本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應(yīng)用?？捎糜邳S瓜炭疽病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于黃瓜炭疽病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。

背景技術(shù)：

黃瓜（Cucumis sativus L.）營養(yǎng)豐富，氣味清香，鮮食、熟食均可，是深受廣大生產(chǎn)者和消費者喜愛的高經(jīng)濟價值蔬菜作物。黃瓜因其繁多的品種類型和其較強的生長適應(yīng)性，而得到廣泛的應(yīng)用，因而黃瓜是全球性栽培的主要蔬菜之一。隨著我國種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，黃瓜在中國的種植面積和復(fù)種指數(shù)不斷擴大，隨之黃瓜病蟲害的發(fā)生也日趨嚴(yán)重，病蟲害已成為限制黃瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。

由葫蘆科刺盤孢菌（Colletotrichum orbiculare）侵染引起的炭疽病是一種重要的黃瓜病害，在全國各地均有發(fā)生，主要危害黃瓜葉片、莖蔓和果實，全生育期均可發(fā)病，尤以生長后期受害最嚴(yán)重。該病菌侵染力強、繁殖率高，以菌絲體或擬菌核在種子上或隨病殘體在土壤中越冬，發(fā)病條件一旦適宜，就會造成病害的大面積流行，常造成植株中下部大量葉片干枯，果實產(chǎn)生病斑，降低品質(zhì)或完全失去商品價值，使黃瓜產(chǎn)量降低，嚴(yán)重時病株率達(dá)100%，產(chǎn)量損失40%以上，甚至絕收。近年來該病的發(fā)生有不斷加重的趨勢，然而，針對此病尚無較好的抗病品種和特效農(nóng)藥可以利用，防治難度較大。因此，快速、準(zhǔn)確地在發(fā)病前或初期對病菌的侵染動態(tài)進(jìn)行監(jiān)測，及時采取有效的防治方法對控制病害在田間和儲運中的發(fā)生，減少經(jīng)濟損失具有十分重要的意義。

傳統(tǒng)炭疽病菌的分類與鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征及致病性測定等，這種鑒定方法耗時較長、程序繁瑣、靈敏度低以及經(jīng)驗性強，從發(fā)病植株中分離并鑒定病原菌需要數(shù)天時間，難以做到對病害發(fā)生及時監(jiān)測和有效控制病原菌的傳播與病害流行。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用PCR、血清免疫學(xué)等技術(shù)對病原菌進(jìn)行特異和快速分子檢測的成功例子已越來越多，但這些分子生物學(xué)技術(shù)在一定程度上也存在了一些不足之處。如血清免疫學(xué)檢測技術(shù)在血清的制備過程耗時耗力，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，且可能存在交叉反應(yīng)，特異性較差，容易造成假陽性；PCR快速檢測技術(shù)主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實時熒光定量PCR 等，PCR技術(shù)檢測時間較長，需要依靠PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，上述缺欠限制了這些先進(jìn)方法的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是由日本榮研公司開發(fā)的一種簡便、快速、準(zhǔn)確及廉價的核酸高效擴增技術(shù)，該技術(shù)可在60℃~65℃恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 對目的DNA片段進(jìn)行特異性擴增。在1小時內(nèi)，能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴增至10⁹~10¹⁰個拷貝數(shù)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測，而且還可以通過SYBR GreenⅠ、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后，肉眼識別。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟，且無需特殊設(shè)備，檢測結(jié)果可由肉眼判斷，極適合于在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報道較少，關(guān)于黃瓜炭疽病菌的LAMP檢測國內(nèi)外均未見報道。

