本發(fā)明提供一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法，本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng)方法的裝置，屬于細(xì)胞培養(yǎng)生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在生物工程技術(shù)領(lǐng)域中，人二倍體細(xì)胞來(lái)源于正常人體組織，是目前公認(rèn)的可用于制備病毒性疫苗的宿主細(xì)胞之一。傳統(tǒng)的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)方法大多是利用不同容量的玻璃轉(zhuǎn)瓶，其缺點(diǎn)是單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小、細(xì)胞生長(zhǎng)密度低、瓶間差異較難控制、易于污染、勞動(dòng)強(qiáng)度高、占用空間和能源消耗大。

多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶是近年發(fā)展的一種新型細(xì)胞培養(yǎng)容器，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)比較其表面經(jīng)過(guò)特殊處理，細(xì)胞更容易貼壁生長(zhǎng)，單位體積內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)的面積更大，細(xì)胞產(chǎn)量更高，不易污染，降低了勞動(dòng)強(qiáng)度。

CO₂既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)所需成分。在哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)過(guò)程中，CO₂除了提供細(xì)胞生長(zhǎng)所必需，另一方面主要與維持細(xì)胞培養(yǎng)液的pH有直接關(guān)系，對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞適宜的pH為7.2～7.4，偏離此范圍將對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生有害影響。一般培養(yǎng)液的緩沖物是碳酸緩沖對(duì)，由于空氣中的二氧化碳濃度較低，在此環(huán)境下培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液中的HCO₃^-會(huì)被逐漸耗盡，使培養(yǎng)液pH值漸漸升高，從而影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，因此這就需要二氧化碳培養(yǎng)箱的支持，穩(wěn)定地提供適宜濃度的CO₂，以維持細(xì)胞生長(zhǎng)的氣體環(huán)境，同時(shí)要求培養(yǎng)細(xì)胞的容器需要一定程度的透氣，以便于氣體的交換。

但是，對(duì)于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)說(shuō)，使用二氧化碳培養(yǎng)箱就又涉及到占用空間和能源消耗的問(wèn)題?，F(xiàn)有的多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶采用的透氣瓶蓋結(jié)構(gòu)，在培養(yǎng)依賴(lài)CO₂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如人二倍體細(xì)胞時(shí)，并不適合在大氣二氧化碳濃度的普通大型恒溫培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行，因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待進(jìn)一步的改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開(kāi)一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法，解決了利用多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶替代傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶進(jìn)行生物制品生產(chǎn)中細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)的問(wèn)題。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)裝置，實(shí)現(xiàn)了普通大型恒溫培養(yǎng)環(huán)境下人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)。

本發(fā)明所述的一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1、將在T-225cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)成致密單層的人二倍體細(xì)胞棄去瓶中生長(zhǎng)液，用洗液洗去殘留的舊生長(zhǎng)液，加消化液靜置消化，待細(xì)胞表面呈松散狀時(shí)棄去消化液，用含小牛血清的生長(zhǎng)液將細(xì)胞分散至單個(gè)狀態(tài)，按1:4分種率分種于過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加生長(zhǎng)液至225～275ml；

2、將過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶口用滅菌硅膠軟管與0.2 μm無(wú)菌空氣過(guò)濾器的梯形軟管接口連接進(jìn)行封閉后，置37℃±0.5℃大氣二氧化碳濃度的普通恒溫室中靜止培養(yǎng)；

3、待5-7天細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)致密單層后，棄去瓶中生長(zhǎng)液，用洗液洗滌后，加消化液靜置消化，待細(xì)胞表面呈松散狀時(shí)棄去消化液，用含小牛血清的生長(zhǎng)液將細(xì)胞分散至單個(gè)狀態(tài)，按1:4分種率繼續(xù)分種于多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代擴(kuò)增至適宜規(guī)模后，轉(zhuǎn)接細(xì)胞工廠用于病毒培養(yǎng)。

