本發(fā)明涉及分子檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及microRNA檢測(cè)探針組與microRNA的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：MicroRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為19-24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。由于miRNA能夠很好的識(shí)別并配對(duì)后轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)而調(diào)控蛋白的表達(dá)，所以它與動(dòng)物體內(nèi)的生物過(guò)程息息相關(guān)。目前已經(jīng)有研究表明：miRNA的異常行為會(huì)導(dǎo)致疾病的出現(xiàn)，包括心血管疾病，神經(jīng)發(fā)育失常，甚至癌癥[Nature,2012,482,347.]。例如miRNA-32的過(guò)表達(dá)是前列腺癌的基礎(chǔ)的重要標(biāo)志物[Oncogene2012,31,4460.]，miRNA-122也被作為肝癌細(xì)胞發(fā)病的一個(gè)基礎(chǔ)標(biāo)志物[J.Am.Chem.Soc.2010,132,7976.]。所以在癌癥的診斷以及治療過(guò)程中miRNA的濃度都是一個(gè)重要的生物指標(biāo)。目前，通用的miRNA檢測(cè)方法有qRT-PCR，Northernblot，寡核苷酸微陣列[Chem.Rev.,2013,113,6207.]，其中NorthernBlotting是最經(jīng)典的miRNA檢測(cè)手段，但是它本身檢測(cè)靈敏度較低，并且需要大量的樣品。而微陣列具有高通量檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，但是檢測(cè)需要的時(shí)間很長(zhǎng)，并且精度不高。qRT-PCR檢測(cè)手段具有高精度，高靈敏度的特點(diǎn)，但是需要長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)增步驟并且對(duì)操作人員具有一定的技能要求，這在實(shí)時(shí)檢測(cè)中是一個(gè)很大的問(wèn)題。但是上述方法最大的一個(gè)問(wèn)題是所有的實(shí)驗(yàn)都是基于細(xì)胞裂解處理，無(wú)法實(shí)時(shí)的反映出腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞內(nèi)部真實(shí)的miRNA的作用機(jī)制。因此為了能更加深入了解miRNA在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的真實(shí)信息以及探索miRNA在細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的miRNA的檢測(cè)則尤為重要?，F(xiàn)如今體內(nèi)miRNA檢測(cè)手段主要分為原位雜交技術(shù)和動(dòng)態(tài)成像技術(shù)。在動(dòng)態(tài)成像技術(shù)中基于分子信標(biāo)成像是一個(gè)非常重要的手段。借助特殊的轉(zhuǎn)染技術(shù)將熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，分子信標(biāo)與目標(biāo)miRNA分子配對(duì)后發(fā)生結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)的出現(xiàn)，最終實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測(cè)。[Biomaterials,2012,33,6430.]但是這些技術(shù)中存在一個(gè)明顯的問(wèn)題就是每次的信號(hào)分子的輸出都伴隨著目標(biāo)分子的消耗。而在腫瘤細(xì)胞或腫瘤組織中的miRNA分子表達(dá)非常的有限，所以上述的技術(shù)在實(shí)現(xiàn)腫瘤組織活細(xì)胞內(nèi)miRNA分子的檢測(cè)具有很大的限制。因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中細(xì)胞內(nèi)miRNA分子檢測(cè)的困難，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)利用級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞或組織內(nèi)microRNA檢測(cè)具有簡(jiǎn)單操作，可以實(shí)現(xiàn)低濃度檢測(cè)等特點(diǎn)，但是，如何避免級(jí)聯(lián)DNA鏈替換反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生的熒光信號(hào)的泄露現(xiàn)象，仍是本領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供microRNA檢測(cè)探針組與microRNA的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的探針設(shè)置合理，能夠有效避免熒光信號(hào)的泄露，提高檢測(cè)的特異性。本發(fā)明提供的檢測(cè)microRNA的探針組，由4條DNA探針組成，分別為：基底鏈、信號(hào)鏈、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈；所述基底鏈包括順序連接的淬滅基團(tuán)、準(zhǔn)粘性末端和待測(cè)microRNA的互補(bǔ)序列；所述信號(hào)鏈與基底鏈互補(bǔ)，所述信號(hào)鏈一端修飾有熒光基團(tuán)；所述保護(hù)燃料鏈與待測(cè)microRNA互補(bǔ)；所述主導(dǎo)燃料鏈包括順序連接的待測(cè)microRNA序列一致的DNA序列和互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端。