本發(fā)明涉及一種β-丙氨酸的制備，特別涉及一種利用隨機(jī)突變獲得系列panD突變基因、編碼蛋白、載體、工程菌及其應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

β-丙氨酸，又稱β-氨基丙酸，由Ross和Monroe于1972年首次發(fā)現(xiàn)，是自然界中唯一的β型氨基酸。β-丙氨酸是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間體，用于泛酸鈣、肌肽、甜味劑等的合成，還被用作水的凈化絮凝劑、電鍍緩蝕劑等。目前，β-丙氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過化學(xué)法合成，根據(jù)合成原料的不同可分為丙烯腈法、丙烯酸法、琥珀酰亞胺降解法、β-氨基丙腈法等?；瘜W(xué)合成成本高、工藝要求嚴(yán)苛、產(chǎn)生大量腈類等有毒副產(chǎn)物，既不利于產(chǎn)品的分離純化，又會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染。

L-天冬氨酸α-脫羧酶(L-aspartate-α-decarboxylase,簡(jiǎn)稱PanD)能催化脫去L-天冬氨酸的α-羧基，產(chǎn)生β-丙氨酸和二氧化碳，因此，PanD能被用來(lái)生物法制備β-丙氨酸。上世紀(jì)七八十年代，Nakano、Williamson、Cronan等研究團(tuán)隊(duì)先后發(fā)現(xiàn)大腸桿菌能利用細(xì)胞內(nèi)PanD合成β-丙氨酸，并對(duì)該酶的晶體結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理進(jìn)行了研究。鑒于天然PanD的活性比較低，直接從自然界中獲得產(chǎn)酶活力高的菌株比較困難，美國(guó)NSC技術(shù)有限公司在1996年首次通過基因重組技術(shù)，對(duì)大腸桿菌來(lái)源的panD基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，用于拆分DL-天冬氨酸。1999年，德國(guó)Dusch等人首次將谷氨酸棒桿菌來(lái)源的panD基因分別克隆到大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌中表達(dá)。發(fā)明專利(裘娟萍、高麗娟；一種產(chǎn)β-丙氨酸的基因工程菌及其制備與應(yīng)用；申請(qǐng)?zhí)枺?00610155551.0；申請(qǐng)日：2006-12-28)也公開了一株大腸桿菌panD基因在大腸桿菌中重組表達(dá)的菌株(保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO：M206114)，并用于生物法制備β-丙氨酸。

盡管panD基因的重組表達(dá)在一定程度上提高了其在生物法制備β-丙氨酸中的能力，但天然序列和結(jié)構(gòu)的PanD的重組表達(dá)量和活力目前還不夠高，這限制了PanD在生物法制備β-丙氨酸中的應(yīng)用。針對(duì)這個(gè)問題，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)panD基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變，以期研究PanD序列與功能的關(guān)系，為提高PanD的活力提供理論基礎(chǔ)。定點(diǎn)突變是一種基于理性設(shè)計(jì)的分子改造。理性設(shè)計(jì)改善酶蛋白的酶學(xué)性質(zhì)需要基于對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制的掌握，根據(jù)蛋白的空間結(jié)構(gòu)知識(shí)確定關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行取代、插入和缺失突變。因此，有效的理性設(shè)計(jì)需要大量的酶蛋白的信息、豐富的生物、物理和化學(xué)等學(xué)科知識(shí)儲(chǔ)備及開闊的思維方式，往往難度較大；而且定點(diǎn)突變每次只有少數(shù)位點(diǎn)發(fā)生突變，對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的改造有限。相對(duì)而言，基于易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變可在特定編碼序列的多個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)突變，事先不需要對(duì)所改造蛋白的結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制有深入了解，故其是一種較為理想的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化方法。到目前為止，還未見用易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變對(duì)PanD進(jìn)行分子改造獲得高活力PanD酶應(yīng)用于β-丙氨酸的制備。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是用易錯(cuò)PCR的隨機(jī)突變改變panD基因的密碼子堿基，從而提高重組大腸桿菌PanD的表達(dá)量，提供一系列panD突變基因和編碼蛋白及提供一種高產(chǎn)PanD、制備β-丙氨酸的方法。

