；

(5)獲得T2代；

(6)將T2代種子種于營養(yǎng)土中，待幼苗長出1周后，進行轉基因苗抗性篩選；

(7)RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)油菜素內酯合成途徑中關鍵基因DWF5未表達，則獲得突變體命名為dwf5。

所述營養(yǎng)土為有機水蘚基質泥炭土，粒徑為0-10mm。

所述步驟(7)中RT-PCR檢測步驟具體為對上一步抗除草劑BASTA的幼苗，生長3周后，按照Qiangen公司生產的RNA提取試劑盒及說明書提取總RNA，取2μg總RNA用Invitrogen公司的M-MLV反轉錄酶按照其說明書進行反轉錄后得到cDNA，取100ng總RNA對應的cDNA，用寶生物生產的ExTaq酶按照其說明書進行PCR擴增。

所述PCR擴增條件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min(第2至第4步重復29個循環(huán))；72℃延伸10min。

所述PCR擴增檢測中引物序列如下：

DWF5-F：5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’；

DWF5-R：5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’；

以EF1a為內參基因，EF1ɑ-F：5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’；

EF1ɑ-R：5’-TCAAGTAGCAAAATCA CGGCGCTT-3’。

所述步驟(6)轉基因苗抗性篩選中選出發(fā)育蓮座寬度變小、植株高度降低、莢果長度減小的表型的植株。

本發(fā)明以擬南芥野生型Col-0為背景材料，將T-DNA pBIB-BASTA(Ge et al.2011)用根癌農桿菌介導的方法轉化進入擬南芥Col-0，獲得轉基因植株，在T2代轉基因植株中，發(fā)現(xiàn)一株植物出現(xiàn)類似油菜素內酯合成或信號缺失突變體的表型，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、蓮座寬度變小、植株高度降低、莢果長度減小的表型。經分子生物學手段及遺傳學手段鑒定，該突變體植物是由于油菜素內酯合成途徑中關鍵基因DWF5的-1213至376bp區(qū)段的缺失所導致，將該突變體命名為dwf5(-8)。

本發(fā)明方法從眾多基因突變體中篩選到油菜素內酯合成基因，通過該方法能快速鑒定到T-DNA插入導致的基因缺失突變，特別是由于T-DNA插入植物基因組后，T-DNA的丟失而導致其附近基因的功能缺失突變體的鑒定，從而高效篩選出需要的植株。

對于T-DNA插入植物基因組后由于某種原因T-DNA丟失，但同時使其插入位點附近基因片段隨T-DNA一起丟失而導致的基因突變，傳統(tǒng)方法中常用圖位克隆等方法尋找突變的基因。而本發(fā)明中的方法省去了圖位克隆等繁瑣步驟，結合表型鑒定，本方法能高效檢測油菜素內酯重要合成基因突變體的突變位點，對篩選出需要的植株的確定提供了更快速準確簡便的方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明中DWF5基因突變體dwf5-8的表型

圖2為本發(fā)明中采用RT-PCR鑒定野生型擬南芥Col和本發(fā)明dwf5-8突變體植物中DWF5基因的表達情況

圖3為本發(fā)明中dwf5-8突變體缺失區(qū)段示意圖

圖4中中間小的苗是DWF5基因的突變體，后面三顆大苗是DWF5轉到小苗后把小苗的表型恢復圖

圖5為本發(fā)明中pBIB-BASTAT-DNA的序列圖譜

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述:

實施例1

本發(fā)明將DWF5基因突變體dwf5-8的具體構建和鑒定方法如下：

(1)取1μl濃度為10ng/μl的pBIB-BASTA加入到100μl根癌農桿菌中，在電激轉化儀上2.4千伏、5毫秒的條件下進行電激轉化。在含有50μg/ml卡那霉素和50μg/ml慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2天生長菌落，待菌落大小為2mm左右進行下一步實驗。