本發(fā)明所述的一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶，其特征在于：

在多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶體1的瓶口通過(guò)滅菌硅膠軟管2與一個(gè)無(wú)菌空氣過(guò)濾器3的梯形軟管接口連接進(jìn)行封閉，所述的多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶?jī)?nèi)分為五層，可供細(xì)胞貼壁，無(wú)菌空氣過(guò)濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無(wú)菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無(wú)菌的氣體交換。

所述一種過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法，其中，所述人二倍體細(xì)胞可以為2BS、MRC-5、KMB17等中的任意一種。

本發(fā)明提供的一種利用多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶進(jìn)行人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的應(yīng)用，不僅可以替代傳統(tǒng)病毒性疫苗制備工藝中細(xì)胞培養(yǎng)階段的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，減小占用空間和降低能源消耗，并且本發(fā)明的技術(shù)克服了目前市售具透氣蓋多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶不適用于非二氧化碳依賴(lài)型培養(yǎng)環(huán)境的缺陷，降低了生產(chǎn)投入，更有利于人二倍體細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶結(jié)構(gòu)示意圖，圖中，1、多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶體；2、滅菌硅膠軟管；3、無(wú)菌空氣過(guò)濾器；4、隔板；5、無(wú)菌PTFE膜；

圖2示出分別用無(wú)菌空氣過(guò)濾器與透氣蓋封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的比較；

圖3示出分別用無(wú)菌空氣過(guò)濾器與透氣蓋封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口對(duì)培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞活細(xì)胞密度的影響；

圖4示出分別用無(wú)菌空氣過(guò)濾器與透氣蓋封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口對(duì)培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞上清液pH的影響。

具體實(shí)施方式

為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的目的及技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

1、將在T-225cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)成致密單層的人二倍體細(xì)胞棄去瓶中生長(zhǎng)液，用洗液洗去殘留的舊生長(zhǎng)液，加消化液靜置消化，待細(xì)胞表面呈松散狀時(shí)棄去消化液，用含小牛血清的生長(zhǎng)液將細(xì)胞分散至單個(gè)狀態(tài)，按1:4分種率分種于過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再補(bǔ)加生長(zhǎng)液至225～275ml；

2、將過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶的瓶口用滅菌硅膠軟管與0.2 μm無(wú)菌空氣過(guò)濾器的梯形軟管接口連接進(jìn)行封閉后，置37 ℃±0.5 ℃大氣二氧化碳濃度的普通恒溫室中靜止培養(yǎng)；

3、待5-7天細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)致密單層后，棄去瓶中生長(zhǎng)液，用洗液洗滌后，加消化液靜置消化，待細(xì)胞表面呈松散狀時(shí)棄去消化液，用含小牛血清的生長(zhǎng)液將細(xì)胞分散至單個(gè)狀態(tài)，按1:4分種率繼續(xù)分種于多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中連續(xù)傳代擴(kuò)增至適宜規(guī)模后，轉(zhuǎn)接細(xì)胞工廠用于病毒培養(yǎng)。

實(shí)施例2

在過(guò)CO₂多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶人二倍體細(xì)胞貼壁培養(yǎng)方法中，所述人二倍體細(xì)胞可以為2BS、MRC-5、KMB17等中的任意一種。

實(shí)施例3

在多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶體1的瓶口通過(guò)滅菌硅膠軟管2與一個(gè)無(wú)菌空氣過(guò)濾器3的梯形軟管接口連接進(jìn)行封閉，所述的多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶?jī)?nèi)分為五層，可供細(xì)胞貼壁，無(wú)菌空氣過(guò)濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無(wú)菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無(wú)菌的氣體交換。

試驗(yàn)例1

通過(guò)以下試驗(yàn)對(duì)分別用無(wú)菌空氣過(guò)濾器與透氣蓋封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)的人二倍體細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行比較。

為了測(cè)試在非二氧化碳依賴(lài)型環(huán)境下以無(wú)菌空氣過(guò)濾器封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)人二倍體細(xì)胞的性能，在大氣二氧化碳濃度的37℃恒溫室中以無(wú)菌空氣過(guò)濾器封閉多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株2BS株，并與以原裝透氣蓋封閉的多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行比較。