為了達(dá)到本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種panD突變基因，所述panD突變基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6之一所示，對(duì)應(yīng)的panD突變基因所編碼蛋白的氨基酸序列分別為SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

本發(fā)明還涉及一種所述panD突變基因構(gòu)建的重組載體及重組載體轉(zhuǎn)化制備的重組基因工程菌。

此外，本發(fā)明還提供一種所述panD突變基因編碼蛋白在生物法制備β-丙氨酸中的應(yīng)用，所述應(yīng)用以含panD突變基因的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以L-天冬氨酸為底物，以pH值為6～8(優(yōu)選為7.0)的水為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，于25～80℃，50～250rpm搖床轉(zhuǎn)化12～72h(優(yōu)選37℃、200rpm搖床轉(zhuǎn)化48h)，使L-天冬氨酸脫羧，產(chǎn)生β-丙氨酸，轉(zhuǎn)化結(jié)束，轉(zhuǎn)化液分離純化，獲得β-丙氨酸。

進(jìn)一步，所述濕菌體用量以反應(yīng)體系體積計(jì)為2～50g/L，優(yōu)選2g/L；所述底物終濃度以反應(yīng)體系體積計(jì)為0.01～5mol/L，優(yōu)選0.2mol/L。

進(jìn)一步，所述酶源按如下步驟制備：(1)斜面培養(yǎng)：將含panD突變基因的重組大腸桿菌接種于斜面培養(yǎng)基，20～37℃培養(yǎng)12～24h(優(yōu)選37℃培養(yǎng)12h)，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，瓊脂15～25g/L，pH6～8，溶劑為水；優(yōu)選所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，pH7，溶劑為水；(2)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌株接種至種子培養(yǎng)基，20～37℃、100～250rpm搖床培養(yǎng)12～36h(優(yōu)選37℃、200rpm搖床培養(yǎng)16h)，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶劑為水；優(yōu)選所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH 7，溶劑為水；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度1～10％(優(yōu)選2％)的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，20～37℃、100～250rpm搖床培養(yǎng)至OD600為0.2～1.0(優(yōu)選37℃、200rpm搖床培養(yǎng)至OD600為0.6)，加乳糖至終濃度2～5g/L(優(yōu)選3.5g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4～48h(優(yōu)選12h)，獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液在5000～12000rpm離心2～10min(優(yōu)選8000rpm離心5min)后，棄去上清，收集細(xì)胞，獲得所述酶源；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏1～10g/L，蛋白胨2～15g/L，pH6～8，溶劑為水；優(yōu)選所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏6g/L，蛋白胨12g/L，pH7，溶劑為水。

本發(fā)明所述panD突變基因是以大腸桿菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD中panD基因?yàn)橛H株A進(jìn)行易錯(cuò)PCR反應(yīng)，隨機(jī)突變改變L-天冬氨酸-α-脫羧酶(PanD)基因的密碼子堿基，篩選出PanD酶活和β-Ala產(chǎn)量與親株A相比明顯提高的突變株。易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變改變panD基因的密碼子堿基的位置包含但不限于第10、90、114、212、253、286、306和321位。最終篩選獲得突變株1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85，抽提質(zhì)粒，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序確定突變的panD基因序列，分別發(fā)現(xiàn)突變株1-20第10位堿基A變成G(SEQ ID NO.1)，相應(yīng)的氨基酸由蘇氨酸變成丙氨酸(SEQ ID NO.7)；突變株2-30第212位堿基T變成C(SEQ ID NO.2)，相應(yīng)的氨基酸由纈氨酸變成丙氨酸(SEQ ID NO.8)；突變株2-36第306位堿基A變成T(SEQ ID NO.3)，盡管氨基酸沒變(SEQ ID NO.9)，但密碼子稀有度發(fā)生了變化；突變株3-48第254位堿基T變成了C及第286位堿基G變成了A(SEQ ID NO.4)，相應(yīng)的氨基酸分別由纈氨酸變成了丙氨酸、谷氨酸變成了賴氨酸(SEQ ID NO.10)；突變株4-133第90位堿基G變成了A及第321堿基T變成了C，盡管相應(yīng)的氨基酸沒變，但密碼子稀有度發(fā)生了變化，另外，第253位堿基G還變成了T(SEQ ID NO.5)，相應(yīng)的氨基酸由纈氨酸變成了異亮氨酸(SEQ ID NO.11)；突變株6-83和6-85都是第114位堿基T變成了A(SEQ ID NO.6)，盡管氨基酸沒變(SEQ ID NO.12)，但通過RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站RNA Structure Webservers分別對(duì)親株A和PanD表達(dá)最高突變株6-85的panD基因的mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)親株A的panD基因的mRNA在114位堿基未形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而突變株6-85的panD基因mRNA的114位堿基形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)引起mRNA自由能的增加，從而提高mRNA的穩(wěn)定性，由此提高目的蛋白的表達(dá)量。

