本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于芽孢桿菌的無抗表達系統(tǒng)及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

蛋白表達技術(shù)是現(xiàn)代生物學(xué)的核心技術(shù)之一，表達蛋白不僅可用于生物學(xué)研究，也可以提供商業(yè)化的蛋白制品，如重組疫苗、重組胰島素、細(xì)胞因子等產(chǎn)品。目前常用的表達系統(tǒng)有大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等，但是它們都各有明顯的優(yōu)缺點。大腸桿菌表達系統(tǒng)研究最充分，有多種選擇，最常用的是Novagen的pET表達系統(tǒng)，其利用噬菌體的T7RNA聚合酶可專一性地轉(zhuǎn)錄T7啟動子后的目的基因，在最佳條件下，目的蛋白可以達到大腸桿菌總蛋白的50％以上。盡管具有表達效率高，培養(yǎng)成本低等優(yōu)點，但是缺點也非常明顯：蛋白容易形成包涵體，復(fù)性難度和成本較高；大腸桿菌不能對蛋白進行糖基化修飾；細(xì)胞壁含有脂多糖(內(nèi)毒素)，不易完全去除。另外一個常用的表達系統(tǒng)是酵母表達系統(tǒng)，其具有表達量高，可誘導(dǎo)，蛋白分泌到胞外易于純化，并且具有一定的翻譯后修飾能力等優(yōu)點，但是缺點是部分表達產(chǎn)物易降解，表達量不可控，大于30KDa的蛋白幾乎不能分泌。動物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)的特點是具有完整的修飾系統(tǒng)，表過產(chǎn)物具有或者類似的天然活性，沒有內(nèi)毒素污染，但是表達量低，周期長，技術(shù)要求高，生產(chǎn)成本高。這些表達系統(tǒng)還有一個共有的缺點，就是在構(gòu)建表達系統(tǒng)的過程中需要使用篩選標(biāo)記，一般都選擇抗生素篩選標(biāo)記，部分表達系統(tǒng)在生產(chǎn)使用的過程中仍然需要使用抗生素篩選標(biāo)記和抗生素篩選，這都會帶來一個問題——抗抗生素基因漂移，尤其是大規(guī)模生產(chǎn)的時候，將導(dǎo)致環(huán)境中耐藥致病菌的產(chǎn)生。

枯草芽孢桿菌是一種廣泛存在于水體、空氣、土壤中的革蘭氏陽性菌，其可以在環(huán)境不適宜的時候產(chǎn)生孢子，孢子可以抵御高溫、干旱等極端環(huán)境，待環(huán)境適宜時再萌發(fā)進行營養(yǎng)生長?？莶菅挎邨U菌的分泌能力強，在進行高密度發(fā)酵時，蛋白分泌量可以達到20—25g/L(Developments in the use of Bacillus species for industrial production，2004)。其發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶、淀粉酶、次黃嘌呤核苷、核糖甙等產(chǎn)品，早已經(jīng)進入我們的日常生活。由于其具有生物安全性，被FDA評委GRAS類添加劑，其生產(chǎn)的益生菌及利用其生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和養(yǎng)殖業(yè)中。

上世紀(jì)八十年代就開始利用枯草芽孢桿菌進行蛋白表達，其表達產(chǎn)物不僅包括細(xì)菌來源的各種酶類，如淀粉酶、蛋白酶、內(nèi)葡聚糖酶、脂肪酶等，還包括hEGF、IFN-alpha 2、Proinsulin、Streptavidin、cathelicidin-BF等不同來源的蛋白。利用枯草芽孢桿菌的分泌途徑，可將表達蛋白分泌到發(fā)酵液中，極大地降低了后期分離純化的難度?？莶菅挎邨U菌屬于革蘭氏陽性菌，不含有脂多糖，便于生產(chǎn)注射用藥品?？莶菅挎邨U菌的營養(yǎng)要求簡單，由于其已經(jīng)實現(xiàn)規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟，培養(yǎng)成本低。目前，枯草芽孢桿菌中的多個菌株及芽孢桿菌屬中的多個種都已經(jīng)完成了基因組測序工作，遺傳背景清楚，安全性高，也便于進行基因組改造。但是枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)并不是一個廣泛應(yīng)用的表達系統(tǒng)，還有許多缺點待克服。