本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）技術(shù)原理，選取炭疽菌Beta-tubulin基因序列為檢測靶標(biāo)，在Beta-tubulin基因序列的6個區(qū)域設(shè)計了4條黃瓜炭疽病菌特異性引物，通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立以SYBR Green Ⅰ為熒光顯色指示劑的黃瓜炭疽病菌可視化LAMP 檢測技術(shù)。該技術(shù)操作簡單、靈敏度和特異高，且無需貴重儀器設(shè)備，適宜于田間黃瓜炭疽病的早期診斷和病原菌的檢測和鑒定，對黃瓜炭疽病及時、有效的防治具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中對黃瓜炭疽病菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征，方法耗時長、程序繁瑣、經(jīng)驗性強、準(zhǔn)確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，以及現(xiàn)有PCR分子檢測需要依靠擴增儀等貴重儀器，且檢測時間較長等問題，提供了一種黃瓜炭疽病菌LAMP技術(shù)檢測方法及使用的引物組合物，本發(fā)明檢測方法易于操作、特異性強、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1. 黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物：

通過測定黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和其它炭疽病菌（Colletotrichum spp）的Beta-tubulin基因，對炭疽菌屬不同種間Beta-tubulin基因序列進(jìn)行比對分析，利用在線LAMP引物設(shè)計軟件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設(shè)計一套黃瓜炭疽病菌特異性LAMP引物，包括F3、B3、FIP和BIP 等4 條引物，其序列為：

F3: 5’- GGGGCTAACTGCTTGAACAG -3’，

B3: 5’- GGTGCCGT TGTACCTGTT -3’，

FIP: 5’- TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC -3’，

BIP: 5’- AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA - 3’。

2. 黃瓜炭疽病菌LAMP檢測方法，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA。

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用CTAB 法進(jìn)行提取基因組DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol· L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干至無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

用于檢測植物組織中存在黃瓜炭疽病菌時，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴增；

用于檢測土壤樣品中存在黃瓜炭疽病菌時，采用土壤DNA提取試劑盒，提取DNA。

（2）LAMP反應(yīng)體系的建立：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用引物F3、B3、FIP和BIP進(jìn)行LAMP擴增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25 μL；

（3）LAMP反應(yīng)條件：63.5℃溫育60 min，85℃滅活5min；

（4）反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物特異性強；且將其用于黃瓜炭疽病菌LAMP檢測克服了現(xiàn)有技術(shù)中生物學(xué)檢測方法所需周期長、費時費力、繁瑣、特異性差的問題及PCR 檢測技術(shù)需要熱循環(huán)儀等貴重設(shè)備，無法應(yīng)用于基層等問題。本發(fā)明檢測方法在63.5℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到黃瓜炭疽病菌，不需要復(fù)雜儀器，能較好滿足對黃瓜炭疽病菌的現(xiàn)場檢測，為黃瓜炭疽病菌的檢測提供了新的技術(shù)平臺，可用于田間黃瓜炭疽病的早期診斷和病菌的監(jiān)測。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果：

1、特異性強、結(jié)果可靠：本發(fā)明所設(shè)計的LAMP引物是基于炭疽病菌（Colletotrichum spp）的Beta-tubulin基因序列中6個不同區(qū)域設(shè)計出4條特異性引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴增，相對于PCR引物識別靶序列的2個獨立區(qū)域而言，特異性和靈敏度都比較高。本發(fā)明利用所設(shè)計出的LAMP引物建立了黃瓜炭疽病菌的LAMP檢測方法對黃瓜炭疽病菌和病原真菌進(jìn)行了特異性測試，只有黃瓜炭疽病菌能檢測出來，其它病原菌均未檢測出，多次試驗結(jié)果均一致，說明本發(fā)明LAMP檢測方法特異性強，結(jié)果可靠。

2、靈敏度高： 本發(fā)明對黃瓜炭疽病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg/ μL，具有很高的靈敏性。