選取在T-225 cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)長(zhǎng)成致密單層的P31代人胚肺二倍體細(xì)胞2BS株2BS株，棄去瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)液，用10～20 ml Hank's液洗去殘留的舊生長(zhǎng)液。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加10～20ml消化液，37℃靜置消化，待細(xì)胞表面呈松散狀時(shí)棄去消化液，加入200ml含有10%小牛血清的新鮮細(xì)胞生長(zhǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞使其脫壁并分散至單個(gè)狀態(tài)，按1:4分種率分種至多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。

Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)每瓶活細(xì)胞密度為1.6×10⁵/ml，利用精密酸度計(jì)調(diào)整pH至7.40，每個(gè)多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶最終生長(zhǎng)液量為225～275ml。

實(shí)驗(yàn)分為兩組，取18瓶多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶，將瓶體1的瓶口通過(guò)滅菌硅膠軟管2與一個(gè)無(wú)菌空氣過(guò)濾器3的梯形軟管接口連接進(jìn)行封閉，所述的多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶1內(nèi)壁分布有四層橫向的隔板4將瓶?jī)?nèi)分為五層，可供細(xì)胞貼壁，無(wú)菌空氣過(guò)濾器3內(nèi)鑲嵌有0.2 μm 的無(wú)菌PTFE膜5，可以提供持續(xù)而無(wú)菌的氣體交換（見(jiàn)圖1）。另取18瓶多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶作為對(duì)照組，瓶口用原裝透氣蓋封閉。

將兩組細(xì)胞同置于37℃±0.5℃大氣二氧化碳濃度的恒溫室中靜止培養(yǎng)。以接種后一日記為第1天，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，消化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)pH，連續(xù)觀察6天。

細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)比較

細(xì)胞傳代后分別用肉眼和光學(xué)顯微鏡觀察比較細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。無(wú)菌空氣過(guò)濾器封閉組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)明顯優(yōu)于對(duì)照的原裝透氣蓋封閉組，細(xì)胞貼壁迅速，增殖速度快，細(xì)胞密度大，在接種后第3天即可形成單層。而原裝透氣蓋封閉組細(xì)胞貼壁及增殖能力均較弱，細(xì)胞不易連接成片無(wú)法形成單層，至接種后第5天，細(xì)胞開(kāi)始變形，出現(xiàn)顆粒，接種后第6天細(xì)胞圓縮，失去人二倍體細(xì)胞正常形態(tài)，脫壁。見(jiàn)圖2。

細(xì)胞計(jì)數(shù)

自細(xì)胞接種后第1天開(kāi)始，每日從兩組中各抽取3個(gè)培養(yǎng)瓶，消化液消化細(xì)胞并收獲，采用Countstar自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每瓶樣品檢測(cè)3個(gè)視野，計(jì)算平均結(jié)果。相同培養(yǎng)時(shí)間，無(wú)菌空氣過(guò)濾器封閉組活細(xì)胞密度明顯大于對(duì)照的原裝透氣蓋封閉組的活細(xì)胞密度，見(jiàn)圖3。

培養(yǎng)液pH變化

自細(xì)胞接種后第1天開(kāi)始，每日從兩組中各抽取3個(gè)培養(yǎng)瓶，提取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用精密酸度計(jì)檢測(cè)pH，計(jì)算平均結(jié)果。自接種后第1天開(kāi)始，對(duì)照的原裝透氣蓋封閉組培養(yǎng)液pH即明顯升高，升高趨勢(shì)一直延續(xù)到接種后第6天。無(wú)菌空氣過(guò)濾器封閉組培養(yǎng)液pH在接種后第1天略高于初始pH，之后便呈現(xiàn)回落趨勢(shì)。見(jiàn)圖4。

上述對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯示，本發(fā)明的技術(shù)克服了目前市售具透氣蓋多層細(xì)胞培養(yǎng)瓶不適用于非二氧化碳依賴(lài)型培養(yǎng)環(huán)境的缺陷，更有利于人二倍體細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。需要說(shuō)明的是，雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開(kāi)如上，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明可以做各種變化和改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)力要求書(shū)及其等同方案所界定的為準(zhǔn)。