枯草芽孢桿菌的模式菌168菌的野生型菌株已經(jīng)丟失，目前可以得到的菌株都是其突變體。盡管其滿足于科學(xué)研究的要求，但是其蛋白分泌能力差，是營養(yǎng)缺陷性突變體的特性，并不能滿足建立商業(yè)化表達系統(tǒng)的要求。目前建立的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)都是基于模式菌株168建立的，盡管野生型來源的菌株和已經(jīng)生產(chǎn)應(yīng)用的枯草芽孢桿菌種非常多，不易轉(zhuǎn)化都阻礙了對這些菌株的進一步改造?？莶菅挎邨U菌來源的質(zhì)粒也幾乎都是隱蔽性質(zhì)粒，不易構(gòu)建載體；來源于其它革蘭氏陽性菌的質(zhì)粒多數(shù)都是滾環(huán)復(fù)制性質(zhì)粒，在枯草芽孢桿菌中復(fù)制不穩(wěn)定，易丟失，拷貝數(shù)較少；這些特性都限制了直接使用質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達系統(tǒng)的可能性?？莶菅挎邨U菌有四種分泌途徑，Sec途徑、Tat途徑、Com系統(tǒng)和ABC轉(zhuǎn)運途徑，目前研究較清楚的是Sec途徑，一些表達系統(tǒng)也利用Sec途徑分泌表達蛋白。但是Sec途徑具有調(diào)控機制，會抑制不正確折疊的蛋白分泌，而外源蛋白一般折疊較慢，折疊過程需要伴侶蛋白的參與，容易被Sec分泌途徑降解。枯草芽孢桿菌還會分泌多達八種蛋白酶到發(fā)酵液中，其同樣會降解表達的目的蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種基于芽孢桿菌的無抗表達系統(tǒng)及構(gòu)建方法，其將低背景的木糖操縱子誘導(dǎo)表達的T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶再專一性轉(zhuǎn)錄T7啟動子后目的基因的級聯(lián)放大表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)入芽孢桿菌基因組中，并且刪除了中間使用的篩選標(biāo)記基因。其克服了抗生素篩選標(biāo)記基因易發(fā)生漂移，質(zhì)粒表達系統(tǒng)不穩(wěn)定，表達不可誘導(dǎo)表達量不高的缺點，建立了一種低背景可控誘導(dǎo)且高效表達的無抗表達系統(tǒng)。

解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種基于芽孢桿菌的無抗表達系統(tǒng)，其特征在于：將表達系統(tǒng)元件插入芽孢桿菌的基因組中，刪除抗性標(biāo)記元件，建立無抗的表達系統(tǒng)。避免抗生素篩選標(biāo)記基因漂移，其次可避免使用不穩(wěn)定的質(zhì)粒載體，提高系統(tǒng)穩(wěn)定性。

優(yōu)化方案所述表達系統(tǒng)為木糖—T7RNA聚合酶的級聯(lián)放大表達系統(tǒng)。建立了一種基于低背景的木糖操縱子誘導(dǎo)表達T7RNA聚合酶，T7RNA聚合酶再特異性轉(zhuǎn)錄T7啟動子后目的基因的級聯(lián)放大表達系統(tǒng)，可有效解決可控誘導(dǎo)和增加表達量的問題，并且該表達系統(tǒng)利用溫度敏感質(zhì)粒pBAV1K的復(fù)制特性，被成功導(dǎo)入芽孢桿菌中的基因組中，刪除抗生素標(biāo)記基因，為低背景可控誘導(dǎo)且高效表達的無抗的表達系統(tǒng)。

所述表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法的具體步驟如下：

(1)PCR擴增wprA基因上游片段wprA-F和wprA基因下游片段wprA下游片段wprA-R，全基因合成xylR操縱子的xylR基因啟動子及CDS區(qū)域和xylAB的啟動子區(qū)域(xylR)，全基因合成T7RNA聚合酶基因的CDS片段(T7RP)，通過同源重組構(gòu)建載體pBTS-T7RP。

pBTS-T7RP載體中的wprA基因片段，可以被芽孢桿菌基因組中的任意片段替換掉，其僅作為xylR-T7RP片段的插入位點，但是最佳片段為wprA基因片段，其可以敲除wprA基因，敲除后可以促進分泌蛋白分泌到發(fā)酵液中。

(2)轉(zhuǎn)化pBTS-T7RP質(zhì)粒進入枯草芽孢桿菌Z12，通過限制性培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，分別在wprA-F和wprA-R兩個片段處完成兩次重組，得到不具有抗性的含有xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP。

(3)PCR擴增xylAB基因上游片段xyl-F和xylAB基因下游片段xyl-R，全基因合成T7啟動子(PT7)、xylR結(jié)合位點、RBS位點、多克隆位點(MCS)和T7終止子片段(T7ter)，通過同源重組，構(gòu)建pBTS-FR載體。

pBTS-FR載體中的xylAB基因片段，可以被芽孢桿菌基因組中的任意片段替換掉，其僅作為T7啟動子終止子等片段的插入位點，但是最佳的片段為xylAB基因片段，其可以敲除木糖代謝基因，促進誘導(dǎo)表達。

(4)通過PCR擴增或者全基因合成任一需要表達的基因片段，通過酶切或者同源重組等方式插入到pBTS-FR的多克隆位點，構(gòu)建表達載體pBTS-FR-X。

(5)轉(zhuǎn)化pBTS-FR-X質(zhì)粒進入枯草芽孢桿菌ZT7RP菌株，通過限制性培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)，分別在xyl-F和xyl-R兩個片段處完成兩次重組，得到不具有抗性的含有PT7-X-T7ter片段的菌株Z-X。

(6)接種Z-X到培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為25-40℃，接種后0-8h加入0.01％-1％濃度的木糖進行誘導(dǎo)，如果培養(yǎng)基成分中含有木糖，可適當(dāng)減少木糖添加量或者不添加木糖，培養(yǎng)一定時間后，即可收獲菌體或者發(fā)酵液中的目標(biāo)蛋白。