本發(fā)明的探針組中，淬滅基團(tuán)位于基底鏈的3’端，則熒光基團(tuán)位于信號(hào)鏈的5’端；淬滅基團(tuán)位于基底鏈的5’端，則熒光基團(tuán)位于信號(hào)鏈的3’端。本發(fā)明實(shí)施例中，淬滅基團(tuán)位于基底鏈的5’端，而熒光基團(tuán)位于信號(hào)鏈的3’端。本發(fā)明提供的探針組根據(jù)待測(cè)microRNA的序列設(shè)計(jì)。其中基底鏈與信號(hào)鏈部分互補(bǔ)、保護(hù)燃料鏈與主導(dǎo)燃料鏈部分互補(bǔ)。以本發(fā)明提供的探針組對(duì)待測(cè)miRNA進(jìn)行檢測(cè)的原理如圖1：首先，將基底鏈與信號(hào)鏈雜交，使基底鏈與信號(hào)鏈形成雙鏈A。形成雙鏈后，信號(hào)鏈末端的熒光基團(tuán)會(huì)與基底鏈末端的淬滅基團(tuán)非常的靠近，熒光基團(tuán)被淬滅，沒(méi)有熒光信號(hào)的輸出。然后，將主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈雜交，形成雙鏈B。然后，將雙鏈A和雙鏈B在轉(zhuǎn)染劑的作用下，轉(zhuǎn)染入動(dòng)物體(或人體)、組織或細(xì)胞中。當(dāng)雙鏈A和雙鏈B進(jìn)入生物體(或人體)、組織或細(xì)胞中，在鹽離子的作用下，發(fā)生鏈替換反應(yīng)，反應(yīng)步驟為：一、待測(cè)miRNA首先與雙鏈A上的裸露的一端作用，進(jìn)而發(fā)生鏈替換反應(yīng)，其中，待測(cè)miRNA與基底鏈形成中間體1；而信號(hào)鏈則被釋放，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光信號(hào)；二、中間體1與雙鏈B發(fā)生鏈替換反應(yīng)，其中，miRNA與保護(hù)燃料鏈形成中間體2；而主導(dǎo)燃料鏈和基底鏈結(jié)合形成雙鏈C，不再發(fā)光；三、中間體2與雙鏈A發(fā)生鏈替換反應(yīng)，其中，miRNA與基底鏈結(jié)合形成中間體1，而保護(hù)燃料鏈則與信號(hào)鏈結(jié)合，形成雙鏈的信號(hào)鏈，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。在上述過(guò)程中，DNA鏈替換反應(yīng)使得，信號(hào)鏈被釋放為單鏈或者和與保護(hù)燃料鏈結(jié)合形成雙鏈信號(hào)鏈，從而使得熒光基團(tuán)得以發(fā)出熒光。而由于miRNA與保護(hù)燃料鏈形成中間體2后，仍然能夠用于觸發(fā)與雙鏈A的反應(yīng)，從而使得級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)不斷發(fā)生，實(shí)現(xiàn)了熒光基團(tuán)不斷被釋放，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)不斷被放大。本發(fā)明充分利用了級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)在信號(hào)放大上的能力，最終實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)miRNA分子的檢測(cè)。本發(fā)明提供的方法不再需要將miRNA從樣品中分離，而是通過(guò)將探針轉(zhuǎn)染入動(dòng)物體(或人體)、組織或細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)體內(nèi)，或細(xì)胞內(nèi)miRNA分子的檢測(cè)，從而能夠更加深入了解miRNA在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的真實(shí)信息以及探索miRNA在細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。為了避免探針在體外就發(fā)生鏈替換反應(yīng)，本發(fā)明對(duì)4條探針的長(zhǎng)度、準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度、互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度、熒光基團(tuán)或淬滅基團(tuán)的位置和種類(lèi)進(jìn)行了研究。本發(fā)明中，基底鏈順序連接的淬滅基團(tuán)、準(zhǔn)粘性末端和待測(cè)microRNA的互補(bǔ)序列；信號(hào)鏈與基底鏈互補(bǔ)，信號(hào)鏈一端修飾有熒光基團(tuán)。本發(fā)明中，基底鏈上準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度為4bp～5bp。優(yōu)選的，基底鏈上準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度為5bp。本發(fā)明中，信號(hào)鏈未修飾熒光基團(tuán)的一端比基底鏈短5bp～6bp。優(yōu)選的，信號(hào)鏈未修飾熒光基團(tuán)的一端比基底鏈短6bp。本發(fā)明中，淬滅基團(tuán)為BHQ-1，Dabcyl或BHQ-2；所述熒光基團(tuán)為FAM或Cy3，Cy-5。基底鏈上比信號(hào)鏈長(zhǎng)出的部分是待測(cè)microRNA的互補(bǔ)序列。以互補(bǔ)序列形成裸露端，有利于鏈替換反應(yīng)的發(fā)生，而實(shí)驗(yàn)表明，6bp的裸露端更有利于發(fā)生鏈替換反應(yīng)，產(chǎn)生熒光的時(shí)間短且熒光值較高。在一些實(shí)施例中，基底鏈的5’端至3’端依次連接淬滅基團(tuán)，準(zhǔn)粘性末端、與待測(cè)microRNA的互補(bǔ)序列。