本發(fā)明中，電激法的具體操作步驟為在BIO-RAD電激轉化儀上，按照該儀器說明書，在電激轉化儀上2.4千伏、5毫秒的條件下進行電激轉化。

(2)長出的菌落用菌落PCR鑒定后在LB液體培養(yǎng)基中30℃進行擴大培養(yǎng)。

(3)參照Clough等(Clough and Bent 1998)的方法用浸花法將pBIB-BASTA T-DNA轉化入擬南芥野生型Col-0。

浸花法步驟如下：

A、農桿菌在LB液體培養(yǎng)基中于28℃培養(yǎng)48小時后，OD600達到0.8時，將農桿菌于6500g離心5min,收集菌體。

B、將菌體在5％蔗糖溶液中溶解(每100ml農桿菌菌液需200ml 5％蔗糖溶液)，加入0.03％Silwet-L77表面活性劑。

C、將花蕾浸入上一步液體中輕輕晃動20秒。

D、浸染后的苗繼續(xù)生長，收獲種子。

(4)將T0代種子收集后種于營養(yǎng)土中，待幼苗萌發(fā)后一周時用除草劑1.5‰草甘膦溶液噴施后，獲得T1代轉基因幼苗。

(5)收獲T1代轉基因幼苗的種子，即為T2代種子。

(6)丹麥有機水蘚基質泥炭土(0-10mm)，待幼苗長出1周后，噴施1.5‰草甘膦溶液進行轉基因苗抗性篩選。存活的幼苗中，發(fā)現(xiàn)一株苗表現(xiàn)出類似油菜素內酯合成或信號相關基因的突變體，表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、蓮座寬度變小、植株高度降低、莢果長度減小的表型(圖1)。

(7)通過對油菜素內酯合成和信號途徑關鍵基因的RT-PCR(反轉錄PCR)用引物DWF5-F(引物序列為5’-ATGACTCGAGCTCTGCTGCTG-3’)和DWF5-R(引物序列為5’-TCATACGTATATCCCTAAAAC-3’)鑒定，以EF1a為內參基因(反轉錄PCR引物為EF1ɑ-F：5’-CAGGCTGATTGTGCTGTCCT-3’；EF1ɑ-R：5’-TCAAGTAGCAAAATCA CGGCGCTT-3’)發(fā)現(xiàn)油菜素內酯合成途徑中關鍵基因DWF5未表達(圖2)，將該突變體命名為dwf5-8。

從圖2中可知DWF5基因在dwf5-8突變體植株中沒有表達。該反轉錄PCR用EF1a作為內參基因。

RT-PCR檢測步驟具體為對上一步抗除草劑BASTA的幼苗，生長3周后，按照Qiangen公司生產的RNA提取試劑盒及說明書提取總RNA，取2μg總RNA用Invitrogen公司的M-MLV反轉錄酶按照其說明書進行反轉錄后得到cDNA，取100ng總RNA對應的cDNA，用寶生物生產的ExTaq酶按照其說明書進行PCR擴增。

PCR擴增條件如下：95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min(第2至第4 步重復29個循環(huán))；72℃延伸10min。

從圖1可知，與野生型擬南芥Col相比，dwf5-8突變體植物表現(xiàn)出蓮座寬度變小、植株高度降低、莢果長度降低，但單個莢果的種子數(shù)量變化不顯著。

試驗一

提取dwf5-8的基因組DNA，用引物P1和P2擴增得到DNA片段，發(fā)現(xiàn)DNA片段長度減小，經測序鑒定后發(fā)現(xiàn)dwf5-8中缺失一段DNA序列(基因序列如SEQ ID NO:1所示，即本發(fā)明中dwf5-8突變體植株中DWF5基因的缺失區(qū)段)。

引物P1序列為：5’-CATAAAATGGGAGATTGGGAGT-3’

引物P2序列為：5’-CATAGGTGCAACACTTAATCCA-3’

PCR擴增條件如下：

95℃，2min；95℃，15s；55℃，30s；72℃,2min(第2至第4步重復29個循環(huán))；72℃延伸10min。

由上述實驗結果可知，dwf5-8突變體植物中DWF5基因的缺失區(qū)段如圖3所示。

從這些缺失區(qū)段可以證明該方法找到了DWF5基因突變體所缺失的基因片段，即成功獲得本發(fā)明所期望得到的在該突變體總具體基因缺失區(qū)段附近詳細信息。