所述步驟(2)中菌株為枯草芽孢桿菌Z12菌株、其它芽孢桿菌和pBTS質(zhì)粒進行溫敏復(fù)制的革蘭氏陽性菌株。

所述其它芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌。

所述步驟(4)中的表達載體還包括含有信號肽的表達載體，其將枯草芽孢桿菌的信號肽序列，尤其是sec途徑中的信號肽，插入到待表達目的基因前，該融合蛋白在表達的時候?qū)⑼ㄟ^枯草芽孢桿菌的分泌途徑直接將目的蛋白分泌到發(fā)酵液中。

所述pBTS-T7RP核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述pBTS-FR核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明中的表達系統(tǒng)的有益效果如下：

A、該表達系統(tǒng)的表達菌株，不含有抗性標(biāo)記片段，避免了在大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)時，表達菌株中的抗性標(biāo)記片段通過基因漂移到其它致病菌中，產(chǎn)生耐藥性致病菌的危險。

B、該表達系統(tǒng)的的表達系統(tǒng)元件已經(jīng)插入到芽孢桿菌的基因組中，可以隨基因組繼續(xù)穩(wěn)定復(fù)制，避免采用質(zhì)粒載體時，表達菌株不能穩(wěn)定傳代的缺點。

C、該表達系統(tǒng)利用木糖誘導(dǎo)T7RNA聚合酶表達，T7RNA聚合酶專一性表達T7啟動子后目的基因的級聯(lián)放大表達系統(tǒng)，其具有表達量大，表達量可通過誘導(dǎo)進行調(diào)控的優(yōu)點。

D、表達系統(tǒng)中含有xylR基因，其可增加芽孢桿菌xylR蛋白的量，在培養(yǎng)基中不含有木糖的情況下，可特異性地結(jié)合到T7RNA聚合酶前的xylR結(jié)合位點和待表達目的基因前的xylR結(jié)合位點，抑制T7RNA聚合酶和待表達目的基因的表達，整個表達系統(tǒng)的背景表達量極低，這樣可以利用該表達系統(tǒng)表達一些具有毒性的目的蛋白。

E、該表達系統(tǒng)不僅可以進行胞內(nèi)蛋白表達，也可以進行胞外表達，具有非常高的靈活性。

F、該表達系統(tǒng)的菌株為枯草芽孢桿菌菌株，其具有生物安全性高的特點。

附圖說明

圖1：pBTS-T7RP結(jié)構(gòu)圖

圖2：pBTS-FR結(jié)構(gòu)圖

圖3：pBTS-FR-GFP結(jié)構(gòu)圖

圖4：Z12和ZGFP菌株表達效果圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)描述:

實施例1

1、通過EcoR I和Apa I內(nèi)切酶切割pBAV1K-T5-GFP質(zhì)粒，與合成的MCS片段進行同源重組，得到質(zhì)粒pBAV1K。

本實驗及后續(xù)試驗中的內(nèi)切酶采用Thermo公司的快速內(nèi)切酶，片段回收采用成都福際生物公司的膠回收試劑盒(DE-02011)，MCS片段由金唯智生物科技有限公司合成(序列如SEQ ID NO.4所示)，同源重組采用天根的EsayGeno快速重組克隆試劑盒(VI201-02)，大腸桿菌菌株為top10，制備感受態(tài)采用KCM法，質(zhì)粒抽提采用福際生物的通用質(zhì)粒小量提取試劑盒(DE-01001)。

2、設(shè)計引物，擴增同義突變刪除Nde I酶切位點的pBAV1K片段，采用同源重組克隆的方式連接片段，獲得質(zhì)粒命名為pBTS。

本實驗及后續(xù)實驗中的引物由金唯智生物科技有限公司合成提供。

實施例2：

1、設(shè)計引物擴增wprA基因上游602bp的片段wprA-F；設(shè)計引物擴增wprA下游601bp的片段wprA-R；全基因合成xylR啟動子以及CDS和xylAB的啟動子區(qū)域片段xylR；全基因合成T7RNA聚合酶片段T7RP；通過同源重組構(gòu)建載體pBTS-T7RP。

高保真酶采用toyobo的KOD-Plus高保真性聚合酶(KOD-201)。

2、電轉(zhuǎn)化pBTS-T7RP進入Z12菌株，得到菌Z12-pBTS-T7RP。

3、取菌Z12-pBTS-T7RP接種到3ml LB培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌Z12-pBTS做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若Z12-pBTS沒有菌落生長，Z12-pBTS-T7RP有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為Z12-pBTS-T7RP-45。

5、接菌Z12-pBTS-T7RP-45到3ml LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組(成都福際生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DE-05311)，PCR擴增xylR-T7RP片段進行驗證(成都福際生物技術(shù)有限公司，2×快速PCR反應(yīng)預(yù)混體系，DP-20041)。

6、取5中驗證為陽性的Z12-pBTS-T7RP-45菌株，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代10次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的LB平板上，得到單菌落。

7、取5中的單菌落，同時劃線到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過PCR擴增xylR-T7RP片段驗證同源重組結(jié)果(野生型或者插入T7RP片段)。取陽性的片段，進行測序驗證后得到陽性的菌株即為插入xylR-T7RP片段的菌株ZT7RP。