其中，淬滅基團(tuán)為BHQ-2；準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度為5bp，所述與待測(cè)microRNA的互補(bǔ)序列為與待測(cè)microRNA全長(zhǎng)完全互補(bǔ)的DNA序列。所述準(zhǔn)粘性末端的序列不使基底鏈產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，信號(hào)鏈3’端至5’端依次連接熒光基團(tuán)、互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端和與待測(cè)miRNA序列一致的DNA序列。其中，熒光基團(tuán)為Cy-5；互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度為5bp，互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端與基底鏈上的準(zhǔn)粘性末端完全互補(bǔ)；與待測(cè)miRNA序列一致的DNA序列與基底鏈上的相應(yīng)片段部分互補(bǔ)，該片段與miRNA相比5’端缺少6bp。當(dāng)待測(cè)miRNA與信號(hào)鏈和基底鏈形成的雙鏈A發(fā)生鏈替換反應(yīng)后，由miRNA與基底鏈形成的中間體1中，基底鏈上準(zhǔn)粘性末端被暴露出來(lái)，形成裸露端。本發(fā)明實(shí)施例中，中間體1中的裸露端的長(zhǎng)度為5bp。本發(fā)明中，所述保護(hù)燃料鏈與待測(cè)microRNA互補(bǔ)；所述主導(dǎo)燃料鏈的包括順序連接的待測(cè)microRNA序列一致的DNA序列和互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端。本發(fā)明中，保護(hù)燃料鏈的長(zhǎng)度為14bp～15bp。優(yōu)選的，保護(hù)燃料鏈的長(zhǎng)度為14bp。優(yōu)選的，保護(hù)燃料鏈上與待測(cè)microRNA互補(bǔ)的序列長(zhǎng)度為13bp，在該序列的5’端添加一個(gè)堿基，以促使鏈替換反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明中，主導(dǎo)燃料鏈上的互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端與所述基底鏈上的準(zhǔn)粘性末端互補(bǔ)；所述主導(dǎo)燃料鏈上與待測(cè)microRNA序列一致的DNA序列長(zhǎng)度為17bp～19bp。優(yōu)選的，所述主導(dǎo)燃料鏈上與待測(cè)microRNA序列一致的DNA序列長(zhǎng)度為18bp。本發(fā)明中，主導(dǎo)燃料鏈與保護(hù)燃料鏈形成雙鏈B后，主導(dǎo)燃料鏈的3’端上的互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端被裸露出來(lái)，該末端與基底鏈上的準(zhǔn)粘性末端互補(bǔ)；主導(dǎo)燃料鏈的5’端裸露4bp。在反應(yīng)過(guò)程中，中間體1中基底鏈裸露的準(zhǔn)粘性末端與雙鏈B中主導(dǎo)燃料鏈上裸露的互補(bǔ)準(zhǔn)粘性末端結(jié)合，從而引導(dǎo)鏈替換反應(yīng)的發(fā)生，基底鏈與主導(dǎo)燃料鏈結(jié)合形成雙鏈C不再發(fā)光。而miRNA和保護(hù)燃料鏈則結(jié)合，形成中間體2。中間體2中，miRNA的5’端裸露9bp，該裸露部分可以與雙鏈A中基底鏈裸露的部分互補(bǔ)，從而引導(dǎo)鏈替換反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。本發(fā)明通過(guò)合理設(shè)計(jì)DNA分子探針，使細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)miRNA能夠觸發(fā)級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而有效的釋放具有熒光基團(tuán)修飾的信號(hào)鏈，在有限的目標(biāo)鏈的條件下，兩條燃料鏈組成的雙鏈B的存在能夠最大限度的放大所釋放的具有熒光基團(tuán)修飾的信號(hào)鏈的數(shù)目，進(jìn)而通過(guò)激光共聚焦顯微鏡或者小動(dòng)物成像儀最終實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)或者腫瘤組織內(nèi)miRNA的檢測(cè)。且通過(guò)合理探針的設(shè)計(jì)，有效避免了熒光信號(hào)的泄露。且探針的設(shè)計(jì)巧妙的避免了鏈替換反應(yīng)逆向發(fā)生，從而使得鏈替換反應(yīng)一旦發(fā)生，便不再可逆，被釋放出的信號(hào)鏈不會(huì)再與基底鏈結(jié)合。本發(fā)明提供的探針依靠鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大，由于鏈替換反應(yīng)的發(fā)生條件并不復(fù)雜，在細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)廣泛的發(fā)生。只要引物設(shè)計(jì)合理，鏈替換反應(yīng)即可發(fā)生。因此，按照本發(fā)明提供探針組的形式設(shè)計(jì)探針，對(duì)不同序列的microRNA皆能夠?qū)崿F(xiàn)檢測(cè)。該探針組能夠廣泛的應(yīng)用于各種microRNA的檢測(cè)。但探針中準(zhǔn)粘性末端的長(zhǎng)度、裸露端的長(zhǎng)度、互補(bǔ)序列的長(zhǎng)度可能影響熒光信號(hào)的產(chǎn)生。本發(fā)明提供的探針組基于級(jí)聯(lián)的DNA鏈替換反應(yīng)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)或者腫瘤組織內(nèi)miRNA檢測(cè)，特別是在miRNA分子低表達(dá)的細(xì)胞或者組織中具有非常好的優(yōu)勢(shì)。