試驗二將DWF5這個基因補充回去發(fā)現(xiàn)可以恢復dwf5突變體矮小的表型證明的確是DWF5這個基因突變引起。

具體步驟：(1)擴增DWF5CDS全長，構建成pBIB-BASTA-35S-DWF5超表達載體。

(2)用電激法轉化到農桿菌中。

(3)用浸花法將含有pBIB-BASTA-35S-DWF5的農桿菌轉化到擬南芥dwf5-8中,可以將其矮小表型恢復。

結果如圖4，中間小的苗是DWF5基因的突變體，后面三顆大苗是DWF5轉到小苗后，把小苗的表型恢復圖。

油菜素內酯的合成信號通路已很清晰，傳統(tǒng)的方法是用TAIL-PCR等從全基因組尋找某基因的突變位點，本方法是直接檢測油菜素內酯合成相關基因的表達，從而定位于合成途徑中的某基因，再通過分段檢測基因序列的方法而快速確定基因突變位點。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

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SEQUENCE LISTING

<110> 四川農業(yè)大學

<120> 一種油菜素內酯生物合成基因DWF5突變體的篩選方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1589

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223>dwf5未表達的基因序列

<400> 1

aagtgtattaaacactaaaatcaaaaaaaggaaacaagtcatgtaccatctggacagaaatgaagatgaaggcatgatctctagcaaccagcagctgaaatctcaatctcaaccaccatctatcagcaggcacattggctcggagtttgaaaaaggctctacactctgtacaatgcgaaaatgcaaaaccttcctgaaacatatattgcatagaaacaaaatacacttcataagctaagtaaaccattcattcaaaagaagaagaaactttctggaaacggtgacgataatataccttggtggagcgccaattatcgagacaagatctgtgaacgtgcttttgagtacctttacaattgcacggagcaatcagatcttcccctgcaatcaaagaacaaaccaagtcgtctcattgtatcctcactcaattgagttaaggaattgcttttattatacctccaacatcaaggcaaattcgacattgtggttgatctccagaaacaagaagtgtggtttcgtcatcatcagtctcagctatttctgaaacttgtccttcctccacaacacgatctcctctttccgctgctacgatttcgtttgaggatgttgattcgtcgaataaaatctgttcctttctatcatcatcatcatcactaggcactaattgcatctcttaaacatactaaaatttctggaaatgaaaaaaaactgagaaacgcaaaagaattcaacacagcatcagaaaactagatctaggtttcgccgggagttaccaaaaacattagaaaaaatcgatacttacacgaattcaaccaattctggagaattttcttccaaggcaagccattgcttgcgagttagaagaaattggtaaactatgactgcgaatcagagtgaagagaatttgattttgttagtctcgattcatcactatgtgttgaatacagagatgacgaagatcttttgagggttgagagagaagaagctaagaagattgggatcaatcaaaaacgatggcgaagaaaagtctcaagggtaaaattggaattagaaaaaacatgtggagagcacgtgacacgtgggatttatctgagtttcacagtagacctgtgaagttcatcgtcttcatcgttaacttcgcagactctgttgattagtcaacacagatcagaatctgaggctttggccgagacgagagaagcagaagaagaaaatggcggagactgtacattctccgatcgttacttacgcatcgatgttatcgcttctcgccttctgtccacctttcgtcattctcctgtaagctcatcaatttctgattcgcaagtctttattctagttctcagatcagactcgcacacttttctggctccttaattcatagcgagaagtgcatagccgatatctttaaatcctttcccattaagtaggacttgataagagtctttaattgaaaaagcgattcaatgattctttctctggccaatgtgagtttccagatttttaggaaacaagggtagatttaaagctacaaaatcatatttagtgagttttaagtaatgctcacaagtttcatttctttatgatgc 1589

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cataaaatgggagattgggagt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

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<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgactcgagctctgctgctg 21

<210> 5

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<212> DNA

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<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> CDS (4 total) T2A序列

<400> 6

caggctgattgtgctgtcct 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> CDS (4 total) T2A序列

<400> 6

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