實施例3：

1、菌株轉(zhuǎn)化方法參見高滲轉(zhuǎn)化法(High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis，1999)。取待轉(zhuǎn)化菌株的新劃線單菌落，接種到約3ml GM(LB+0.5M山梨糖醇)培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)。第二天早上按1:100接種到50ml GM培養(yǎng)基中，37℃，180rpm培養(yǎng)，待菌液生長到OD達到0.85-0.95之間時，將菌液放到冰上預(yù)冷10min；4℃，5000g，5min，離心去上清，用等體積預(yù)冷的EM(0.5M山梨糖醇+0.5M甘露糖醇+10％甘油水溶液)重懸菌體，再次4℃，5000g，5min，離心去上清，一共重復(fù)洗滌4次；加入約1/40體積的EM重懸菌體，保證菌液濃度在1-1.3×10¹⁰cfu/ml之間。取60ul上述菌液，加入1ul待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，質(zhì)粒濃度大于100ng/ul，吹打混勻，然后加入預(yù)冷的1mm電擊杯。電轉(zhuǎn)化儀(Eppendorf Eporator)參數(shù)設(shè)定，2.1kV，實際電擊時間在4.0-5.0ms時，才可能有轉(zhuǎn)化菌落生長。電擊后。立即加1ml RM(LB+0.5M山梨糖醇+0.38M甘露糖醇)，吹打混勻，轉(zhuǎn)入5ml無菌離心管中，37℃，180rpm培養(yǎng)3h。將菌液離心，去上清后按一定比例稀釋，取200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，同時涂布未經(jīng)電轉(zhuǎn)化的菌液做陰性對照。第二天早上觀察菌落生長情況，若轉(zhuǎn)化板有菌落生長，陰性對照沒有，則表明轉(zhuǎn)化成功。

實施例4：

1、設(shè)計引物擴增xylAB基因上游493bp片段xyl-F；設(shè)計引物擴增xylAB基因下游585bp片段xyl-R；全基因合成T7啟動子、xylR結(jié)合位點、RBS位點、多克隆位點、T7 終止子位點片段；通過同源重組上述三個片段與pBTS載體連接，構(gòu)建質(zhì)粒pBTS-FR。

實施例5：

1、全基因合成信號肽SPwapA和綠色熒光蛋白(GFP)片段，形成融合蛋白表達片段SPwapA-GFP，通過同源重組插入到pBTS-FR載體中，構(gòu)建成載體pBTS-FR-GFP。pBTS-FR-GFP核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、電轉(zhuǎn)化pBTS-FR-GFP進入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP接種到3ml LB培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌ZT7RP-pBTS做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若Z12-pBTS沒有菌落生長，ZT7RP-pBTS-FR-GFP有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為ZT7RP-pBTS-FR-GFP-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP-45到3ml LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組(成都福際生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DE-05311)，PCR擴增xyl片段進行驗證(成都福際生物技術(shù)有限公司，2×快速PCR反應(yīng)預(yù)混體系，DP-20041)。

6、取5中驗證為陽性的Z12-pBTS-FR-GFP-45菌株，接種到3ml LB基中37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代10次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的LB平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過PCR擴增GFP片段驗證同源重組結(jié)果(野生型或者插入GFP基因)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進一步進行測序驗證，得到陽性的菌株即為插入GFP基因的菌株ZGFP。

7、取ZGFP菌株同時劃線到LB平板和LB平板+0.25％木糖，另劃線Z12做對照，37℃過夜培養(yǎng)。觀察發(fā)現(xiàn)添加木糖誘導(dǎo)的ZGFP菌株有明顯的綠色熒光蛋白表達，未添加木糖誘導(dǎo)的ZGFP菌株沒有綠色熒光蛋白表達；Z12菌株不管在什么培養(yǎng)基中，都沒有綠色熒光蛋白表達。詳見附件圖4。

8、接種ZGFP菌株到3ml液體LB培養(yǎng)基和3ml液體LB培養(yǎng)基+0.25％木糖，另接種Z12做對照。37℃，180rpm培養(yǎng)24h，離心去掉菌體沉淀，可以看到ZGFP菌添加木糖誘導(dǎo)后，發(fā)酵液呈現(xiàn)綠色熒光，但是未誘導(dǎo)的ZGFP菌株和Z12菌株發(fā)酵液并未出現(xiàn)綠色熒光。

實施例6：

1、全基因合成綠色熒光蛋白(GFP)片段，通過同源重組插入到pBTS-FR載體中，構(gòu)建成載體pBTS-FR-GFP2。

2、電轉(zhuǎn)化pBTS-FR-GFP2進入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2接種到3ml LB培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌ZT7RP-pBTS做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若Z12-pBTS沒有菌落生長，ZT7RP-pBTS-FR-GFP2有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為ZT7RP-pBTS-FR-GFP2-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-GFP2-45到3ml LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組(成都福際生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DE-05311)，PCR擴增xyl片段進行驗證(成都福際生物技術(shù)有限公司，2×快速PCR反應(yīng)預(yù)混體系，DP-20041)。