3、實用性好：本發(fā)明的LAMP檢測方法不像PCR法需要要熱循環(huán)儀（PCR儀）等貴重儀器設(shè)備，這樣就擺脫了對熱循環(huán)儀等貴重設(shè)備的依賴；只要有穩(wěn)定的熱源，LAMP 反應(yīng)就可以發(fā)生，極大擴展了黃瓜炭疽病菌的檢測范圍。同時，本發(fā)明的LAMP反應(yīng)只需在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束之后通過的顏色變化便可直接判斷結(jié)果，從而增加了其在帶菌的植株和土壤中檢測的應(yīng)用價值。

4、操作簡便快速：本發(fā)明檢測方法在63.5℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到黃瓜炭疽病菌，不需要復(fù)雜儀器，只需一個恒溫設(shè)備即可，能較好滿足對黃瓜炭疽病菌的現(xiàn)場檢測。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明LAMP技術(shù)對黃瓜炭疽病菌的檢測結(jié)果。圖1上圖為LAMP擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；圖1下圖為LAMP擴增后的熒光染料可視化顯色結(jié)果，圖中管1為綠色，管2-4為橙色；其中：M為DL 2000 DNA marker，1為黃瓜炭疽病菌，2-3為其它病原菌，4為陰性對照。

圖2 為本發(fā)明LAMP技術(shù)檢測黃瓜炭疽病菌的靈敏性測定結(jié)果。圖2上圖為LAMP擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；圖2下圖為LAMP擴增后的熒光染料顯色結(jié)果，圖中管1-4呈綠色，5-8呈橙色；其中： M 為2000 DNA marker，1-7模板DNA濃度分別為10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，8為陰性對照。

圖3 為本發(fā)明檢測方法對發(fā)病植株和帶菌土壤中黃瓜炭疽病菌的檢測。圖3上圖為LAMP擴增后的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；圖3下圖為LAMP擴增后的熒光染料顯色結(jié)果，圖中管1-2、4、6、8呈綠色，管3、5、7呈橙色；其中：M為DL 2000 DNA marker，1為陽性對照，2為發(fā)病葉片，3為健康葉片，4為發(fā)病葉片，5為健康葉片，6為帶菌土壤，7為陰性對照，8為帶菌土壤。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述， 但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實施例均按照常規(guī)實驗條件，或已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照廠商所建議的實驗條件。

實施例 1：黃瓜炭疽病菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測特異性引物組合物的設(shè)計及引物對黃瓜炭疽病菌的特異性驗證

1.供試菌株基因組DNA的提取

采用CTAB 法提取供試菌株（表1）基因組 DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇（25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r· min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

表1 供試菌株

2.黃瓜炭疽病菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）特異引物的設(shè)計

通過測定黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）和其它炭疽病菌（Colletotrichum spp）的Beta-tubulin基因，對炭疽菌屬不同種間Beta-tubulin基因序列進(jìn)行比對分析，利用在線LAMP引物設(shè)計軟件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設(shè)計一套黃瓜炭疽病菌特異性LAMP引物，包括F3、B3、FIP和BIP 4 條引物，其序列為：

F3: 5’- GGGGCTAACTGCTTGAACAG -3’，

B3: 5’- GGTGCCGTTGTACCTGTT -3’，

FIP: 5’- TGTGCGAAGCATCGTTGCCGGGTAACCAGATTGGTGCTGC -3’，

BIP: 5’- AGGCAAAACATCTCTGGCGAGCCCATTCTTGACGTGGCCTTA - 3’。

3. 黃瓜炭疽病菌LAMP檢測方法的建立及引物特異性驗證

以表1供試菌株的DNA為模板，利用引物組合物F3、B3、FIP和BIP進(jìn)行LAMP擴增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：63.5℃溫育60 min，85℃滅活5min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

4.引物特異性驗證結(jié)果

LAMP擴增結(jié)果表明，供試的黃瓜炭疽病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征的梯形帶，其余病原菌顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶（附圖1），說明所設(shè)計的黃瓜炭疽病菌特異性引物組合物F3、B3、FIP和BIP可以將黃瓜炭疽病菌與其它病原菌區(qū)分開來，具有種的特異性，可用于黃瓜炭疽病菌快速可靠的檢測和鑒定。

