本發(fā)明涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，特別是一種高效獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系。

背景技術(shù)：

京大戟又稱大戟、龍虎草等，是大戟科大戟屬植物大戟(Euphorbia pekinensisRupr)的干燥根，京大戟性味苦、寒、有毒，作為藥材最初見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在中醫(yī)中常用于峻下逐水藥，功效泄水逐飲，消腫散結(jié)。臨床上常用于胸膜炎積水,晚期血吸蟲病腹水,肝硬化腹水及精神分裂癥等。

目前對大戟的化學(xué)成分和藥理作用已經(jīng)具有一定的研究基礎(chǔ)，從大戟中分離到了多種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，藥理研究發(fā)現(xiàn)大戟中分離的化合物具有抗腫瘤、抗白血病、鎮(zhèn)痛、消炎等作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)京大戟具有治療精神分裂癥、肝硬化腹水、便秘、耕牛前胃弛緩等療效。但京大戟具有毒性，限制了大戟的應(yīng)用。京大戟的活性成分大部分為萜類化合物。大戟萜類成分在大戟屬植物中廣泛存在,其結(jié)構(gòu)獨特、新穎,為主要生物活性成分,不同碳骨架類型的萜成分生理活性具有明顯差異性。

大戟中的活性物質(zhì)種類繁多，然而作為次生代謝產(chǎn)物，其絕對含量又是很低的，這也成為次生代謝產(chǎn)物研究開發(fā)的最大障礙。近年來植物基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)提高次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量開辟了一條嶄新的途徑。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(或轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)入相應(yīng)的宿主中，獲得轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系、組織或再生植株，并進行大規(guī)模的培養(yǎng)，是實現(xiàn)從根本上提高次生代謝產(chǎn)物含量的最佳途徑。國內(nèi)外不少實驗室正在進行這方面的研究。

誘導(dǎo)培養(yǎng)大戟的愈傷組織，以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法，將是開展大戟代謝工程研究提高大戟活性成分含量并實現(xiàn)大戟活性成分工廠化生產(chǎn)的有效方法。目前尚未發(fā)現(xiàn)獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是要提供一種高效獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法及其農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，誘導(dǎo)培養(yǎng)大戟的愈傷組織，以根癌農(nóng)桿菌為介導(dǎo)，獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株；開展大戟代謝工程研究提高大戟活性成分含量并實現(xiàn)大戟活性成分工廠化生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：本發(fā)明包括獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系。

獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，抗性愈傷組織的篩選和增殖培養(yǎng)，分化培養(yǎng)及抗性植株的檢測，實現(xiàn)大戟轉(zhuǎn)基因植株用于代謝工程。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系：采用大戟的花作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過培養(yǎng)獲得胚性愈傷，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶有潮霉素抗性的pCAMBIA1301質(zhì)粒導(dǎo)入大戟愈傷組織，經(jīng)抗性愈傷組織篩選及分化培養(yǎng)獲得大戟的無菌苗，PCR檢測外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的整合情況，獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株。

具體步驟為：

(1)大戟愈傷組織的誘導(dǎo)：選擇即將開放的或剛開放的花為愈傷組織誘導(dǎo)用外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在花的切口處逐漸產(chǎn)生白色的愈傷組織，并且花骨朵不斷膨大；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加激素6-BA和NAA而組成；

(2)大戟胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將大戟花骨朵誘導(dǎo)出的白色愈傷組織轉(zhuǎn)接至胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)防水樣化和褐化，并獲得致密的、硬度增加的胚性愈傷組織；該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加不同配比的6-BA和NAA而組成；

(3)遺傳轉(zhuǎn)化：利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含潮霉素基因的植物表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，以大戟胚性愈傷組織為受體進行轉(zhuǎn)化；

(4)抗性胚性愈傷組織的脫菌、篩選和增殖培養(yǎng)：經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，然后，在篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，獲得具有潮霉素抗性的愈傷組織；

(5)抗性愈傷組織的分化培養(yǎng)：將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待分化出芽后，將長出的小芽轉(zhuǎn)入到不含潮霉素的分化培養(yǎng)基中，待小苗長壯后生根；

(6)PCR法檢測轉(zhuǎn)基因植株：提取每個植株的總DNA,PCR檢測是否含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；如果電泳能檢測出目的條帶，表明外源基因整合到受體細(xì)胞的染色體中并表達。