解決了在之前的檢測(cè)技術(shù)中存在檢測(cè)體系中信號(hào)分子輸出中伴隨著目標(biāo)鏈損失的巨大困難。檢測(cè)的范圍也適用于其他類(lèi)型的非編碼RNA分子。同樣該技術(shù)也是細(xì)胞以及其他組織成像中的一種重要手段。本發(fā)明提供的探針組能夠用于活體動(dòng)物體內(nèi)microRNA的檢測(cè)，也可用于培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)的microRNA的檢測(cè)，也可用與離體組織中microRNA的檢測(cè)。通過(guò)本發(fā)明提供的探針，根據(jù)轉(zhuǎn)染后熒光產(chǎn)生的情況，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)microRNA的絕對(duì)定量檢測(cè)或相對(duì)定量檢測(cè)，從而判斷待測(cè)品中microRNA的表達(dá)情況。根據(jù)轉(zhuǎn)染后熒光產(chǎn)生的位置，也可實(shí)現(xiàn)對(duì)microRNA分布情況的檢測(cè)。并能夠通過(guò)多次檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)miRNA表達(dá)隨時(shí)間的變化情況的檢測(cè)。本發(fā)明提供的探針組在制備microRNA的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。由于現(xiàn)有技術(shù)中研究結(jié)果表明，多種miRNA的異常表達(dá)與癌癥相關(guān)，故而本申請(qǐng)?zhí)峁┑奶结樈M能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腫瘤組織的成像，且能夠根據(jù)成像情況、位置判斷腫瘤發(fā)生的程度和位置。本發(fā)明提供的探針組在制備腫瘤組織成像的產(chǎn)品的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種microRNA的檢測(cè)試劑盒，包括本發(fā)明提供的探針組。本發(fā)明提供的microRNA檢測(cè)試劑盒中，還包括轉(zhuǎn)染試劑。所述轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000。本發(fā)明提供的microRNA檢測(cè)試劑盒中，還包括雜交緩沖液。所述雜交緩沖液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5。本發(fā)明提供的microRNA檢測(cè)試劑盒中，基底鏈、信號(hào)鏈、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈的摩爾比為(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)microRNA的方法，包括：步驟1：將本發(fā)明提供的探針組中，所述基底鏈與所述信號(hào)鏈雜交形成雙鏈A；所述主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈雜交形成雙鏈B；步驟2：將所述雙鏈A與所述雙鏈B轉(zhuǎn)染待測(cè)細(xì)胞、組織或動(dòng)物體后，成像。本發(fā)明提供方法中，基底鏈與信號(hào)鏈雜交的摩爾比為1∶1。雜交的緩沖液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5?；祖溑c信號(hào)鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然后降溫至室溫，室溫下保持不少于2h。優(yōu)選的，室溫為18℃～30℃。保持時(shí)間為2h。雜交后的雙鏈A保存在4℃待用。本發(fā)明提供方法中，主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈雜交的摩爾比為1∶1。主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然后降溫至室溫，室溫下保持不少于2h。優(yōu)選的，室溫為18℃～30℃。保持時(shí)間為2h。雜交后的雙鏈A保存在4℃待用。雜交獲得雙鏈A的濃度為10μmol/L；雜交獲得雙鏈B的濃度為20μmol/L。將雜交獲得的雙鏈A溶液和雙鏈B溶液以體積比1:2混合后，加入轉(zhuǎn)染試劑，然后以雜交緩沖液定容后，復(fù)合20min，制得轉(zhuǎn)染溶液。轉(zhuǎn)染溶液用于轉(zhuǎn)染待測(cè)樣品。其中，所述轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000。轉(zhuǎn)染試劑的用量為雙鏈B溶液體積的1/5。定容至終體積為雙鏈B溶液體積的2倍。最終制得的轉(zhuǎn)染溶液中，雙鏈A的濃度為2.5μmol/L；雙鏈B的濃度為10μmol/L。轉(zhuǎn)染后，間隔0.5h～24h檢測(cè)熒光信號(hào)。對(duì)于體外測(cè)試實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染后0.5h～2h熒光信號(hào)強(qiáng)度即可達(dá)到峰值。而對(duì)于注射轉(zhuǎn)染的動(dòng)物體，熒光信號(hào)需24h左右的時(shí)間，在腫瘤組織內(nèi)富集達(dá)到峰值。轉(zhuǎn)染動(dòng)物體后，探針組一方面富集于腫瘤組織內(nèi)，一方面經(jīng)腎臟和肝臟代謝排出體外。主要經(jīng)腎臟排出體外。本發(fā)明實(shí)施例中提供給了一種檢測(cè)miRNA-21的探針組，由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成；其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探針的5’端修飾淬滅基團(tuán)；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探針的3’端修飾熒光基團(tuán)。