本發(fā)明屬于低聚木糖制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種以粘膠纖維壓榨液為原料生產(chǎn)低聚木糖的方法。
背景技術(shù)：
：低聚木糖系由2-7個(gè)木糖分子以α–1,4糖苷鍵結(jié)合而成，其中以木二糖、木三糖為主要有效成分，其理化性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸、耐熱，并有很強(qiáng)增殖腸道益生菌、改善腸道微生態(tài)環(huán)境等功能。固體型低聚木糖呈乳白色至淡黃色粉末，主要是從富含木聚糖植物(如棉籽殼、麩皮、玉米芯等)，通過(guò)木聚糖水解酶酶解而得一種非消化低聚木糖。低聚木糖的生產(chǎn)技術(shù)包括從原料中提取木聚糖和木聚糖酶法水解，和最后低聚木糖產(chǎn)品的純化等三個(gè)方面。制備低聚木糖的原料主要是木聚糖，木聚糖在玉米芯、甘蔗渣、棉子殼和燕麥、樺木等農(nóng)林產(chǎn)品中含量相對(duì)較高，平均可達(dá)30％左右。但在低聚木糖生產(chǎn)過(guò)程中，原料細(xì)胞壁中的某些成分會(huì)防礙木聚糖與木聚糖酶之間的作用，從而降低形成速率和產(chǎn)率，因此在水解之前，必須對(duì)原料進(jìn)行有效地處理來(lái)提取出木聚糖。目前木聚糖的制備方法通常有以下幾種：1)直接高溫蒸煮提取木聚糖；2)堿法提取木聚糖；3)酸法提取木聚糖；4)微波法提取木聚糖。然而酸法提取木聚糖時(shí)木糖含量太高，不利于低聚木糖的生產(chǎn)；堿法提取木聚糖時(shí)得到的木聚糖漿粘度太高，不便與操作，且產(chǎn)物中還原糖含量高，不利于生產(chǎn)。目前，產(chǎn)木聚糖酶的微生物有細(xì)菌、鏈霉菌、曲霉菌、青霉、木霉和毛殼霉等。但是自然界微生物產(chǎn)生的木聚糖降解酶系均存在木糖苷酶活性，往往影響低聚木糖的產(chǎn)率，同時(shí)還伴隨產(chǎn)生大量淀粉酶、纖維素酶，這些酶性質(zhì)相近，增加了分離純化木聚糖降解酶系的困難。由于在前期處理過(guò)程中勢(shì)必會(huì)產(chǎn)生各種色素、鹽類、酸性低聚糖等雜質(zhì)，因此，在生產(chǎn)低聚木糖過(guò)程中，分離、純化步驟顯得尤為重要。根據(jù)低聚木糖單一組分理化特性，采用層析分離技術(shù)。適于低聚木糖單一組分制備分離層析技術(shù)主要有凝膠過(guò)濾層析和活性炭層析兩種。凝膠過(guò)濾介質(zhì)較昂貴，但可反復(fù)使用，一般可用水作為洗脫劑等度洗脫。活性炭層析所使用介質(zhì)相對(duì)便宜，樣品容量大，但不能采用等度洗脫方式，不能用示差檢測(cè)，且周期較長(zhǎng)。膜分離技術(shù)是一種新興分離、濃縮和提純技術(shù)，具有常溫、無(wú)相變、高效、節(jié)能、無(wú)污染等特點(diǎn)。該技術(shù)利用分離膜選擇性透過(guò)特性，透過(guò)流體內(nèi)一種或幾種物質(zhì)，而截留其它透不過(guò)物質(zhì)，從而達(dá)到濃縮和分離、純化目的。將膜技術(shù)和生化反應(yīng)結(jié)合耦合技術(shù)一直是膜技術(shù)應(yīng)用一個(gè)熱點(diǎn)。該技術(shù)利用膜特性分離產(chǎn)物，截留底物和酶，從而實(shí)現(xiàn)酶重復(fù)利用和提高酶解效率。鑒于在低聚木糖的生產(chǎn)過(guò)程中存在著上述一系列的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)一種低聚木糖產(chǎn)率高，尤其是木二糖，木三糖和木四糖產(chǎn)率高、純度高的生產(chǎn)方法，降低生產(chǎn)成本，是目前工業(yè)化生產(chǎn)低聚木糖急需解決的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，提供了一種以粘膠纖維壓榨液為原料生產(chǎn)低聚木糖,尤其是木二糖，木三糖和木四糖的方法，能有效提高木二糖，木三糖和木四糖的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的低聚木糖的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過(guò)膜脫堿濃縮，得到半纖維素溶液；2)將步驟1)制備的半纖維素溶液在160-170℃條件下保溫30-50min；3)將步驟2)保溫處理后的半纖維素溶液降溫至50-60℃，并調(diào)節(jié)pH值為4.8-5.5，按0.01-0.05％(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑，酶解3-5h；4)酶解反應(yīng)結(jié)束后，將酶解液升溫滅活復(fù)合酶制劑；5)將酶解后的溶液進(jìn)行固液分離，得到低聚木糖溶液。所述復(fù)合酶制劑包含木聚糖酶，纖維素酶和甘露聚糖酶。所述復(fù)合酶制劑中各組分的含量分別為木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g。本發(fā)明再一個(gè)方面提供采用上述方法制備得到的低聚木糖，能用于飼料制備
技術(shù)領(lǐng)域：