6、取5中驗證為陽性的Z12-pBTS-FR-GFP2-45菌株，接種到3ml LB基中37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代10次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的LB平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過PCR擴增GFP片段驗證同源重組結(jié)果(野生型或者插入GFP基因)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進一步進行測序驗證，得到陽性的菌株即為插入GFP基因的菌株ZGFP2。

7、接種ZGFP2菌株到3ml液體LB培養(yǎng)基和3ml液體LB培養(yǎng)基+0.25％木糖，另接種Z12做對照。37℃，180rpm培養(yǎng)24h，離心去掉上清，可以看到ZGFP2菌添加木糖誘導(dǎo)后，菌體呈現(xiàn)綠色熒光，但是未誘導(dǎo)的ZGFP2菌株和Z12菌株的菌體并未出現(xiàn)綠色熒光。

實施例7：

1、全基因合成BPN蛋白酶基因(BPN是解淀粉芽孢桿菌的蛋白酶基因，本身含有信號肽，可以直接分泌到發(fā)酵液中)片段，通過NdeI和XhoI酶切插入到pBTS-FR載體中，構(gòu)建成載體pBTS-FR-BPN。

2、電轉(zhuǎn)化pBTS-FR-BPN進入ZT7RP菌株，得到菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN。

3、取菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN接種到3ml LB培養(yǎng)基中，45℃，180rpm，培養(yǎng)24h；另接菌ZT7RP-pBTS做對照。

4、取3中的菌液200ul涂布到含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，45℃過夜培養(yǎng)。若Z12-pBTS沒有菌落生長，ZT7RP-pBTS-FR-BPN有菌落生長，則得到的菌株完成第一次重組，命名為ZT7RP-pBTS-FR-BPN-45。

5、接菌ZT7RP-pBTS-FR-BPN-45到3ml LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，抽提基因組(成都福際生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，DE-05311)，PCR擴增BPN片段進行驗證(成都福際生物技術(shù)有限公司，2×快速PCR反應(yīng)預(yù)混體系，DP-20041)。

6、取5中驗證為陽性的Z12-pBTS-FR-BPN-45菌株，接種到3ml LB基中37℃，180rpm培養(yǎng)，每隔8-16h傳代一次，連續(xù)傳代8次后，取菌液稀釋10⁶倍，涂布于無抗的LB平板上，得到單菌落。

7、取6中的單菌落，同時劃線到LB和含有30mg/L卡那霉素的LB平板上，篩選無抗的菌落，需要得到5-10株無抗菌落。

8、取7中的無抗菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37℃，180rpm過夜培養(yǎng)，抽提細(xì)菌基因組，通過PCR擴增BPN片段驗證同源重組結(jié)果(野生型或者插入BPN基因)。取陽性的片段，送金唯智生物科技有限公司進一步進行測序驗證，得到陽性的菌株即為插入BPN基因的菌株ZBPN。

7、接種ZBPN菌株到3ml液體LB培養(yǎng)基和3ml液體LB培養(yǎng)基+0.25％木糖，另接種Z12 做對照。37℃，180rpm培養(yǎng)24h，離心去掉菌體沉淀，采用SB/T 10317-1999中的方法測定上清液中的酶活，確認(rèn)ZBPN菌株誘導(dǎo)后酶活達到約1000U/ml，未誘導(dǎo)的ZBPN菌株以及Z12菌株的酶活都低于檢測限。

8、針對ZBPN菌株進行發(fā)酵優(yōu)化，最終確定最佳培養(yǎng)條件如下：接種量為1％；培養(yǎng)基為豆粕粉25g/L,玉米漿粉5g/L，磷酸二氫鉀5g/L，pH8.5，121℃滅菌；培養(yǎng)溫度為30℃；250ml錐形瓶中含有30ml培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)速為200rpm；在接種同時加入0.25％的木糖進行誘導(dǎo)；培養(yǎng)36h時，BPN蛋白酶酶活可以達到最大值，可以達到約15000U/ml。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都美溢德生物技術(shù)有限公司

<120> 一種基于芽孢桿菌的無抗表達系統(tǒng)及構(gòu)建方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 8118