本發(fā)明所述的根癌農(nóng)桿菌，市場上有公開出售的生物材料，可以從多家公司購得。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用基因工程方法，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pCAMBIA1301質(zhì)粒導(dǎo)入大戟愈傷組織中，獲得了轉(zhuǎn)基因大戟植株。這對后期開展大戟活性成分合成途徑的代謝工程，最終解決大戟資源短缺，滿足醫(yī)藥工業(yè)大規(guī)模工廠化生產(chǎn)需要具有重要意義。該方法在大戟生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域包括功能蛋白的定位、啟動子活性的檢測、大戟基因工程、細(xì)胞工程、代謝工程以及大戟遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。

附圖說明：

圖1是本發(fā)明的大戟胚型愈傷組織結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明的大戟轉(zhuǎn)化后抗性愈傷組織圖。

圖3是本發(fā)明的大戟分化培養(yǎng)基上再生的抗性苗圖。

具體實施方式

本發(fā)明包括獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系。

獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株的方法，包括愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，抗性愈傷組織的篩選和增殖培養(yǎng)，分化培養(yǎng)及抗性植株的檢測，實現(xiàn)大戟轉(zhuǎn)基因植株用于代謝工程。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系：采用大戟的花作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，并經(jīng)過培養(yǎng)獲得胚性愈傷，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將帶有潮霉素抗性的pCAMBIA1301質(zhì)粒導(dǎo)入大戟愈傷組織，經(jīng)抗性愈傷組織篩選及分化培養(yǎng)獲得大戟的無菌苗，PCR檢測外源潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的整合情況，獲得大戟轉(zhuǎn)基因植株。

具體步驟為：

(1)大戟愈傷組織的誘導(dǎo)：選擇即將開放的或剛開放的花為愈傷組織誘導(dǎo)用外植體，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在花的切口處逐漸產(chǎn)生白色的愈傷組織，并且花骨朵不斷膨大；上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加激素6-BA和NAA而組成；

(2)大戟胚性愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)：將大戟花骨朵誘導(dǎo)出的白色愈傷組織轉(zhuǎn)接至胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)防水樣化和褐化，并獲得致密的、硬度增加的胚性愈傷組織；該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，再添加不同配比的6-BA和NAA而組成；

(3)遺傳轉(zhuǎn)化：利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將含潮霉素基因的植物表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，以大戟胚性愈傷組織為受體進行轉(zhuǎn)化；

(4)抗性胚性愈傷組織的脫菌、篩選和增殖培養(yǎng)：經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化，然后，在篩選培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，獲得具有潮霉素抗性的愈傷組織；

(5)抗性愈傷組織的分化培養(yǎng)：將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待分化出芽后，將長出的小芽轉(zhuǎn)入到不含潮霉素的分化培養(yǎng)基中，待小苗長壯后生根；

(6)PCR法檢測轉(zhuǎn)基因植株：提取每個植株的總DNA,PCR檢測是否含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；如果電泳能檢測出目的條帶，表明外源基因整合到受體細(xì)胞的染色體中并表達。

下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明：本實施例在以發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。

實施例1：大戟胚性愈傷組織的誘導(dǎo)；

取大戟的即將開放或剛開放的花骨朵，進行消毒，程序如下：先用自來水沖洗2h，無菌水沖洗2次，75％乙醇消毒45s，無菌水沖洗3次，0.1％升汞消毒6min，之后在其上劃傷痕，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+植物凝膠0.4g/L)中，先26±1℃黑暗培養(yǎng)7d，再進行光照培養(yǎng)，接種的花骨朵7d后傷口邊緣開始膨大，14d后誘導(dǎo)出愈傷組織。將愈傷組織繼代接種于胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，該胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+0.4g/L植物凝膠。篩選到長勢好而快，沒有褐化且呈現(xiàn)黃綠色的質(zhì)地致密的胚性愈傷組織待侵染。

實施例2：含潮霉素基因的植物表達載體pCAMBIA1301根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得；