其中，SEQIDNO:1所示核苷酸序列的探針為基底鏈；SEQIDNO:2所示核苷酸序列的探針為信號(hào)鏈；SEQIDNO:3所示核苷酸序列的探針為主導(dǎo)燃料鏈；SEQIDNO:4所示核苷酸序列的探針為保護(hù)燃料鏈。本發(fā)明實(shí)施例證明，本發(fā)明提供的探針組合相對(duì)于其他設(shè)計(jì)方案而言，能夠在較短時(shí)間內(nèi)使熒光信號(hào)達(dá)到峰值，且熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，熒光信號(hào)泄露現(xiàn)象被降低。miRNA-21的過(guò)表達(dá)與腫瘤密切相關(guān)，如乳腺癌、宮頸癌等。由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成探針組在制備腫瘤組織成像的產(chǎn)品的應(yīng)用。所述腫瘤為乳腺癌。由MCF-7細(xì)胞系構(gòu)建小鼠乳腺癌模型。miRNA-21檢測(cè)試劑盒中包括由SEQIDNO：1～4所示核苷酸序列的4條DNA探針組成探針組、轉(zhuǎn)染試劑和雜交緩沖液。所述轉(zhuǎn)染試劑為所述轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000。所述雜交緩沖液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液。miRNA-21檢測(cè)試劑盒中，基底鏈、信號(hào)鏈、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈的摩爾比為(0.8～1.2):(0.8～1.2):(2～4):(2～4)。本發(fā)明實(shí)施例還提供了一種腫瘤組織成像的方法，包括：步驟a：將SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的探針雜交形成雙鏈A；將SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的探針雜交形成雙鏈B；步驟b：將所述雙鏈A與所述雙鏈B轉(zhuǎn)染待測(cè)組織或動(dòng)物體后，成像。該實(shí)施例中，SEQIDNO:1所示基底鏈與SEQIDNO:2所示信號(hào)鏈雜交的摩爾比為1∶1。雜交的緩沖液為濃度為10mmol/L的Tris-HCl緩沖液。Tris-HCl中包括0.3mol/LNaCl和5mmol/LMgCl2，pH值為7.5。SEQIDNO:1所示基底鏈與SEQIDNO:2所示信號(hào)鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然后降溫至室溫，室溫下保持不少于2h。優(yōu)選的，室溫為18℃～30℃。保持時(shí)間為2h。雜交后的雙鏈A保存在4℃待用。本發(fā)明提供方法中，SEQIDNO:3所示主導(dǎo)燃料鏈和SEQIDNO:4所示保護(hù)燃料鏈雜交的摩爾比為1∶1。SEQIDNO:3所示主導(dǎo)燃料鏈和SEQIDNO:4所示保護(hù)燃料鏈雜交的條件為：90℃保持15min，然后降溫至室溫，室溫下保持不少于2h。優(yōu)選的，室溫為18℃～30℃。保持時(shí)間為2h。雜交后的雙鏈A保存在4℃待用。雜交獲得雙鏈A的濃度為10μmol/L；雜交獲得雙鏈B的濃度為20μmol/L。將雜交獲得的雙鏈A溶液和雙鏈B溶液以體積比1:2混合后，加入轉(zhuǎn)染試劑，然后以雜交緩沖液定容后，復(fù)合20min，制得轉(zhuǎn)染溶液。轉(zhuǎn)染溶液用于轉(zhuǎn)染待測(cè)樣品。其中，所述轉(zhuǎn)染試劑為L(zhǎng)ipofectamine2000。所述轉(zhuǎn)染試劑的用量與雙鏈A的摩爾數(shù)或雙鏈B的摩爾數(shù)相關(guān)。對(duì)于小鼠而言，定容體積(總?cè)芤后w積)為300μL時(shí)，雙鏈A的體積為75μL(濃度為10μmol/L)，則轉(zhuǎn)染試劑的用量為30μL。最終制得的轉(zhuǎn)染溶液中，雙鏈A的濃度為2.5μmol/L；雙鏈B的濃度為10μmol/L。所述轉(zhuǎn)染具體為將轉(zhuǎn)染溶液通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。轉(zhuǎn)染后，間隔24h檢測(cè)熒光信號(hào)。本發(fā)明提供了用于microRNA檢測(cè)探針組與microRNA的檢測(cè)方法，該探針組設(shè)計(jì)合理，利用鏈替換反應(yīng)使得熒光信號(hào)得到級(jí)聯(lián)放大，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)miRNA的檢測(cè)。該方法無(wú)需嚴(yán)格的操作條件，操作簡(jiǎn)單，特別是在miRNA分子低表達(dá)的細(xì)胞或者組織中具有非常好的優(yōu)勢(shì)。解決了在之前的檢測(cè)技術(shù)中存在檢測(cè)體系中信號(hào)分子輸出中伴隨著目標(biāo)鏈損失的巨大困難。實(shí)驗(yàn)表明，采用本發(fā)明提供的探針對(duì)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，能夠使熒光信號(hào)在1h左右達(dá)到最高，且最大程度避免了熒光信號(hào)泄露現(xiàn)象的產(chǎn)生。