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS序列

<400> 1

gacgtcgaattcgaggtacctgcggccgcaaaattcttgcggtcaggtgacaaaattgatattacaattgacccgatcggaacgctgtcaaaccaaattggctgaataaaactggagggcggacccggacccgcccgttttttctgacaatcatctttgtggcagaggacaagttcatggtactataagtggggtaatttatctgatagggggaacatatatgacacacctacatattacaacatgggtggtagcgctgattctgcttttcgtcagctactcgctgtattcgtcaggaagtgcaaagggcgcaaaaatcactcatatgattctgcggttattctatatccttattattttgacaggagctgagctgtttgtccgtttcgccaactggaacggagaatacgccggcaaaatgattctgggcattatcaccatcggcctgatggaaatgctcctcatccgcaagaaaaaagaaaaatcaacaggaggcctgtggatcggcttcgtcgttgtccttttgctgacagtgctgctcggtctgcatttgccaatcggttttcaattgttttaatagaaaaacctatgaacccggctctttgatagttaattcagaacgctcggttgccgccgggcgttttttatgcagcaatggcaagaacgtcccggggagctcctaacttataggggtaacacttaaaaaagaatcaataacgatagaaaccgctcctaaagcaggtgcattttttcctaacgaagaaggcaatagttcacatttattgtctaaatgagaatggactctagaagaaacttcgtttttaatcgtatttaaaacaatgggatgagattcaattatatgatttctcaagataacagcttctatatcaaatgtattaaggatattggttaatccaattccgatataaaagccaaagttttgaagtgcatttaacatttctacatcatttttatttgcgcgttccacaatctcttttcgagaaatattcttttcttctttagagagcgaagccagtaacgctttttcagaagcatataattcccaacagcctcgatttccacagctgcatttgggtccattaaaatctatcgtcatatgacccatttccccagaaaaaccctgaacacctttatacaattcgttgttaataacaagtccagttccaattccgatattaatactgatgtaaacgatgttttcatagttttttgtcataccaaatactttttcaccgtatgctcctgcattagcttcattttcaacaaaaaccggaacattaaactcactctcaattaaaaactgcaaatctttgatattccaatttaagttaggcatgaaaataatttgctgatgacgatctacaaggcctggaacacaaattcctattccgactagaccataaggggactcaggcatatgggttacaaaaccatgaataagtgcaaataaaatctcttttacttcactagcggaagaactagacaagtcagaagtcttctcgagaataatatttccttctaagtcggttagaattccgttaagatagtcgactcctatatcaataccaatcgagtagcctgcattcttattaaaaacaagcattacaggtcttctgccgcctctagattgccctgccccaatttcaaaaataaaatctttttcaagcagtgtatttacttgagaggagacagtagacttgtttaatcctgtaatctcagagagagttgccctggagacaggggagttcttcaaaatttcatctaatattaatttttgattcattttttttactaaagcttgatctgcaatttgaataataaccactcctttgtttatccaccgaactaagttggtgttttttgaagcttgaattagatatttaaaagtatcatatctaatattataactaaattttctaaaaaaaacattgaaataaacatttattttgtatatgatgagataaagttagtttattggataaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacaaatgaacacgattaacatcgctaagaacgacttctctgacatcgaactggctgctatcccgttcaacactctggctgaccattacggtgagcgtttagctcgcgaacagttggcccttgagcatgagtcttacgagatgggtgaagcacgcttccgcaagatgtttgagcgtcaacttaaagctggtgaggttgcggataacgctgccgccaagcctctcatcactaccctactccctaagatgattgcacgcatcaacgactggtttgaggaagtgaaagctaagcgcggcaagcgcccgacagccttccagttcctgcaagaaatcaagccggaagccgtagcgtacatcaccattaagaccactctggcttgcctaaccagtgctgacaatacaaccgttcaggctgtagcaagcgcaatcggtcgggccattgaggacgaggctcgcttcggtcgtatccgtgaccttgaagctaagcacttcaagaaaaacgttgaggaacaactcaacaagcgcgtagggcacgtctacaagaaagcatttatgcaagttgtcgaggctgacatgctctctaagggtctactcggtggcgaggcgtggtcttcgtggcataaggaagactctattcatgtaggagtacgctgcatcgagatgctcattgagtcaaccggaatggttagcttacaccgccaaaatgctggcgtagtaggtcaagactctgagactatcgaactcgcacctgaatacgctgaggctatcgcaacccgtgcaggtgcgctggctggcatctctccgatgttccaaccttgcgtagttcctcctaagccgtggactggcattactggtggtggctattgggctaacggtcgtcgtcctctggcgctggtgcgtactcacagtaagaaagcactgatgcgctacgaagacgtttacatgcctgaggtgtacaaagcgattaacattgcgcaaaacaccgcatggaaaatcaacaagaaagtcctagcggtcgccaacgtaatcaccaagtggaagcattgtccggtcgaggacatccctgcgattgagcgtgaagaactcccgatgaaaccggaagacatcgacatgaatcctgaggctctcaccgcgtggaaacgtgctgccgctgctgtgtaccgcaaggacaaggctcgcaagtctcgccgtatcagccttgagttcatgcttgagcaagccaataagtttgctaaccataaggccatctggttcccttacaacatggactggcgcggtcgtgtttacgctgtgtcaatgttcaacccgcaaggtaacgatatgaccaaaggactgcttacgctggcgaaaggtaaaccaatcggtaaggaaggttactactggctgaaaatccacggtgcaaactgtgcgggtgtcgataaggttccgttccctgagcgcatcaagttcattgaggaaaaccacgagaacatcatggcttgcgctaagtctccactggagaacacttggtgggctgagcaagattctccgttctgcttccttgcgttctgctttgagtacgctggggtacagcaccacggcctgagctataactgctcccttccgctggcgtttgacgggtcttgctctggcatccagcacttctccgcgatgctccgagatgaggtaggtggtcgcgcggttaacttgcttcctagtgaaaccgttcaggacatctacgggattgttgctaagaaagtcaacgagattctacaagcagacgcaatcaatgggaccgataacgaagtagttaccgtgaccgatgagaacactggtgaaatctctgagaaagtcaagctgggcactaaggcactggctggtcaatggctggcttacggtgttactcgcagtgtgactaagcgttcagtcatgacgctggcttacgggtccaaagagttcggcttccgtcaacaagtgctggaagataccattcagccagctattgattccggcaagggtctgatgttcactcagccgaatcaggctgctggatacatggctaagctgatttgggaatctgtgagcgtgacggtggtagctgcggttgaagcaatgaactggcttaagtctgctgctaagctgctggctgctgaggtcaaagataagaagactggagagattcttcgcaagcgttgcgctgtgcattgggtaactcctgatggtttccctgtgtggcaggaatacaagaagcctattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttccgcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgagattgatgcacacaaacaggagtctggtatcgctcctaactttgtacacagccaagacggtagccaccttcgtaagactgtagtgtgggcacacgagaagtacggaatcgaatcttttgcactgattcacgactccttcggtaccattccggctgacgctgcgaacctgttcaaagcagtgcgcgaaactatggttgacacatatgagtcttgtgatgtactggctgatttctacgaccagttcgctgaccagttgcacgagtctcaattggacaaaatgccagcacttccggctaaaggtaacttgaacctccgtgacatcttagagtcggacttcgcgttcgcgtaaggtcaacaagctggaaagcactcaaacagctgtcagagggaacgcgaaggaaggcacacttatcgaggtgatgaacggcaaaaagaaactcggcagcgccaaagccggaaaagacaatgcgttcaaggttaatatcgcgactcaaaaacaggatcaagtactgtatgtgaaagcaacaaaaggcgatgcgaaaacatcgtataaagttgtcgtcgtcaaaggaaaaccttccggcacaccgaaagtaaacgcggtgaaaacgaaggatacggcagtaaaagggaaggcaaacagcaaagcgatgatcagagtgaaaaacaaatcaaagaaagtcattgcttctgccaaagctgacgcaaaaggaacgttttcggtgaaaatcaaaaaacaaaaagccggaacggtgctgtacgtcacggctgcggatacagataaaaaagaaagcaaggaagcaaaagtggttgttgaaaagtaaccaaaaagcggtgctcgatgcaccgcttttttatttgcgcccccgttggactgctgaatacataatggatcgctttccgtttgaagctgtccattcaaaacggtctcctgtcccttcgctgctgtactgcagtgaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 8118