本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明提供了一系列新的高產(chǎn)PanD的panD突變基因、編碼蛋白及工程菌，利用所獲工程菌高效轉(zhuǎn)化L-Asp來(lái)制備β-Ala；初步的研究發(fā)現(xiàn)，其中活力最高的重組大腸桿菌6-85所產(chǎn)PanD的酶活近250U/L、β-Ala的產(chǎn)量達(dá)8.5g/L左右，而親株A所產(chǎn)PanD的酶活僅為50U/L、β-Ala的產(chǎn)量為2.5g/L左右，分別提高了4倍和3倍。應(yīng)用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)panD基因進(jìn)行隨機(jī)突變改造，獲得了一系列PanD酶活明顯提高的重組大腸桿菌，育種目標(biāo)明確、效率高。

(四)附圖說(shuō)明

圖1為親株A(A)和代表性高產(chǎn)株大腸桿菌6-85(B)的panD基因在114位堿基附近mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果；

圖2為親株A和PanD高產(chǎn)株所產(chǎn)PanD酶活和L-Asp轉(zhuǎn)化率的比較。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：大腸桿菌panD基因突變體庫(kù)的構(gòu)建

(1)含大腸桿菌panD基因的pET28b(+)-panD質(zhì)粒的獲得：將大腸桿菌BL21(DE3)/pET28b(+)-panD即親株A(保藏號(hào)CCTCC NO：M206114，已在專利申請(qǐng)CN101210230A中公開)接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)12h，8000rpm離心5min，收集菌體細(xì)胞，用質(zhì)粒抽提試劑盒(購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)抽提質(zhì)粒pET28b(+)-panD；取2μL質(zhì)粒DNA用ND5000超微量紫外可見分光光度計(jì)(美國(guó)Bioteke公司)測(cè)定樣品的濃度和純度；LB液體培養(yǎng)基組成為：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0，卡那霉素50μg/mL，以水為溶劑。

(2)易錯(cuò)PCR反應(yīng)的建立：(a)設(shè)計(jì)含有限制性酶切位點(diǎn)的正向引物(YCpanD-F:5’GACAGCAAATGGGTCGGGATCCTATGAT3’，下劃線為BamH I酶切位點(diǎn))和反向引物(YCpanD-R：5’GCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTAGCAAC3’，下劃線為Hind III酶切位點(diǎn))；(b)配制50μL的PCR反應(yīng)混合液，內(nèi)含(終濃度)：1×Taq DNA聚合酶緩沖液，1.0mmol/L Mn²⁺，0.12mmol/L dGTP，0.12mmol/L dATP，1.0mmol/L dCTP，1.0mmol/L dTTP，0.2μmol/L上游引物YCpanD-F，0.2μmol/L下游引物YCpanD-R，2ng/μL模板pET28b(+)-panD和0.1U/μL Taq DNA聚合酶，其余為無(wú)菌水；(c)將PCR反應(yīng)混合液置于PCR儀上進(jìn)行易錯(cuò)PCR擴(kuò)增panD基因，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃變性10min，然后是35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性60s，62℃退火45s，72℃延伸60s，循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸5min，然后保存在4℃下。擴(kuò)增結(jié)束后，用濃度為1.5％瓊脂糖凝膠電泳確證PCR產(chǎn)物大??；

