本發(fā)明涉及一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法，屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜退行性病變是引起不可逆致盲眼病的主要病因，其中主要包括年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性、Stargardt病。其中年齡相關(guān)性黃斑變性患者，全球大約有3千萬到5千萬，而視網(wǎng)膜色素變性患者約一百萬。目前我國的年齡相關(guān)性黃斑變性患者大約超過2000萬人，并預計將在2050年增加一倍。因此研究人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞并找到針對性的治療方案是目前生物醫(yī)療方向研究的重點課題之一。在人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的消化過程中傳統(tǒng)胰酶效果不佳：對視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化能力一般，解除貼壁的能力相對較弱，并不能完整的將視網(wǎng)膜色素上皮細胞解除貼壁狀態(tài)；對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的解除貼壁時間不能完全確定，需要進行摸索才能確定；如延長消化時間會破壞視網(wǎng)膜色素上皮細胞的功能。目前市場上存在的視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化方式為胰酶消化，其工作方式為：

(1)將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，吸去上清液。

(2)用DPBS(CTS)5ml清洗1次。

(3)加入胰酶2ml，放入37.0℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中消化15min。

(4)時間結(jié)束后將細胞轉(zhuǎn)移至含血清的培養(yǎng)基中終止消化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的消化酶不適合處理視網(wǎng)膜色素上皮細胞的問題，提供了一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法，包括如下步驟：

一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)清除培養(yǎng)液：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液；

(2)洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入DPBS(CTS)緩沖液5～10ml，輕輕搖勻，完全洗滌后移除液體；

(3)消化：將DispaseⅡ分離酶和DPBS緩沖液按1:40-50w/v混合，制成DispaseⅡ分離酶溶液，DispaseⅡ分離酶溶液和Tryple select溶液按體積比為1:2-3混合制成消化液，向步驟(2)中的培養(yǎng)瓶中加入消化液2～3ml，充分混勻后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～15min；

(4)準備：在離心管中加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基3～5ml備用；

(5)終止：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，加入2～3ml視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基終止反應，吹打細胞，將視網(wǎng)膜色素上皮細胞收集至準備好的離心管中；

(6)計數(shù)：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞混勻后取50～100ul細胞懸液進行細胞活率計數(shù)；

(7)離心：將收集好的視網(wǎng)膜色素上皮以1800～2200rpm/min離心，離心時間為5～10min；

(8)凍存：離心結(jié)束后棄去上清，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入凍存液Cryo-SFM，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/ml，分裝至凍存管中進行凍存。

進一步的，所述步驟(2)中采用DPBS(CTS)緩沖液洗滌3-5次。

進一步的，所述視網(wǎng)膜色素上皮細胞在二氧化碳培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)條件為溫度37-37.5℃，5-5.5％二氧化碳濃度。

進一步的，所述視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基中包含組分為：αMEM培養(yǎng)基、N1添加劑，谷氨酰胺、非必須氨基酸、?；撬帷浠傻乃伞⑷饧谞钕僭彼岷腿搜“辶呀庖?。

進一步的，所述步驟(8)中凍存時首先在3.5-4℃條件下保存30-35min，然后在-20--25℃保存2-2.5h后置于-80-85℃保存8-8.5h，最后轉(zhuǎn)移至液氮罐中。

本發(fā)明分離方法簡單，步驟易于控制，采用DispaseⅡ分離酶和Tryple select溶液混合制成消化液對視網(wǎng)膜色素上皮細胞進行消化分離，能夠縮短視網(wǎng)膜色素上皮細胞解除貼壁的時間，同時保持細胞的完整性，對細胞的損傷大大降低。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1消化液消化15min后培養(yǎng)瓶中殘余結(jié)果示意圖。

圖2為本發(fā)明對比例1胰酶消化15min后培養(yǎng)瓶中殘余結(jié)果示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

本發(fā)明中的谷氨酰胺、非必須氨基酸購自LIFE TECHOLOGISE公司；DPBS(CTS)購自GIBCO公司；DispaseⅡ購自ROCHE羅氏公司；胰酶購自INVITROGEN公司；αMEM培養(yǎng)基、N1添加劑、?；撬帷浠傻乃?、三碘甲狀腺原氨酸購自SIGMA公司；人血小板裂解液購自HELIOS公司；Cryo-SFM購自PromoCell公司

