本發(fā)明屬于HPV檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種HPVl6感染相關(guān)疾病的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：人乳頭瘤病毒(HPV)為對(duì)稱二十面體，是微小無包膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，大小約8kb。流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)了HPV感染與宮頸癌的發(fā)生有極密切的相關(guān)性，檢測(cè)結(jié)果表明宮頸癌病例中HPV病毒基因組的陽性率大于99％，其中70％的病例由高危型病毒HPV16和HPV18的感染引起。HPV16是最常見的與宮頸癌相關(guān)的高危型病毒。HPV基因組按功能不同分為3個(gè)區(qū)：非編碼區(qū)，為基因轉(zhuǎn)錄復(fù)制調(diào)控區(qū)；早期區(qū)，含6個(gè)開放讀碼框架(El，E2，E4，E5，E6，E7)，編碼的蛋白參與病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄；晚期區(qū)，含L1和L2兩個(gè)開放讀碼框架，編碼病毒兩個(gè)衣殼蛋白，即主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白，共同組成病毒的外殼。HPV16的E6和E7是主要的致癌基因，在宮頸癌SiHa細(xì)胞系中，當(dāng)HPV16E6/E7表達(dá)沉默時(shí)，SiHa細(xì)胞的增殖及遷移能力就會(huì)明顯受到抑制。1993年比利時(shí)的HamersCasterman報(bào)道了在駱駝血清中不僅存在由2條H鏈和2條L鏈構(gòu)成的常規(guī)抗體，還存在缺失輕鏈的重鏈抗體(heavy-chainantibody，hcAb)這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈的可變區(qū)VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH)形成，盡管天然缺失輕鏈可變區(qū)，卻仍具有良好和廣泛的抗原結(jié)合力。VHH納米抗體分子量為15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10。納米抗體具有易表達(dá)，水溶性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，免疫原性弱，組織穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，這些特點(diǎn)使得納米抗體在基礎(chǔ)研究、藥物開發(fā)等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用價(jià)值。而傳統(tǒng)抗體穩(wěn)定性差、生產(chǎn)成本高，限制了對(duì)于乳頭瘤病毒的檢測(cè)。因此應(yīng)用納米抗體技術(shù)研發(fā)乳頭瘤病毒的檢測(cè)試劑具有廣闊的前景。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種HPV16E7蛋白納米抗體。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述HPV16E7蛋白納米抗體的制備方法。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是，提供上述HPV16E7蛋白納米抗體在檢測(cè)HPV16E7蛋白中的應(yīng)用。HPV16E7蛋白納米抗體，所述HPV16E7蛋白納米抗體的包括框架區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)：其中，所述框架區(qū)包括如下序列：如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述互補(bǔ)決定區(qū)包括如下序列如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3；或者，所述框架區(qū)包括如下序列：如SEQIDNO.8所示的FR1，如SEQIDNO.9所示的FR2，如SEQIDNO.10所示的FR3，如SEQIDNO.11所示的FR4；所述互補(bǔ)決定區(qū)包括如下序列如SEQIDNO.12所示的CDR1，如SEQIDNO.13所示的CDR2，如SEQIDNO.14所示的CDR3。HPV16E7蛋白納米抗體，所述HPV16E7蛋白納米抗體的氨基酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示。編碼HPV16E7蛋白納米抗體的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示。一種重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞包含SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的序列。上述HPV16E7蛋白納米抗體的制備方法，包括如下步驟：將SEQIDNO.17或SEQIDNO.18所示的核苷酸序列克隆到表達(dá)質(zhì)粒上，再將得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)，得到HPV16E7蛋白納米抗體。其中，所述表達(dá)質(zhì)粒為pET28a。其中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌BL21。上述HPV16E7蛋白納米抗體在檢測(cè)HPV16E7蛋白中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。有益效果：本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：本發(fā)明利用原核表達(dá)的HPV16E7抗原免疫駱駝，獲得高質(zhì)量的免疫納米抗體基因庫。