(3)panD基因突變體庫(kù)的構(gòu)建：(a)用DNA純化試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；取2μL純化后PCR產(chǎn)物用ND5000超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的濃度和純度；(b)配制100μL的酶切反應(yīng)混合液，用限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III對(duì)步驟(a)的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物和pET28b(+)載體分別進(jìn)行雙酶切，內(nèi)含(終濃度)：1×Buffer K，50ng/μL易錯(cuò)PCR產(chǎn)物DNA或pET28b(+)，1U/μL BamH I和1U/μL Hind III，其余為無(wú)菌水；于37℃水浴中酶切4h；(c)將酶切產(chǎn)物在濃度為1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，驗(yàn)證酶切效果，并將目的片段切膠，分別用DNA凝膠回收試劑盒回收；取2μL回收產(chǎn)物用ND5000超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的濃度和純度；(d)用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)對(duì)酶切后線性化pET28b(+)載體進(jìn)行去磷酸化處理，防止載體自連。配置50μL線性化pET28b(+)載體去磷酸化反應(yīng)混合液，內(nèi)含(終濃度)：1×Alkalin Phosphatase Buffer，0.05pmol/μL pET28b(+)雙酶切純化產(chǎn)物，1U/μL CIAP，其余為無(wú)菌水；于37℃水浴中反應(yīng)4h。用DNA純化試劑盒純化去磷酸化的產(chǎn)物，并取2μL純化后產(chǎn)物用ND5000超微量紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品的濃度和純度；(e)配置10μL的連接反應(yīng)混合液，內(nèi)含(終濃度)：1×T4Ligation Buffer，2ng/μL步驟(d)獲得的雙酶切后pET28b(+)，6ng/μL步驟(c)獲得的雙酶切易錯(cuò)PCR產(chǎn)物，10U/μL T4 DNA Ligase，其余為無(wú)菌水；于16℃水浴中反應(yīng)12h。按TaKaRa公司高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒說(shuō)明書手冊(cè)制備感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)；按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至100μL大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布至LB固體培養(yǎng)基平板(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉5g/L，pH7.0，卡那霉素50μg/mL，以水為溶劑)，在37℃下正向放置1h以吸收過多的液體，然后倒置培養(yǎng)過夜；(f)將轉(zhuǎn)化平板上長(zhǎng)出的所有轉(zhuǎn)化子單菌落挑至含50μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上并劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。將長(zhǎng)出的所有轉(zhuǎn)化子用引物對(duì)YCpanD-F和YCpanD-R進(jìn)行普通菌落PCR(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)鑒定，獲得panD基因突變體庫(kù)。

實(shí)施例2：高產(chǎn)PanD的基因工程菌的獲得

將實(shí)施例1構(gòu)建的突變體庫(kù)中的轉(zhuǎn)化子和親株A分別接入3mL LB液體培養(yǎng)基中，加乳糖至終濃度3g/L，于37℃、200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床培養(yǎng)1d。培養(yǎng)結(jié)束后，取1.5mL培養(yǎng)液至EP管中，8000r/min、4℃離心10min，收集細(xì)胞。加入300μL L-Asp使其終濃度為0.2mol/L，混勻后，于37℃，200rpm搖床轉(zhuǎn)化12h。取50μL轉(zhuǎn)化液按專利申請(qǐng)CN101210230A中所述的HPLC方法檢測(cè)β-Ala和L-Asp含量，計(jì)算轉(zhuǎn)化率，篩選出PanD酶活和β-Ala產(chǎn)量與親株A相比明顯提高的突變株。PanD酶活定義為在pH7.0、37℃的條件下，每升發(fā)酵液所得菌體每1h轉(zhuǎn)化生成1μmol產(chǎn)物β-Ala所需酶量定義為一個(gè)酶活力單位(μmol·L^-1·h^-1)，簡(jiǎn)稱為U。