附圖說(shuō)明圖1示本發(fā)明提供探針組的檢測(cè)方法原理；圖2示實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖3示實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實(shí)施檢測(cè)的小鼠組織器官成像圖，其中，雙鏈A濃度為2.5μM，雙鏈B濃度為10μM；圖5示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實(shí)施檢測(cè)的小鼠組織器官成像圖；雙鏈A濃度為2.5μM，雙鏈B濃度為0μM；圖6示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實(shí)施檢測(cè)的小鼠組織器官成像圖；雙鏈A濃度為0μM，雙鏈B濃度為0μM；圖7示DNA分子探針在MCF-7腫瘤模型中的miRNA-21實(shí)施檢測(cè)綜合圖2、圖3和圖4中的小鼠腫瘤組織成像圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供了microRNA檢測(cè)探針組與microRNA的檢測(cè)方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。所述完全互補(bǔ)是指兩條鏈上的堿基數(shù)目相同，其中一條鏈由3’端至5’端與另一條鏈由5’端至3’端能夠全部互補(bǔ)。所述部分互補(bǔ)是指除去末端多出的堿基，其余部分完全互補(bǔ)。所述序列一致是指除將U替換為T(mén)外，RNA的序列與DNA的序列一致。鏈替換反應(yīng)即DNA鏈替換反應(yīng)(stranddisplacementreaction)是指兩條DNA鏈通過(guò)完全或者部分配對(duì)將先前已雜交的一條或者多條DNA鏈替換掉的過(guò)程。在鏈替換反應(yīng)過(guò)程中，復(fù)合物(complex)上的單鏈DNA部分與侵入鏈(invadingDNA)上的單鏈DNA區(qū)域，通過(guò)堿基配對(duì)先結(jié)合在一起，然后經(jīng)由分支遷移(branchmigration)向前無(wú)規(guī)行走從而將復(fù)合物上先前雜交的DNA鏈替換下來(lái)。本發(fā)明采用的試材皆為普通市售品，皆可于市場(chǎng)購(gòu)得。本實(shí)驗(yàn)中所使用到的MCF-7的細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。所有的初始原料，DNA都從生工(上海)生物工程股份有限公司或者Adamas公司購(gòu)買(mǎi)，試劑除非說(shuō)明都沒(méi)有再次提純。所有的化學(xué)試劑都是分析純或者更高純度的，使用的轉(zhuǎn)染試劑是Lipofectamine2000(ThermoFisher)，胎牛血清購(gòu)于ExCell公司。紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：Cary300。熒光分光光度計(jì)：F-7000(HitachiHigh-TechonologiesCorporationJapan)。熒光顯微鏡：IX71(OlymapusJapan)。激光共聚焦熒光顯微鏡：LeicaTCSSP5。下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：實(shí)施例11、熒光信號(hào)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分為6組，其中：實(shí)驗(yàn)組1～3采用4條探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而對(duì)照組1～3中僅含有3條探針(缺少保護(hù)燃料鏈)。實(shí)驗(yàn)探針設(shè)計(jì)如表1：各組探針中，信號(hào)鏈上的熒光基團(tuán)位于3’端是FAM；基底鏈上的猝滅基團(tuán)位于5’端是BHQ1。表1各組探針序列基底鏈信號(hào)鏈主導(dǎo)燃料鏈保護(hù)燃料鏈實(shí)驗(yàn)組1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3SEQIDNO:4對(duì)照組1SEQIDNO:1SEQIDNO:2SEQIDNO:3--實(shí)驗(yàn)組2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7SEQIDNO:8對(duì)照組2SEQIDNO:5SEQIDNO:6SEQIDNO:7--實(shí)驗(yàn)組3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11SEQIDNO:12對(duì)照組3SEQIDNO:9SEQIDNO:10SEQIDNO:11--2、DNA探針的準(zhǔn)備：1)、各探針?lè)謩e溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長(zhǎng)紫外吸收值進(jìn)行標(biāo)定；2)、基底鏈與信號(hào)鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈A，在4℃保存，濃度為100nM；3)、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈B，在4℃保存，濃度為400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配制主導(dǎo)燃料鏈的溶液，濃度是20μM待用。3、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)組：將4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液至總體積400微升?；旌弦弘s交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。對(duì)照組：將4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM單鏈的主導(dǎo)燃料鏈，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。37℃，反應(yīng)過(guò)程中，每隔一段時(shí)間用熒光分光光度儀掃描溶液熒光信號(hào)。選取FAM的吸收峰在518nm處的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制各組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線(xiàn)。