視網(wǎng)膜色素上皮細胞的培養(yǎng)基配制：α修飾低限基本培養(yǎng)基(MEM，αmodification)500ml，N1添加劑(N1supplement)5ml，谷氨酰胺(Glutamine)5ml，非必須氨基酸(Nonessentialaminoacids)5ml，?；撬?Taurine)150mg，氫化可的松(Hydrocortisone)15ug，三碘甲狀腺原氨酸(Triiodo-thyronin)0.010ug，人血小板裂解液(HPL)50ml。

實施例1：

一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法，包括如下步驟：

(1)清除培養(yǎng)液：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液。

(2)洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入DPBS(CTS)5ml，輕輕搖勻，完全洗滌后移除液體。

(3)消化：向培養(yǎng)瓶中加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化液2ml，充分混勻后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中10min。

(4)準備：取15ml離心管1個，加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基3ml備用；

(5)終止：時間結(jié)束后將視網(wǎng)膜色素上皮細胞取出，加入2ml視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基終止反應，用手動移液器進行吹打細胞，將細胞收集至準備好的15ml離心管中；

(6)觀察：將廢棄的培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察消化殘余情況；

(7)計數(shù)：將細胞混勻后取50ul細胞懸液進行細胞活率計數(shù)；

(8)離心：將收集好的細胞以1800rpm/min，5min離心；

(9)凍存：離心結(jié)束后棄去上清，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入適量凍存液，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/ml，分裝至2ml凍存管中，每管500ul。

消化液的配制過程：1g的DispaseⅡ，50mL的DPBS緩沖液，100mL的Tryple select，充分溶解混勻后，分裝放在-20℃保存

實施例2：

一種人類視網(wǎng)膜色素上皮細胞的分離、凍存方法，包括如下步驟：

(1)清除培養(yǎng)液：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液；

(2)洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入DPBS(CTS)10ml，輕輕搖勻，完全洗滌后移除液體；

(3)消化：向培養(yǎng)瓶中加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化液3ml，充分混勻后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中15min；

(4)準備：取15ml離心管1個，加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基5ml備用；

(5)終止：時間結(jié)束后將視網(wǎng)膜色素上皮細胞取出，加入3ml視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基終止反應，用手動移液器進行吹打細胞，將細胞收集至準備好的15ml離心管中；

(6)觀察：將廢棄的培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察消化殘余情況；

(7)計數(shù)：將細胞混勻后取100ul細胞懸液進行細胞活率計數(shù)；

(8)離心：將收集好的細胞以2200rpm/min，10min離心；

(9)凍存：離心結(jié)束后棄去上清，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入適量凍存液，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/ml，分裝至2ml凍存管中，每管500ul。

消化液的配制過程：1g的DispaseⅡ，40mL的DPBS緩沖液，120mL的Tryple select，充分溶解混勻后，分裝放在-20℃保存

對比例1：

具體步驟為：

(1)清除培養(yǎng)液：將視網(wǎng)膜色素上皮細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，吸去培養(yǎng)液；

(2)洗滌：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入DPBS(CTS)5ml，輕輕搖勻，完全洗滌后移除液體；

(3)消化：添加胰酶2ml，充分混勻后放入二氧化碳培養(yǎng)箱中15min；

(4)準備：取15ml離心管1個，加入視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基3ml備用；

(5)終止：時間結(jié)束后將細胞取出，加入2ml視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)基終止反應，用手動移液器進行吹打細胞，將細胞收集至準備好的15ml離心管中；

(6)觀察：將廢棄的培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察消化殘余情況；

(7)計數(shù)：將細胞混勻后取50ul細胞懸液進行細胞活率計數(shù)；

(8)離心：將收集好的細胞以2000rpm/min，5min離心；

(9)凍存：離心結(jié)束后棄去上清，根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入適量凍存液，調(diào)整細胞密度為1×10⁶/ml，分裝至2ml凍存管中，每管500ul。

分別對實施例1和對比例1中的細胞進行細胞活率計數(shù)，每份樣品取六份，并得到均值，結(jié)果如表1所示。

表1

由表1可知，實施例1中采用視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化液消化的細胞活率均值在95.0％以上。

對比例1中用胰酶消化的細胞活率均值不超過92.0％，低于視網(wǎng)膜色素上皮細胞消化液處理的細胞。

用消化液消化的細胞培養(yǎng)瓶觀察消化殘余情況如圖1所示，在相同的消化條件下，消化液消化用時10min，細胞解離效果好，視野內(nèi)可見貼壁細胞數(shù)量很少。

用胰酶消化的細胞培養(yǎng)瓶觀察消化殘余情況如圖2所示，在相同的消化條件下，胰酶消化用時20min，細胞解離效果差，視野內(nèi)可見貼壁細胞數(shù)量非常多。