<210> 2

<211> 4089

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS-FR序列

<400> 2

gacgtcgaattccaaaatgtctttcgttatttctggagaattggattccaaatggcagtattgatcaagaacgatcgttccttcaaggtctgttaaaatgccattgatataatccacaccaacatctattcctacggagtatcctgcctttttattaaaaacaagcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccagattttctttcattaacgtgtttacctgtgatgaaacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaataggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcgatatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatgaacatagtacatagcgaatcttccctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgatgaggttaatacgactcactatagggaattgtagttagtttacaattccaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacatatgagtctgcagagttctagactaggtaccatgctcgaggccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgtttgagggcaataatggaaggtatcacattctctttacatgaatcaattgagctattccgcgaagcgggaaaatcagttcatactgttgtttctattggtgggggagctaaaaatgatacgtggctgcaaatgcaagctgatattttcaatacgagggtaattaagttagaaaatgaacaagggccagctatgggggctgcaatgctggctgcctttggaagcggatggtttgaatcccttgaagaatgtgcagagcagttcattcgtgaggctgctgcattttatccaaaggcgcaaaatgttcaaaaatataaaacactatttgatttgtataagaacatttatactcacacaaaggatctcaatcaagctttgaagagctttcgaaaaaactaatgatgttattgtctggagatcaaccgaagaacaattaatgatcaatcatcatcaaaggcctttgatgacatggctgccttcttttgaaaagatggtgagaataaggtatcgcaacctttaaacagtattggagtgtccagcagacaaaacgaacgagcggaaccgtattttgtcagcgaacactaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 4089

<210> 3

<211> 4907

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS-FR-GFP序列

<400> 3

gacgtcgaattccaaaatgtctttcgttatttctggagaattggattccaaatggcagtattgatcaagaacgatcgttccttcaaggtctgttaaaatgccattgatataatccacaccaacatctattcctacggagtatcctgcctttttattaaaaacaagcatgacaggtcttcttccgccacttgattgtccttgacctatttcaaataccagattttctttcattaacgtgtttacctgtgatgaaacagttgatttatttaatccagtcatttcagataattttgctcttgaaataggtgaatttttaaggatttcttttaataataacttttgatttacttttttgacaaaggtttgatcagcgatatccacttcatccactccatttgtttaatctttaaattaagtatgaacatagtacatagcgaatcttccctttattatatctaatgtgttcataaaaaactaaaaaaaatattgaaaatactgatgaggttatataagatgaataatacgactcactataggggaattgtagttagtttacaattccaacaaactaactcaattaagatagttgatggataaacttgttcacttaaatcaaaggaggtgatgacatatgaaaaaaagaaagaggcgaaactttaaaaggttcattgcagcatttttagtgttggctttaatgatttcattagtgccagccgatgtactagcagccatgcgtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcactactctgacgtatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacggtatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttcaaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaactcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtcgacacaatctgcccttttgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtccttcttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataatctagagcatctgctgaaaaactcgaggccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgtttgagggcaataatggaaggtatcacattctctttacatgaatcaattgagctattccgcgaagcgggaaaatcagttcatactgttgtttctattggtgggggagctaaaaatgatacgtggctgcaaatgcaagctgatattttcaatacgagggtaattaagttagaaaatgaacaagggccagctatgggggctgcaatgctggctgcctttggaagcggatggtttgaatcccttgaagaatgtgcagagcagttcattcgtgaggctgctgcattttatccaaaggcgcaaaatgttcaaaaatataaaacactatttgatttgtataagaacatttatactcacacaaaggatctcaatcaagctttgaagagctttcgaaaaaactaatgatgttattgtctggagatcaaccgaagaacaattaatgatcaatcatcatcaaaggcctttgatgacatggctgccttcttttgaaaagatggtgagaataaggtatcgcaacctttaaacagtattggagtgtccagcagacaaaacgaacgagcggaaccgtattttgtcagcgaacactaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 4907