實施例2：黃瓜炭疽病菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（LAMP）檢測靈敏度測定

1.不同濃度基因組DNA的制備

用無菌超純水對黃瓜炭疽病菌基因組DNA進(jìn)行稀釋，配制成10倍數(shù)量級的系列濃度備用；

2. LAMP檢測方法靈敏度測定及結(jié)果觀察

以不同濃度的黃瓜炭疽病菌基因組DNA為模板，利用引物組合物F3、B3、FIP和BIP進(jìn)行LAMP擴增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同濃度DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：63.5℃溫育60 min，85℃滅活5min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

3. LAMP擴增靈敏度檢測結(jié)果

LAMP擴增靈敏度檢測結(jié)果表明，10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL濃度的黃瓜炭疽病菌基因組DNA顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征的梯形帶，其余濃度及陰性對照顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶，說明所設(shè)計的黃瓜炭疽病菌引物組合物F3、B3、FIP和BIP通過LAMP擴增，對黃瓜炭疽病菌的檢測靈敏度可達(dá)10 fg/μL（附圖2）。

實施例3：發(fā)病葉片中黃瓜炭疽病菌的LAMP檢測

樣品采集：從福建福州、漳州和泉州采集黃瓜炭疽病發(fā)病癥狀典型的葉片及健康葉片帶回實驗室備用；

果實DNA的提?。翰捎肗aOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μl加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴增。

擴增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用引物組合物F3、B3、FIP和BIP進(jìn)行LAMP擴增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：63.5 ℃溫育60 min，85℃滅活5min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

檢測結(jié)果：檢測結(jié)果（附圖3）表明，黃瓜炭疽病發(fā)病癥狀典型的葉片基因組DNA通過LAMP擴增，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征的梯形帶，存在黃瓜炭疽病菌，而健康葉片及陰性對照顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶，不存在黃瓜炭疽病菌，說明該套技術(shù)能用于植物組織中黃瓜炭疽病菌的快速分子檢測。

實施例4：帶菌土壤中黃瓜炭疽病菌的LAMP檢測

帶菌土壤的制備：將供試的黃瓜炭疽病菌培養(yǎng)于PDA平板中，28℃黑暗培養(yǎng)7d，待菌絲長滿平板后，用適量的無菌水將平板中的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，與適量的土壤混合，在室內(nèi)自然風(fēng)干，制成帶菌土壤樣品，備用；

土壤DNA提?。翰捎肧igma公司的土壤DNA提取試劑盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的總DNA，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴增。

擴增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用引物組合物F3、B3、FIP和BIP進(jìn)行LAMP擴增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM F3和B3各1.0 μL，40 μM FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：63.5 ℃溫育60 min，85℃滅活5min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行測定。采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR green Ⅰ 1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性；采用瓊脂糖凝膠電泳法，取2.0 μL LAMP擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現(xiàn)梯形條帶判斷為陽性，沒有出現(xiàn)條帶則判斷為陰性。

檢測結(jié)果：檢測結(jié)果（附圖3）表明，攜帶黃瓜炭疽病菌的土壤DNA通過LAMP擴增，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光或瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)LAMP特征的梯形帶，存在黃瓜炭疽病菌，而高壓滅菌土壤及陰性對照顯色結(jié)果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現(xiàn)擴增條帶，不存在黃瓜炭疽病菌，說明該套技術(shù)可用于土壤中黃瓜炭疽病菌的快速分子檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 黃瓜炭疽病菌LAMP檢測引物及其應(yīng)用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> F3

<400> 1

ggggctaact gcttgaacag 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> B3

<400> 2

ggtgccgttg tacctgtt 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> FIP

<400> 3

tgtgcgaagc atcgttgccg ggtaaccaga ttggtgctgc 40

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> BIP

<400> 4

aggcaaaaca tctctggcga gcccattctt gacgtggcct ta 42