中。本發(fā)明的方法能顯著促進(jìn)木聚糖的有效降解，使木聚糖向木二糖、木三糖和木四糖轉(zhuǎn)化的總效率達(dá)到36-44％；而且還能有效提高木三糖的轉(zhuǎn)化率，達(dá)到19％-22％。本發(fā)明在160-170℃范圍內(nèi)高溫預(yù)處理能有效實(shí)現(xiàn)低聚木糖的生產(chǎn)，減少單糖的轉(zhuǎn)化率，取得了意料不到的技術(shù)效果。采用本發(fā)明所述方法制備得到的低聚木糖可廣泛應(yīng)用于飼料中，能有效促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)，提高免疫力，降低料肉比，市場(chǎng)前景廣闊。具體實(shí)施方案在粘膠纖維生產(chǎn)過(guò)程中，主要通過(guò)堿法溶解原料紙漿，具體就是利用氫氧化鈉溶液將紙漿中的半纖維素溶解出來(lái)。堿溶解后，將原料進(jìn)行壓榨，獲得的溶液即為本發(fā)明實(shí)施例中所述的粘膠纖維壓榨液，其主要成分為半纖維素和氫氧化鈉。本發(fā)明實(shí)施例中采用離子色譜法測(cè)定葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖含量，測(cè)定方法具體為：1原理樣品隨著流動(dòng)相進(jìn)入固定相(色譜柱)，溶于流動(dòng)相中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相發(fā)生作用(吸附、分配、離子吸引、排阻、親和)的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出，不同保留時(shí)間留出來(lái)的組分，進(jìn)入電化學(xué)檢測(cè)器，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)弱不等的信號(hào)，由信號(hào)形成色譜圖，在一定范圍之內(nèi)，信號(hào)值和濃度成線性關(guān)系。電化學(xué)檢測(cè)工作原理：糖類屬于弱酸，在強(qiáng)堿溶液中會(huì)部分或者全部以陰離子形成存在，利用在陰離子色譜柱上不同的保留性進(jìn)行分離，在強(qiáng)堿性條件下，糖結(jié)構(gòu)中的羥基等電化學(xué)活性基團(tuán)在適當(dāng)?shù)碾娢幌驴梢栽诮痣姌O表面被氧化而導(dǎo)致電流的變化，電流的大小產(chǎn)生不同的色譜峰。2測(cè)定步驟2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線取葡萄糖、木糖和木二糖、木三糖、木四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液先稀釋10倍，再按下表稀釋，為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)溶液：混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(ml)去離子水(ml)總體積(ml)0.10.910.30.710.50.510.70.311.0012.2實(shí)驗(yàn)條件離子色譜儀：IC-5000檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器流速：0.7ml/min柱溫：30℃色譜柱：ThermoFisherPA10保護(hù)柱：ThermoFisherGA10pH電極：Agcl電位：standardquad進(jìn)樣量：25ul流動(dòng)相：0.25mol/L氫氧化鈉：水＝40:60運(yùn)行時(shí)間：45min出峰順序：葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與計(jì)算3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以葡萄糖、木糖、木二糖、木三糖、木四糖系列濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，列出直線回歸方程：Y＝ac+b；其中Y為上述某種糖的峰面積，a、b為標(biāo)準(zhǔn)方程系數(shù)，c為對(duì)應(yīng)糖的濃度。3.2樣品含量計(jì)算公式：P＝C*n；其中P為樣品中上述某種糖的含量，C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出來(lái)的對(duì)應(yīng)糖的濃度，n為稀釋倍數(shù)。實(shí)施例1本實(shí)施例的方法，包括如下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過(guò)膜脫堿濃縮，得到低堿高濃度的半纖維素溶液；取20毫升的半纖維素溶液，與20毫升濃度為12％的稀硫酸混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH至中性，用離子液相色譜測(cè)定里面木聚糖的總含量，結(jié)果表明獲得的半纖維素溶液中木聚糖含量為90g/L；2)將步驟1)獲得的半纖維素溶液在160℃條件下保溫50min；3)降溫至50℃，并調(diào)節(jié)半纖維素溶液的pH為4.8，按0.01(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑(木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g)，酶解5h；4)酶解反應(yīng)結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復(fù)合酶制劑；5)將酶解后的溶液通過(guò)板框進(jìn)行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。