<210> 4

<211> 2847

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<223> pBTS（含MCS片段）序列

<400> 4

gacgtcgaattcgaggtacctgcggccgcaggatccatctagacgctcgagagctgcagtgaagcttcagggcccgatcgatgccgccgcttaattaattaatccagaggcatcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatccgccgccctagacctagtgtcattttatttcccccgtttcagcatcaagaacctttgcataacttgctctatatccacactgataattgccctcaaaccataatctaaaggcgctagagtttgttgaaacaatatcttttacatcattcgtatttaaaattccaaactccgctcccctaaggcgaataaaagccattaaatcttttgtatttaccaaattatagtcatccactatatctaagagtaaattcttcaattctcttttttggctttcatcaagtgttatatagcggtcaatatcaaaatcattaatgttcaaaatatcttttttgtcgtatatatgtttattcttagcaatagcgtcctttgattcatgagtcaaatattcataagaacctttgatataatcaagtatctcaacatgagcaactgaactattccccaattttcgcttaatcttgttcctaacgctttctattgttacaggatttcgtgcaatatatataacgtgatagtgtggttttttatagtgctttccatttcgtataacatcactactattccatgtatctttatcttttttttcgtccatatcgtgtaaaggactgacagccatagatacgcccaaactctctaatttttccttccaatcattaggaattgagtcaggatataataaaaatccaaaatttctagctttagtatttttaatagccatgatataattaccttatcaaaaacaagtagcgaaaactcgtatccttctaaaaacgcgagctttcgcttattttttttgttctgattcctttcttgcatattcttctatagctaacgccgcaaccgcagattttgaaaaacctttttgtttcgccatatctgttaattttttatcttgctcttttgtcagagaaatcataactctttttttcgattctgaaatcaccatttaaaaaactccaatcaaataattttataaagttagtgtatcactttgtaatcataaaaacaacaataaagctacttaaatatagatttataaaaaacgttggcgaaaacgttggcgattcgttggcgattgaaaaaccccttaaacccttgagccagttgggatagagcgtttttggcacaaaaattggcactcggcacttaatggggggtcgtagtacggaagcaaaattcgcttcctttccccccatttttttccaaattccaaatttttttcaaaaattttccagcgctaccgctcggcaaaattgcaagcaatttttaaaatcaaacccatgagggaatttcattccctcatactcccttgagcctcctccaaccgaaatagaagggcgctgcgcttattatttcattcagtcatcggctttcataatctaacagacaacatcttcgctgcaaagccacgctacgctcaagggcttttacgctacgataacgcctgttttaacgattatgccgataactaaacgaaataaacgctaaaacgtctcagaaacgattttgagacgttttaataaaaaatcgcctagtgcttggattctcaccaataaaaaacgcccggcggcaaccgagcgttctgaacaaatccagatggagttctgaggtcattactggatctatcaacaggagtccaagcgagctcggtactaaaacaattcatccagtaaaatataatattttattttctcccaatcaggcttgatccccagtaagtcaaaaaatagctcgacatactgttcttccccgatatcctccctgatcgaccggacgcagaaggcaatgtcataccacttgtccgccctgccgcttctcccaagatcaataaagccacttactttgccatctttcacaaagatgttgctgtctcccaggtcgccgtgggaaaagacaagttcctcttcgggcttttccgtctttaaaaaatcatacagctcgcgcggatctttaaatggagtgtcttcttcccagttttcgcaatccacatcggccagatcgttattcagtaagtaatccaattcggctaagcggccgtctaagctattcgtatagggacaatccgatatgtcgatggagtgaaagagcctgatgcactccgcatacagctcgatagtcttttcagggctttgttcatcttcatacccttccgagcaaaggacgccatcggcctcactcatgagcagattgctccagccatcatgccgttcaaagtgcaggacctttggaacaggcagctttccttccagccatagcatcatgtccttttcccgttccacatcataggtggtccctttataccggctgtccgtcatttttaaatataggatttcattttctcccaccagcttatataccttagcaggagacattccttccgtatcttttacgcagcggtattcttcgatcagttttttcaattccggtgatattctcattttagccatttattatttccttcctcttttctacagtatttaaagataccccaagaagctaattataacaagacgaactccaattcactgttccttgcattctaaaaccttaaatacagaaaacagccttttcaaagttgttttcaaagttggcgtataacatagtatcgacggagccgattttgaaaccacaattatgatagaattt 2847