然后將HPV16E7蛋白包被在酶標(biāo)板上，利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫納米抗體基因庫，從而獲得HPV16E7特異性的納米抗體基因，再將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的納米抗體株。附圖說明圖1是pSUMO-HPVl6E7蛋白原核表達(dá)SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)全菌；2為IPTG誘導(dǎo)全菌。圖2是pSUMO-HPVl6E7蛋白鎳柱親和層析純化后的蛋白SDS-PAGE電泳圖：1為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；2為目的蛋白。圖3是nest-PCR1產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1為nest-PCR1產(chǎn)物。圖4是nest-PCR2產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1為nest-PCR2產(chǎn)物即擴(kuò)增所得的VHH片段。圖5是HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性鑒定圖：M為DNA分子標(biāo)準(zhǔn)；1-17是HPVl6E7蛋白納米抗體文庫中隨機(jī)挑選的單克隆噬菌體PCR產(chǎn)物。圖6.HPVl6E7蛋白納米抗體1誘導(dǎo)表達(dá)純化的SDS-PAGE電泳圖：M為蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1為未誘導(dǎo)全菌；2為IPTG誘導(dǎo)全菌；3為超聲破碎沉淀；4為超聲破碎上清；5-6為流穿液；7，8為純化所得的HPVl6E7蛋白納米抗體。圖7.HPVl6E7蛋白納米抗體的免疫印跡親和性分析.l：pSUMO空質(zhì)粒表達(dá)蛋白對(duì)照，2：HPVl6E7具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實(shí)施例1：HPVl6E7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化(1)HPVl6E7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)首先將成功構(gòu)建好的pSUMO-HPVl6E7載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，獲得pSUMO-HPVl6E7重組菌，挑選單克隆于卡那霉素液體LB中，培養(yǎng)過夜；然后以1：100接種于含卡那霉素液體LB中，培養(yǎng)1.5-2h，當(dāng)菌液OD600為0.6～0.8時(shí)，用23℃，16h，0.1mmol/LIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。圖1SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的HPVl6E7蛋白表達(dá)菌在35KD處有一條帶，符合目的蛋白的預(yù)期分子量。(2)HPVl6E7蛋白的純化通過Ni-IDA親和層析的方法獲得純化的HPVl6E7蛋白。層析柱首先用菌體緩沖液清洗，加入Ni-IDA填充層析柱；將上述菌體超聲上清加入鎳柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床體積的清洗緩沖液(40mmol/L咪唑，菌體緩沖液)洗掉雜蛋白；用等體積的洗脫緩沖液(250mmol/L咪唑，菌體緩沖液)洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。圖2SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)鎳柱純化的HPVl6E7蛋白，蛋白純度高達(dá)90％以上。實(shí)施例2：HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的構(gòu)建(1)HPVl6E7蛋白免疫新疆雙峰駱駝將1mg的HPVl6E7蛋白與等體積的弗氏佐劑混合均勻，免疫新疆雙峰駱駝(皮下注射3-5點(diǎn))，共免疫注射7次(首次用完全弗氏佐劑，其余用不完全弗氏佐劑)；免疫結(jié)束后，取免疫后駱駝的外周血200ml,分離獲得外周血淋巴細(xì)胞。(2)外周血淋巴細(xì)胞的分離及其總RNA的提取首先采用Percoll密度梯度離心分離純化駱駝外周血淋巴細(xì)胞。將淋巴細(xì)胞用生理鹽水清洗幾次后，加入Trizol,室溫靜置10min；然后加入氯仿劇烈震蕩，室溫靜置15min；離心后，收集上層水相加入異丙醇混勻，室溫靜置10min；離心去上清，75％乙醇清洗RNA，并用DEPC水溶解。(3)逆轉(zhuǎn)錄PCRI.采用invitrogen公司的SuperScriptIIIFirst-StrandSynthesisSystemforRT-PCR試劑盒，將外周血淋巴細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過nest-PCR擴(kuò)增得到駱駝重鏈抗體的VHH片段。表1nest-PCR引物名稱及序列引物引物序列nest-PCR1up5'>GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG<3'nest-PCR1down5'>GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC<3'nest-PCR2up5'>CCGGAATTCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG<3'nest-PCR2down5'>GCCCAAGCTTTGAGGAGACGGTGACCTGGGT<3'II.nest-PCR125ul體系以上述所得的cDNA為模板，nest-PCR1up和nest-PCR1down為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：PCR條件：PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，圖3凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增基因片段在700bp處有特異性條帶。