結(jié)果如圖2，說(shuō)明4條探針的組合更有利于降低熒光泄露情況的產(chǎn)生。實(shí)施例21、體外模擬miRNA-21的檢測(cè)。配置miRNA-21(與miRNA-21序列相同的DNA單鏈)的標(biāo)準(zhǔn)液作為待測(cè)樣品，濃度為10μmol/L。實(shí)驗(yàn)分為6組，其中：實(shí)驗(yàn)組1～3采用4條探針進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，而對(duì)照組1～3中僅含有3條探針(缺少保護(hù)燃料鏈)。實(shí)驗(yàn)探針設(shè)計(jì)如實(shí)施例1中表1：各組探針中，信號(hào)鏈上的熒光基團(tuán)位于3’端是FAM；基底鏈上的猝滅基團(tuán)位于5’端是BHQ1。2、DNA探針的準(zhǔn)備：1)、各探針?lè)謩e溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長(zhǎng)紫外吸收值進(jìn)行標(biāo)定；2)、基底鏈與信號(hào)鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈A，在4℃保存，濃度為100nM；3)、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈B，在4℃保存，濃度為400nM。4)、以10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)配制主導(dǎo)燃料鏈的溶液，濃度是20μM待用。3、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)試實(shí)驗(yàn)組：將4微升miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)液、4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。對(duì)照組：將將4微升miRNA-21標(biāo)準(zhǔn)液、4微升濃度為10μM的雙鏈A，8微升濃度為20μM單鏈的主導(dǎo)燃料鏈，溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液至總體積400微升。混合液雜交鏈濃度為100nM，燃料鏈濃度為400nM。反應(yīng)過(guò)程中，每隔一段時(shí)間用熒光分光光度儀掃描溶液熒光信號(hào)。選取FAM的吸收峰在518nm處的發(fā)射波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度值為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制各組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化曲線(xiàn)。結(jié)果如圖3，結(jié)果表明，SEQIDNO:1～4的探針組合能夠在更短的時(shí)間內(nèi)獲得更高的熒光值。實(shí)施例31、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時(shí)間可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)模型小鼠體內(nèi)miRNA-21進(jìn)行檢測(cè)，基底鏈序列(從左到右為5'—3')為：BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)；信號(hào)鏈的序列(從左到右為5'—3')為：ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)；主導(dǎo)燃料鏈的序列(從左到右為5'—3')為：TTATCAGACTGATGTTGATTGTG(SEQIDNO：3)；保護(hù)燃料鏈的序列(從左到右為5'—3')為：ATCAACATCAGTCT(SEQIDNO：4)。2、DNA探針的準(zhǔn)備：1)、各探針?lè)謩e溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長(zhǎng)紫外吸收值進(jìn)行標(biāo)定；2)、基底鏈與信號(hào)鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈A，在4℃保存；3)、主導(dǎo)燃料鏈和保護(hù)燃料鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈B，在4℃保存；所得雙鏈A濃度為10μM，雙鏈燃料鏈(雙鏈B)DNA濃度為20μM。3、利用商業(yè)轉(zhuǎn)染劑將DNA探針通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)：1)、轉(zhuǎn)染混合液的準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)組：將75微升濃度為10μM的雙鏈A，150微升濃度為20μM雙鏈燃料鏈(雙鏈B)和30微升商業(yè)轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，最后補(bǔ)加Tris-HCl緩沖液至總體積300微升，復(fù)合20分鐘，待用?；旌弦弘s交鏈濃度為2.5μM，燃料鏈濃度為10μM。對(duì)照組：將75微升雙鏈A，和30微升商業(yè)轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，最后補(bǔ)加Tris-HCl緩沖液至總體積300微升，復(fù)合20分鐘，待用?；旌弦弘s交鏈濃度為2.5μM，燃料鏈濃度為10μM。2)、將復(fù)合好的DNA探針通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3)、將小鼠正常飼養(yǎng)24小時(shí)。4、腫瘤組織成像：將安樂(lè)死小鼠，解剖小鼠對(duì)小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區(qū)域，拍攝腫瘤組織圖像。