利用離子液相色譜測(cè)定上述獲得的低聚木糖溶液中的木二糖、木三糖和木四糖的含量分別為10.9g/l，11.2g/l，9.8g/l，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率為35％，木三糖的轉(zhuǎn)化率為12％。總轉(zhuǎn)化率＝(木二糖+木三糖+木四糖)/總木糖含量×100％。實(shí)施例2本實(shí)施例的方法，包括如下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過(guò)膜脫堿濃縮，得到低堿高濃度的半纖維素溶液；取20毫升的半纖維素溶液，與20毫升濃度為12％的稀硫酸混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH至中性，用離子液相色譜測(cè)定里面木聚糖的總含量，木聚糖含量為90g/L；2)將步驟1)獲得的半纖維素溶液在165℃條件下保溫40min；3)降溫至55℃，并調(diào)節(jié)半纖維素溶液的pH為5.0，按0.02(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑(木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g)，酶解4h；4)酶解反應(yīng)結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復(fù)合酶制劑；5)將酶解后的溶液通過(guò)板框進(jìn)行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。利用離子液相色譜測(cè)定上述獲得的低聚木糖溶液中木二糖、木三糖和木四糖的含量分別為10.2g/l，14.3g/l，9.5g/l，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率為37％，木三糖的轉(zhuǎn)化率為15％?？傓D(zhuǎn)化率＝(木二糖+木三糖+木四糖)/總木糖含量×100％。實(shí)施例3一種生產(chǎn)低聚木糖的方法，包括如下步驟：1)將粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)過(guò)膜脫堿濃縮，得到低堿高濃度的半纖維素溶液；取20毫升的半纖維素溶液，與20毫升濃度為12％的稀硫酸混合，100℃高溫處理90min，用碳酸鈣調(diào)節(jié)pH至中性，用離子液相色譜測(cè)定里面木聚糖的總含量，木聚糖含量為90g/L；2)將步驟1)獲得的半纖維素溶液在170℃條件下保溫30min；3)降溫至60℃，并調(diào)節(jié)半纖維素溶液的pH為5.5，按0.05(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑(木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g)，酶解3h；4)酶解反應(yīng)結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復(fù)合酶制劑；5)將酶解后的溶液通過(guò)板框進(jìn)行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。利用離子液相色譜測(cè)定上述獲得的低聚木糖溶液中木二糖、木三糖和木四糖的含量分別為10.8g/l，20g/l，9.6g/l，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率為44％，木三糖的轉(zhuǎn)化率為22％。實(shí)施例4高溫預(yù)處理對(duì)低聚木糖轉(zhuǎn)化率以及木三糖轉(zhuǎn)化率的影響1、處理組：先高溫預(yù)處理，再進(jìn)行酶解。取實(shí)施例3步驟1)制得的木聚糖含量為90g/L的半纖維素溶液，分別升溫至150℃，155℃，160℃,165℃,170℃,175℃,180℃,185℃,190℃,保溫30min，然后均冷降溫至60℃，并調(diào)節(jié)半纖維素溶液的pH為5.5，按0.05(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑(木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g)，酶解3h；酶解反應(yīng)結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復(fù)合酶制劑；將酶解后的溶液通過(guò)板框進(jìn)行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。2、對(duì)照組1：不經(jīng)過(guò)高溫預(yù)處理，直接酶解。取實(shí)施例3步驟1)制得的木聚糖含量為90g/L的半纖維素溶液，升溫至60℃，并調(diào)節(jié)半纖維素溶液的pH為5.5，按0.05(w/v)的比例加入復(fù)合酶制劑(木聚糖酶100000IU/g，纖維素酶10000IU/g和甘露聚糖酶5000IU/g)，酶解3h；酶解反應(yīng)結(jié)束后，升溫至80℃，保溫15min，滅活復(fù)合酶制劑；將酶解后的溶液通過(guò)板框進(jìn)行固液分離，得到的澄清溶液，即為低聚木糖溶液。