切膠回收目的條帶。III.nest-PCR225ul體系以nestPCR1DNA回收產(chǎn)物為模板，nest-PCR2up和nest-PCR2down為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：PCR條件：PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，圖4凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增基因片段在500bp處有特異性條帶。切膠回收目的條帶，即為VHH片段。(4)VHH片段的雙酶切使用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)體系如下：37℃水浴3小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。(5)T7噬菌體抗體庫的構(gòu)建選用Novagen公司的T7Select10試劑盒構(gòu)建納米抗體庫。依據(jù)其說明書進(jìn)行VHH片段和T7載體的連接以及T7噬菌體的包裝。通過噬菌斑滴度測(cè)定，構(gòu)建的HPVl6E7蛋白納米抗體庫滴度大約為1×107pfu/ml。(6)T7噬菌體抗體庫的擴(kuò)增選用液體裂解法對(duì)T7噬菌體抗體庫進(jìn)行擴(kuò)增。在50mlTB培養(yǎng)基中加入1ml培養(yǎng)過夜的宿主BLT5403菌液，37℃，200r培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0；加入⑸中所得的T7噬菌體抗體庫，37℃，200r培養(yǎng)至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)時(shí)，停止培養(yǎng)；13000rpm,10min離心，上清為擴(kuò)增的T7噬菌體抗體庫；對(duì)其進(jìn)行噬菌斑滴度測(cè)定，其滴度為1×1010pfu/ml。(7)檢測(cè)HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性隨機(jī)挑⑸中的噬菌斑于50ul10mMEDTA中,劇烈震蕩混勻，65℃水浴15min，13000rpm離心10min，上清為粗提的噬菌體DNA；以其為模板，按照Novagen公司的T7Select10試劑盒說明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物(見圖5)，圖5電泳結(jié)果顯示，構(gòu)建的HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的重組陽性率為100％。然后對(duì)其測(cè)序，分析HPVl6E7蛋白納米抗體文庫的多樣性。PCR反應(yīng)體系如下：PCR條件如下：測(cè)序結(jié)果顯示，17個(gè)單克隆噬菌斑，有15種核酸序列，并且這些序列翻譯成的氨基酸序列也不相同，說明構(gòu)建的HPVl6E7蛋白納米抗體文庫有很好的多樣性。實(shí)施例3：運(yùn)用鎳離子金屬螯合親和層析介質(zhì)Ni-NTA淘選HPV16E7納米抗體。(1)Ni-NTA介質(zhì)的清洗：取100ulNi-NTA介質(zhì)于1.5mlEP管中，加1ml滅菌水，渦旋震蕩儀混勻；3000rpm，30s離心，棄上清；共洗5次，最后一次用0.05％TBST代替滅菌水。(2)封閉：洗好的Ni-NTA介質(zhì)加入1ml封閉液(0.5％BSA)，翻轉(zhuǎn)搖勻1h；封閉結(jié)束后，1mlTBST洗4次。(3)負(fù)篩去除非特異結(jié)合的噬菌體：HPVl6E7的VHH-T7噬菌體庫用TBST稀釋至1ml，加入到封閉后的Ni-NTA介質(zhì)中，置于翻轉(zhuǎn)搖勻儀上，室溫結(jié)合30min；離心，上清即為負(fù)篩后的T7噬菌體庫。(4)與HPVl6E7特異結(jié)合的噬菌體的篩選：負(fù)篩后的HPVl6E7噬菌體庫加入20ugHPVl6E7蛋白(1ug/ul)，室溫結(jié)合30min。然后將混合物加入到封閉好的Ni-NTA介質(zhì)中，室溫結(jié)合30min；離心，棄上清。1mlTBST洗獲得的沉淀，共洗5次；離心，棄上清；加入400ulTB培養(yǎng)基混勻，平均分為兩份，一份用來測(cè)定篩選后的噬菌體的滴度，一份用來擴(kuò)增篩選后的噬菌體。(5)篩選后的噬菌體的擴(kuò)增：將篩選后的噬菌體加入到50mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中，37℃震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)至有白色絮狀沉淀出現(xiàn)時(shí)，停止培養(yǎng)；離心，上清即為擴(kuò)增的第一輪篩選后的噬菌體，置于4℃保存，并用于下一輪的篩選；按相同篩選步驟，篩選3-4輪。實(shí)施例4：ELISA鑒定特異性的HPVl6E7蛋白VHH-T7陽性克隆。上述最后一輪篩選所得的噬菌體，在150mm的TB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并挑選70個(gè)單克隆噬菌斑于3mlOD600＝0.6的BLT5403宿主菌中進(jìn)行液體裂解法擴(kuò)增，離心，上清于4℃保存，即為單克隆噬菌體；ELISA板每孔加入2ugHPVl6E7蛋白包被，置于4℃過夜，第二天0.5％BSA室溫封閉1h；實(shí)驗(yàn)組每孔加入單克隆噬菌體，對(duì)照組加入等量的野生型T7噬菌體，室溫孵育1-2h；200ulTBST洗去未結(jié)合的噬菌體，共洗5次，然后加入兔抗T7噬菌體10A抗體，室溫孵育1-2h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，室溫孵育1h；TBST洗ELISA板3-5次，然后加入顯色液，避光反應(yīng)10min，ELISA板置于酶標(biāo)儀上，測(cè)吸光值，當(dāng)實(shí)驗(yàn)孔與對(duì)照孔吸光值比值大于2時(shí)，判定其為陽性克隆；提取陽性克隆噬菌體的DNA進(jìn)行測(cè)序。