式中，N為轉(zhuǎn)化液β-Ala濃度(g/L)；V為轉(zhuǎn)化液體積(L)；T為轉(zhuǎn)化時(shí)間(h)，V’為發(fā)酵液體積(L)；M為β-Ala分子量(g/mol)。

結(jié)果如表1所示，共有7株突變株(1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85)的β-Ala產(chǎn)量和PanD酶活相較于親株A有明顯提高(提高30％以上)，其中，突變株6-85提高的最多。

表1突變株HPLC檢測(cè)結(jié)果

注：菌株編號(hào)親株A-1～親株A-6表示不同批次發(fā)酵結(jié)果；加粗為篩選得到的高產(chǎn)菌

實(shí)施例3：PanD高產(chǎn)突變株panD基因序列的分析

將實(shí)施例2篩選的突變株1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85所含質(zhì)粒按實(shí)施例1所述抽提方法獲得，并送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序確定突變的panD基因序列，并用DNAman軟件進(jìn)行序列比對(duì)；突變位點(diǎn)密碼子對(duì)應(yīng)tRNA豐度通過Codon Usage Database查詢獲得，結(jié)果見表2。突變株1-20panD基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.7所示；突變株2-30panD基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.2所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.8所示；突變株2-36panD基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.9所示；突變株3-48panD基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.4所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.10所示；突變株4-133panD基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.11所示；突變株6-83和突變株6-85panD基因的核苷酸一樣，序列為SEQ ID NO.6所示，編碼蛋白氨基酸序列為SEQ ID NO.12所示。

表2突變株panD突變位點(diǎn)分析

由表可見，突變株1-20第10位堿基A變成G，相應(yīng)的氨基酸由蘇氨酸變成丙氨酸；突變株2-30第212位堿基T變成C，相應(yīng)的氨基酸由纈氨酸變成丙氨酸；突變株2-36第306位堿基A變成T，盡管氨基酸沒變，但密碼子稀有度發(fā)生了明顯變化；突變株3-48第254位堿基T變成了C及第286位堿基G變成了A，相應(yīng)的氨基酸分別由纈氨酸變成了丙氨酸、谷氨酸變成了賴氨酸；突變株4-133第90位堿基G變成了A及第321堿基T變成了C，盡管相應(yīng)的氨基酸沒變，但密碼子稀有度發(fā)生了變化，另外，第253位堿基G還變成了T，相應(yīng)的氨基酸由纈氨酸變成了異亮氨酸；突變株6-83和6-85都是第114位堿基T變成了A，盡管氨基酸沒變，但通過RNA結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站RNA Structure Webservers分別對(duì)親株A和PanD表達(dá)最高突變株6-85的panD基因的mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，親株A的panD基因的mRNA在114位堿基未形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而突變株6-85的panD基因mRNA的114位堿基形成了發(fā)卡結(jié)構(gòu)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)會(huì)引起mRNA自由能的增加，從而提高mRNA的穩(wěn)定性，由此提高突變株6-83和6-85中PanD蛋白的表達(dá)量。