將植物表達載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105,為市場有公開出售的生物材料)，并進行PCR驗證。具體地，首先制備感受態(tài)根癌農(nóng)桿菌(Agl-1)：培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌至菌液OD600＝0.5，將菌液冰浴30min后，轉(zhuǎn)移菌液至1.5mL離心管中，4℃,5000rpm離心5min，去上清；用抽濾滅菌的預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮菌體后于冰上放置30min,然后5000rpm離心5min，去上清，用100μL預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮菌體后于4℃保存?zhèn)溆茫藶橹苽浜玫霓r(nóng)桿菌感受態(tài)。取制備好的一管感受態(tài)，加入1μL質(zhì)粒pCAMBIA1301，輕輕混勻后置冰上5min，然后液氮中放8min，37℃水浴熱擊5min，然后加入800μL YEB液體培養(yǎng)基，輕輕混勻；28℃,200rpm振蕩培養(yǎng)4h后，室溫4000rpm，4℃離心10min，去上清，余下200μL菌液重懸菌體混勻，涂布在含100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，于28℃倒置培養(yǎng)2d，挑選抗性單菌落在含相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌液達到一定濃度后進行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的PCR檢測。結(jié)果表明，植物表達載體pCAMBIA1301已成功構(gòu)建到根癌農(nóng)桿菌菌株中。

實施例3：

1.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化

1.1根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)；

挑取含所述植物表達載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌單菌落于含有100mg/L卡那霉素和40mg/L利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜，當(dāng)菌液濃度OD600達到0.6-0.8時，4000rpm離心10min，去上清，用含有100μM乙酰丁香酮的MS重懸沉淀在底部的農(nóng)桿菌，28℃，180rpm搖床培養(yǎng)活化2h后用于轉(zhuǎn)化大戟胚性愈傷。

1.2根癌農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)；

將大戟胚性愈傷團塊接種于根癌農(nóng)桿菌菌液中，28℃，120rpm搖床培養(yǎng)30min，取出愈傷團塊，用無菌濾紙吸干多余的菌液，然后轉(zhuǎn)入鋪有一層無菌濾紙的含有100μM AS的共培養(yǎng)基上，26±1℃黑暗共培養(yǎng)3天，用含300mg/L cef的無菌水洗滌愈傷3次，過濾后再用若干無菌濾紙吸干水分，然后將愈傷置于共培養(yǎng)基(MS+蔗糖30g/L+4g/L植物凝膠+100μM AS)上，于26±1℃暗培養(yǎng)3天，使農(nóng)桿菌充分浸染大戟愈傷組織。

1.3抗性愈傷組織的篩選與繼代培養(yǎng)；

共培養(yǎng)后，把愈傷組織轉(zhuǎn)接到恢復(fù)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝膠+300mg/L cef)上，進行脫菌培養(yǎng)，于26±1℃暗培養(yǎng)2個星期后轉(zhuǎn)接到篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝膠+300mg/L cef+100mg/L潮霉素)上進行抗性愈傷組織的篩選培養(yǎng)，每4個星期繼代培養(yǎng)一次。

1.4抗性愈傷組織的分化；

將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基(MS+6-BA 3.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+4g/L植物凝膠+cef 250mg/L+潮霉素100mg/L)上培養(yǎng)，分化條件為16h光照，8h黑暗，光照度50μmol/m²/s，溫度為(26±1)℃。待分化出芽后，將長出的小芽轉(zhuǎn)入到不含潮霉素的分化培養(yǎng)基中，待小苗長壯后生根。

2.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測

首先用CTAB方法提取抗性植株葉片的總DNA，然后用PCR方法檢測其是否含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。PCR反應(yīng)條件為：95℃變性3min；然后是30個循環(huán)的95℃，30sec，59℃，40sec,72℃，1min；最后再72℃延生5min。結(jié)果表明，利用所設(shè)計的PCR特異引物擴增各抗性植株的總DNA，部分植株能擴增出與預(yù)期結(jié)果一致的特異目的片段(共檢測50株植株，其中陽性植株為19株，轉(zhuǎn)化效率為38％)，而以非轉(zhuǎn)化大戟植株總DNA為模板時，沒有擴增出任何片段。說明潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因已經(jīng)整合到部分大戟植株的基因組中。

本實施例利用所構(gòu)建的含植物表達載體pCAMBIA1301的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化大戟愈傷組織，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因植株。為后期開展大戟代謝工程和大規(guī)模工廠化生產(chǎn)大戟活性成分并最終解決藥物資源匱乏提供了一種有效的解決方法。