ELISA鑒定結(jié)果顯示，獲得30個(gè)陽性克隆。然后對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序，獲得2種核苷酸序列；對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行分析，這兩種序列均具有典型的納米抗體結(jié)構(gòu)，由框架區(qū)(FR1，F(xiàn)R2，F(xiàn)R4，F(xiàn)R4)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1，CDR2和CDR3)構(gòu)成。這兩株單克隆噬菌體的核苷酸序列，氨基酸序列如下：HPVl6E7的VHH1：核苷酸序列(SEQIDNO.17)：CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTACACCAGCAGTAGCTGCAGCATGGGCTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGTTGGTCGCAACTATTTTTGCGGATGGTAGGACACGCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTAACACGGATGCACATGGCTCTTATAGTGACTATGACTGTGTGAATTGGAATAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.15)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGYTSSSCSMGWYRQAPGKERELVATIFADGRTRYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCNTDAHGSYSDYDCVNWNNYWGQGTQVTVSS框架區(qū)(FR1-FR4)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.1)：QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASCDR1(SEQIDNO.5)：GYTSSSCSMGFR2(SEQIDNO.2)：WYRQAPGKERELVATCDR2(SEQIDNO.6)：IFADGRTRFR3(SEQIDNO.3)：YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCCDR3(SEQIDNO.7)：NTDAHGSYSDYDCVNWNNYFR4(SEQIDNO.4)：WGQGTQVTVSSHPVl6E7的VHH2：核苷酸序列(SEQIDNO.18)：GATGTGCAGCTGGTCAATACCATGAGTAACGAGAAGCTGGATGTAGAAGGCGTTACCAGCAAGTATGGGGTACGCCCAGATCAGATTATCGATTATTTAATGCTGATTGGCGACACTTCGGACAATATTCCCGGCGTTCCCAAGGTGGGGCCCAAGACGGCCGCCAAGTGGTTGGGCGAATATGGCAGTCTGGATGAACTGTTGCAGCATGCCGACAAAATCAAGGGGGTGGCCGGCCAGAATCTGGCCGGCAGCAGCTCCAACTTTGAAATGACGCGCAAACTGGTCACCGTCTCCTCA氨基酸序列(SEQIDNO.16)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRPDQIIDYLMLIGDTSDNIPGVPKVGPKTAAKWLGEYGSLDELLQHADKIKGVAGQNLAGSSSNFEMTRKLVTVSS框架區(qū)(FR1-FR4)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1-CDR3)氨基酸序列：FR1(SEQIDNO.8)：DVQLVNTMSNEKLDVEGVTSKYGVRCDR1(SEQIDNO.12)：PDQIIDYLMLFR2(SEQIDNO.9)：IGDTSDNIPGVPKVGCDR2(SEQIDNO.13)：PKTAAKWLFR3(SEQIDNO.10)：GEYGSLDELLQHADKIKGVAGQCDR3(SEQIDNO.14)：NLAGSSSNFFR4(SEQIDNO.11)：EMTRKLVTVSS實(shí)施例5：HPVl6E7蛋白納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)和純化(1)HPVl6E7蛋白納米抗體的誘導(dǎo)表達(dá)首先將HPVl6E7蛋白納米抗體的基因序列用TAKARA公司的EcoRI和HindⅢ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收酶切產(chǎn)物，分別將其插入到pET28a中，成功構(gòu)建HPVl6E7蛋白納米抗體的表達(dá)載體；將HPVl6E7蛋白納米抗體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，涂卡那霉素抗性LB平板培養(yǎng)基，挑單克隆菌株，培養(yǎng)過夜。以1:100的比例將HPVl6E7蛋白納米抗體表達(dá)菌加入到培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8時(shí)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。離心菌液獲得菌體沉淀，用裂解緩沖液重懸，置于冰盒內(nèi)超聲破碎，離心收集上清。