3、對(duì)照組2：不經(jīng)過(guò)高溫預(yù)處理，直接初次酶解，然后高溫預(yù)熱，再二次酶解。A、膜濃縮粘膠纖維生產(chǎn)的壓榨液經(jīng)膜過(guò)濾，取濃縮液加酸中和，得到木聚糖溶液；B、酶解木聚糖溶液與0.02-0.05％復(fù)合酶(木聚糖酶：纖維素酶：果膠酶＝3:2:1)發(fā)生酶解反應(yīng)，操作壓力10-20kPa，進(jìn)料速度20-30m3/h，酶解溫度40-45℃，pH值4-5，酶解時(shí)間2-5h得到酶解液和酶解渣，所述酶解渣經(jīng)加水稀釋，170-200℃下預(yù)熱20-40min后離心分離，取上清液即木聚糖溶液，在上述復(fù)合酶的作用下得到二次酶解液；C、提純將B步驟得到的酶解液合并，進(jìn)入納濾膜脫鹽，所得濃縮液即為低聚木糖的純化液。3、結(jié)果分析利用離子液相色譜分別測(cè)定上述處理組和對(duì)照組制得的低聚木糖溶液中木二糖、木三糖和木四糖的含量，計(jì)算木二糖、木三糖和木四糖的總轉(zhuǎn)化率以及木三糖的轉(zhuǎn)化率。具體結(jié)果見(jiàn)表1。表1不同溫度預(yù)處理對(duì)低聚木糖轉(zhuǎn)化率和木三糖轉(zhuǎn)化率的影響從表1中的數(shù)據(jù)可以看出，與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)150-190℃高溫預(yù)處理的各處理組木二、木三和木四糖的總轉(zhuǎn)化率均得到顯著提高，說(shuō)明高溫預(yù)處理對(duì)于木聚糖的降解具有明顯的促進(jìn)作用。尤其是，當(dāng)預(yù)處理溫度達(dá)到160℃時(shí)，木二、木三和木四糖總轉(zhuǎn)化率迅速提高至36％，且在160-170℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，木二、木三和木四糖總轉(zhuǎn)化率也逐漸提高，但當(dāng)溫度超過(guò)170℃時(shí)，木二、木三和木四糖總轉(zhuǎn)化率卻明顯下降。更意想不到的是，當(dāng)預(yù)處理溫度達(dá)到160℃時(shí)，木三糖的轉(zhuǎn)化率也迅速提高，至19％，在160-170℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，木三糖的轉(zhuǎn)化率也逐漸提高，但當(dāng)溫度超過(guò)170℃時(shí)，木三糖的轉(zhuǎn)化率也明顯下降，取得了意料不到的效果。而本發(fā)明的對(duì)照組2采用直接初次酶解，再170-200℃高溫處理酶解渣，然后二次酶解的方式，獲得的低聚木糖溶液中木糖的含量最高，木糖轉(zhuǎn)化率高于76％，但木二糖，木三糖和木四糖的含量較低，轉(zhuǎn)化率低于15％，其中木三糖的轉(zhuǎn)化率更低，不足5％。從而說(shuō)明，對(duì)照組2采用的二次酶解以及高溫處理初次酶解渣的方法，能提高木聚糖的酶解效率，提高木糖的轉(zhuǎn)化率，但不利于低聚木糖的形成，木二糖，木三糖和木四糖的轉(zhuǎn)化率均低于處理組。實(shí)施例5低聚木糖在肉雞飼料中的應(yīng)用本實(shí)施例選擇1日齡健康Ross308雞共160只，分2組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只，公母各半，以重復(fù)為單位采用4層籠養(yǎng)，持續(xù)光照。正式試驗(yàn)期間舍內(nèi)溫度控制在22～24℃。試驗(yàn)日糧以干粉料形式飼喂，前期隨時(shí)補(bǔ)料，后期日喂料3次，自由采食和飲水，按籠記錄每日采食量。每天定時(shí)打掃雞舍衛(wèi)生，定期免疫。注意適時(shí)通風(fēng)，適時(shí)觀察雞群，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病雞予以治療和記錄，嚴(yán)重不愈者淘汰，記錄淘汰雞的雞號(hào)和體重，并扣除耗料量。試驗(yàn)期42天。試驗(yàn)處理如下：對(duì)照組：基礎(chǔ)日糧組(對(duì)照組)實(shí)驗(yàn)組：基礎(chǔ)日糧+200g低聚木糖/噸基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：(1)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組7日齡肉雞1-7日增重提高了4.2％，料肉比降低了1.2％；(2)實(shí)驗(yàn)組14日齡肉雞8-14日增重提高了4.0％，料肉比降低了0.9％；(3)實(shí)驗(yàn)組21日齡肉雞1-21日增重提高4.6％，料肉比降低了1.1％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)在日糧中添加本發(fā)明制備得到的低聚木糖，能顯著提高1～21日齡期肉雞的日增重，降低料重比，說(shuō)明本發(fā)明提供的低聚木糖能有效提高養(yǎng)殖動(dòng)物對(duì)飼料的消化利用率，提高生產(chǎn)性能，有利于減少飼料的使用量，節(jié)約糧食資源和養(yǎng)殖成本，增加生產(chǎn)效益。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3