結(jié)果如圖4。對(duì)比例11、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時(shí)間可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)模型小鼠體內(nèi)miRNA-21進(jìn)行檢測(cè)，基底鏈序列(從左到右為5'—3')為BHQ-2-CACAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDNO：1)，信號(hào)鏈的序列(從左到右為5'—3')為ATCAGACTGATGTTGATTGTG-Cy5(SEQIDNO：2)，2、DNA探針的準(zhǔn)備：1)、各探針?lè)謩e溶解在10mMTris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，溶液中單鏈的濃度利用260nm波長(zhǎng)紫外吸收值進(jìn)行標(biāo)定；2)、基底鏈與信號(hào)鏈等摩爾濃度混合，在90℃下保持15分鐘，然后再逐漸降溫至室溫，保持室溫進(jìn)行退火，退火過(guò)程超過(guò)2小時(shí)。獲得雙鏈A，在4℃保存；所得雙鏈A濃度為10μM。3、利用商業(yè)轉(zhuǎn)染劑將DNA探針通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)：1)、轉(zhuǎn)染混合液的準(zhǔn)備：將75微升雙鏈A，和30微升商業(yè)轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，最后補(bǔ)加Tris-HCl緩沖液至總體積300微升，復(fù)合20分鐘，待用。混合液雜交鏈濃度為2.5μM。2)、將復(fù)合好的DNA探針通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3)、將小鼠正常飼養(yǎng)24小時(shí)。4、腫瘤組織成像：將安樂(lè)死小鼠，解剖小鼠對(duì)小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區(qū)域，拍攝腫瘤組織圖像。結(jié)果如圖5。對(duì)比例21、腫瘤模型的建立：將MCF-7(5×106cells/50μL)移植到小鼠左邊腋下(小鼠為母鼠，約4周大小，重約20克)。大約移植2到3周時(shí)間可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)模型小鼠體內(nèi)miRNA-21進(jìn)行檢測(cè)，2、利用商業(yè)轉(zhuǎn)染劑通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)：1)、轉(zhuǎn)染混合液的準(zhǔn)備：將30微升商業(yè)轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine2000(ThermoFisher)溶解在Tris-HCl(pH7.5,0.3MNaCl,5mMMgCl2)緩沖液中，最后補(bǔ)加Tris-HCl緩沖液至總體積300微升，復(fù)合20分鐘，待用。2)、將轉(zhuǎn)染混合液通過(guò)小鼠尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)。3)、將小鼠正常飼養(yǎng)24小時(shí)。3、腫瘤組織成像：將安樂(lè)死小鼠，解剖小鼠對(duì)小鼠器官以及腫瘤組織成像觀察，選擇被掃描區(qū)域，拍攝腫瘤組織圖像。結(jié)果如圖6。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)<120>microRNA檢測(cè)探針組與microRNA的檢測(cè)方法<130>MP1620839<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1cacaatcaacatcagtctgataagcta27<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2atcagactgatgttgattgtg21<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>3ttatcagactgatgttgattgtg23<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>4atcaacatcagtct14<210>5<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>5cacaatcaacatcagtctgataagcta27<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6atcagactgatgttgattgtg21<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7tatcagactgatgttgattgtg22<210>8<211>14<212>DNA<213>人工序列<400>8atcaacatcagtct14<210>9<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>9ccaatcaacatcagtctgataagcta26<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>10tatcagactgatgttgattgg21<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11cttatcagactgatgttgattgg23<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>12tcaacatcagtctga15當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3