(2)HPVl6E7蛋白納米抗體的純化通過Ni-IDA親和層析的方法獲得純化的HPVl6E7蛋白納米抗體。層析柱首先用菌體緩沖液清洗，加入Ni-IDA填充層析柱；將上述HPVl6E7蛋白納米抗體表達(dá)菌菌體超聲上清加入鎳柱中，控制流速，使流穿液以2ml/min的流速流出；用至少3倍柱床體積的清洗緩沖液(40mmol/L咪唑)洗掉雜蛋白；用等體積的洗脫緩沖液(250mmol/L咪唑)洗脫目的蛋白，并收集洗脫液。然后用15％SDS-PAGE電泳檢測(cè)HPVl6E7納米抗體的表達(dá)純化情況。(見圖6)。SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果：圖6結(jié)果顯示，誘導(dǎo)后的HPVl6E7蛋白納米抗體1表達(dá)菌與其未誘導(dǎo)的表達(dá)菌相比較，在20KD處有一條帶，且符合目的蛋白的預(yù)期分子量；通過灰度分析，純化所得的HPVl6E7蛋白納米抗體的純度大于90％。實(shí)施例6:HPVl6E7蛋白納米抗體的免疫印跡親和性分析對(duì)pSUMO-HPVl6E7質(zhì)粒表達(dá)得到的HPV16E7蛋白及對(duì)照空質(zhì)粒表達(dá)蛋白進(jìn)行WesternBlot鑒定，結(jié)果表明HPVl6E7蛋白納米抗體與HPVl6E7蛋白具有較好的結(jié)合能力，與空載體表達(dá)的蛋白不能結(jié)合，DAB顯色后在大約35kDa位置有清晰的目標(biāo)條帶(圖7)。實(shí)施例7:HPVl6E7蛋白納米抗體的ELISA法親和性分析以HPVl6E7蛋白和pSUMO空質(zhì)粒表達(dá)蛋白包被酶標(biāo)板，包被濃度10ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被過夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封閉液，室溫封閉一小時(shí)。丟棄封閉液并用TBST洗3次，加入HPVl6E7納米抗體，或?qū)φ誻asabi納米抗體，室溫孵育一小時(shí)。TBST洗板3次后，加入1:1000稀釋的兔抗HA單克隆抗體，200μl/孔，室溫孵育一小時(shí)。TBST洗板3次，加入1:2000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，200μl/孔，室溫孵育一小時(shí)。TBST洗板3次，每孔加入100ul的TMB顯色液，ELISA板置于酶標(biāo)儀上，測(cè)450nm吸光值。結(jié)果見表2，ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：HPVl6E7納米抗體對(duì)HPVl6E7的結(jié)合活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于wasabi納米抗體對(duì)照組及pSUMO空質(zhì)粒表達(dá)蛋白組.。表2ELISA檢測(cè)HPVl6E7納米抗體的親和性SEQUENCELISTING<110>東南大學(xué)<120>HPV16E7蛋白納米抗體及其制備方法與應(yīng)用<130>SG20161130001<160>18<170>PatentInversion3.5<210>1<211>25<212>PRT<213>VHH1的FR1序列<400>1GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSer2025<210>2<211>15<212>PRT<213>VHH1的FR2序列<400>2TrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuValAlaThr151015<210>3<211>37<212>PRT<213>VHH1的FR3序列<400>3TyrAlaAspSerValLysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAla151015LysAsnThrValTyrLeuGlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThr202530AlaMetTyrTyrCys35<210>4<211>11<212>PRT<213>VHH1的FR4序列<400>4TrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer1510<210>5<211>10<212>PRT<213>VHH1的CDR1序列<400>5GlyTyrThrSerSerSerCysSerMetGly1510<210>6<211>8<212>PRT<213>VHH1的CDR2序列<400>6IlePheAlaAspGlyArgThrArg15<210>7<211>19<212>PRT<213>VHH1的CDR3序列<400>7AsnThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrp151015AsnAsnTyr<210>8<211>25<212>PRT<213>VHH2的FR1序列<400>8AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArg2025<210>9<211>15<212>PRT<213>VHH2的FR2序列<400>9IleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLysValGly151015<210>10<211>22<212>PRT<213>VHH2的FR3序列<400>10GlyGluTyrGlySerLeuAspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIle151015LysGlyValAlaGlyGln20<210>11<211>11<212>PRT<213>VHH2的FR4序列<400>11GluMetThrArgLysLeuValThrValSerSer1510<210>12<211>10<212>PRT<213>VHH2的CDR1序列<400>12ProAspGlnIleIleAspTyrLeuMetLeu1510<210>13<211>8<212>PRT<213>VHH2的CDR2序列<400>13ProLysThrAlaAlaLysTrpLeu15<210>14<211>9<212>PRT<213>VHH2的CDR3序列<400>14AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPhe15<210>15<211>125<212>PRT<213>VHH1的氨基酸序列<400>15GlnValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlySerValGlnAlaGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyTyrThrSerSerSerCys202530SerMetGlyTrpTyrArgGlnAlaProGlyLysGluArgGluLeuVal354045AlaThrIlePheAlaAspGlyArgThrArgTyrAlaAspSerValLys505560GlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnThrValTyrLeu65707580GlnMetAsnSerLeuLysProGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAsn859095ThrAspAlaHisGlySerTyrSerAspTyrAspCysValAsnTrpAsn100105110AsnTyrTrpGlyGlnGlyThrGlnValThrValSerSer115120125<210>16<211>100<212>PRT<213>VHH2的氨基酸序列<400>16AspValGlnLeuValAsnThrMetSerAsnGluLysLeuAspValGlu151015GlyValThrSerLysTyrGlyValArgProAspGlnIleIleAspTyr202530LeuMetLeuIleGlyAspThrSerAspAsnIleProGlyValProLys354045ValGlyProLysThrAlaAlaLysTrpLeuGlyGluTyrGlySerLeu505560AspGluLeuLeuGlnHisAlaAspLysIleLysGlyValAlaGlyGln65707580AsnLeuAlaGlySerSerSerAsnPheGluMetThrArgLysLeuVal859095ThrValSerSer100<210>17<211>375<212>DNA<213>VHH1的核苷酸序列<400>17caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactc60tcctgtgcagcctctgggtacaccagcagtagctgcagcatgggctggtaccgccaggct120ccagggaaggagcgcgagttggtcgcaactatttttgcggatggtaggacacgctatgca180gactccgtgaagggccgattcaccatctcccgagacaacgccaagaacacggtgtatctg240caaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccatgtattactgtaacacggatgcacat300ggctcttatagtgactatgactgtgtgaattggaataactactggggccaggggacccag360gtcaccgtctcctca375<210>18<211>300<212>PRT<213>VHH2的核苷酸序列<400>18GlyAlaThrGlyThrGlyCysAlaGlyCysThrGlyGlyThrCysAla151015AlaThrAlaCysCysAlaThrGlyAlaGlyThrAlaAlaCysGlyAla202530GlyAlaAlaGlyCysThrGlyGlyAlaThrGlyThrAlaGlyAlaAla354045GlyGlyCysGlyThrThrAlaCysCysAlaGlyCysAlaAlaGlyThr505560AlaThrGlyGlyGlyGlyThrAlaCysGlyCysCysCysAlaGlyAla65707580ThrCysAlaGlyAlaThrThrAlaThrCysGlyAlaThrThrAlaThr859095ThrThrAlaAlaThrGlyCysThrGlyAlaThrThrGlyGlyCysGly100105110AlaCysAlaCysThrThrCysGlyGlyAlaCysAlaAlaThrAlaThr115120125ThrCysCysCysGlyGlyCysGlyThrThrCysCysCysAlaAlaGly130135140GlyThrGlyGlyGlyGlyCysCysCysAlaAlaGlyAlaCysGlyGly145150155160CysCysGlyCysCysAlaAlaGlyThrGlyGlyThrThrGlyGlyGly165170175CysGlyAlaAlaThrAlaThrGlyGlyCysAlaGlyThrCysThrGly180185190GlyAlaThrGlyAlaAlaCysThrGlyThrThrGlyCysAlaGlyCys195200205AlaThrGlyCysCysGlyAlaCysAlaAlaAlaAlaThrCysAlaAla210215220GlyGlyGlyGlyGlyThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysCysAlaGly225230235240AlaAlaThrCysThrGlyGlyCysCysGlyGlyCysAlaGlyCysAla245250255GlyCysThrCysCysAlaAlaCysThrThrThrGlyAlaAlaAlaThr260265270GlyAlaCysGlyCysGlyCysAlaAlaAlaCysThrGlyGlyThrCys275280285AlaCysCysGlyThrCysThrCysCysThrCysAla290295300當(dāng)前第1頁1 2 3