實(shí)施例4：PanD重組大腸桿菌在制備β-Ala中的應(yīng)用

(1)酶源的制備：(a)斜面培養(yǎng)：將實(shí)施例2構(gòu)建的重組大腸桿菌6-85接種于斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12h，獲得斜面菌體，所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏3g/L，蛋白胨5g/L，瓊脂20g/L，pH7，溶劑為水；(b)種子培養(yǎng)：從斜面菌體挑取一接種環(huán)菌株接種至種子培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)16h，獲得種子液，所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，pH 7，溶劑為水；(c)發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以體積濃度2％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃、200rpm搖床培養(yǎng)至OD600為0.6，加乳糖至終濃度3.5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)12h，獲得PanD重組大腸桿菌發(fā)酵液；將1.5mL發(fā)酵液在8000rpm離心5min后，棄去上清，收集濕菌體細(xì)胞；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為：酵母膏6g/L，蛋白胨12g/L，pH7，溶劑為水。同樣條件下，接種親株A、重組大腸桿菌1-20、重組大腸桿菌2-30、重組大腸桿菌2-36、重組大腸桿菌3-48、重組大腸桿菌4-133和重組大腸桿菌6-83，分別獲得發(fā)酵液。

(2)L-Asp的轉(zhuǎn)化：6mg濕菌體中加入300μL L-Asp(用水配置，NaOH調(diào)pH至7.0)重懸細(xì)胞，并使L-Asp終濃度為0.2mol/L，混勻后，于37℃，200rpm搖床轉(zhuǎn)化12h。取50μL轉(zhuǎn)化液用HPLC方法檢測(cè)β-Ala和L-Asp含量，計(jì)算PanD酶活和L-Asp的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，親株A的PanD酶活和L-Asp的轉(zhuǎn)化率分別為27U/L和5.3％，而重組大腸桿菌1-20、2-30、2-36、3-48、4-133、6-83和6-85的PanD酶活和L-Asp的轉(zhuǎn)化率都比親株A高，尤其是重組大腸桿菌6-85，其PanD酶活和L-Asp的轉(zhuǎn)化率分別為120U/L和20.6％，比親株A提高了近4倍和3倍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工業(yè)大學(xué)

<120> 一種panD突變基因、編碼蛋白、載體、工程菌及其應(yīng)用

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgattcgcg cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 2

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gctaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 3

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgtccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 4

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 4

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgccatcat cgccagcttc gttaccatgc cagataaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 5

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 5

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccaa gattttcttg acgcagccgg tattctcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttttcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ctttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 6

<211> 378

<212> DNA

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 6

atgattcgca cgatgctgca gggcaaactc caccgcgtga aagtgactca tgcggacctg 60

cactatgaag gttcttgcgc cattgaccag gattttcttg acgcagccgg tatactcgaa 120

aacgaagcca ttgatatctg gaatgtcacc aacggcaagc gtttctccac ttatgccatc 180

gcggcagaac gcggttcgag aattatttct gttaacggtg cggcggccca ctgcgccagt 240

gtcggcgata ttgtcatcat cgccagcttc gttaccatgc cagatgaaga agctcgcacc 300

tggcgaccca acgtcgccta ttttgaaggc gacaatgaaa tgaaacgtac cgcgaaagcg 360

attccggtac aggttgct 378

<210> 7

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 7

Met Ile Arg Ala Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125

<210> 8

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 8

Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Ala Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125

<210> 9

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 9

Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125

<210> 10

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 10

Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Ala Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Lys

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125

<210> 11

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 11

Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Phe Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125

<210> 12

<211> 126

<212> PRT

<213> unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 12

Met Ile Arg Thr Met Leu Gln Gly Lys Leu His Arg Val Lys Val Thr

1 5 10 15

His Ala Asp Leu His Tyr Glu Gly Ser Cys Ala Ile Asp Gln Asp Phe

20 25 30

Leu Asp Ala Ala Gly Ile Leu Glu Asn Glu Ala Ile Asp Ile Trp Asn

35 40 45

Val Thr Asn Gly Lys Arg Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ala Ala Glu Arg

50 55 60

Gly Ser Arg Ile Ile Ser Val Asn Gly Ala Ala Ala His Cys Ala Ser

65 70 75 80

Val Gly Asp Ile Val Ile Ile Ala Ser Phe Val Thr Met Pro Asp Glu

85 90 95

Glu Ala Arg Thr Trp Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Glu Gly Asp Asn

100 105 110

Glu Met Lys Arg Thr Ala Lys Ala Ile Pro Val Gln Val Ala

115 120 125