本發(fā)明涉及一種生產5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌，屬于代謝工程和微生物發(fā)酵領域。

背景技術：

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,ALA)，分子式為C₅O₃NH₉，分子量為131.13，熔點為149-151℃，它是生物體合成葉綠素、血紅素、維生素B₁₂等的關鍵前體物質。ALA作為一種安全、選擇、滲透性好的光動力學藥物在醫(yī)學領域逐漸受到重視，已經成功應用于皮膚癌、膀胱癌、消化道癌、肺癌等的診斷和光動力治療中。另外，ALA作為一種環(huán)境相容性及選擇性很高的新型光活化農藥，在農藥領域應用非常廣泛，如作為一種無公害的綠色農藥、除草劑以及植物生長調節(jié)劑等。

目前，ALA合成主要采用化學法合成，最早出現在上世紀50年代，直到20世紀90年代，相關研究才大量開展，并取得了一定的成績。但是由于化學合成反應步驟繁瑣，副產物多，分離提純困難，ALA的得率也較低，并且環(huán)境污染嚴重等問題，近年來，微生物發(fā)酵生產ALA已成為研究的熱點。自然界中，ALA的生物合成存在兩條途徑，一條是C4途徑，由5-氨基乙酰丙酸合成酶(ALAS，hemA編碼)催化琥珀酰-CoA和甘氨酸生成ALA的一步酶促反應組成，主要存在于一些光合細菌、真菌以及動物體內。另外一條是C5途徑，首先谷氨酸在谷氨酰-tRNA合成酶(GluRS，gltX編碼)催化下，生成谷氨酰-tRNA，然后，谷氨酰-tRNA在谷氨酰-tRNA還原酶(GluTR，hemA編碼)作用下生成谷氨酸-1-半醛(GSA)，最后GSA由谷氨酸-1-半醛-2,1-氨基轉移酶(GSA-AM，hemL編碼)催化生成ALA。該途徑廣泛存在于植物、藻類以及細菌(如大腸桿菌)中。

早期，人們篩選到產ALA的光合細菌類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)，通過誘變育種法對其進行誘變，篩選ALA的高產菌株，并通過發(fā)酵優(yōu)化等使得ALA的產量達到7.2g/L。但由于光合細菌的特殊性，其成本較高，不適合大規(guī)模的工業(yè)化生產。

技術實現要素：

本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌株，是以大腸桿菌為宿主，在表達C4途徑關鍵基因hemA(編碼5-氨基乙酰丙酸合酶)的基礎上，共表達大腸桿菌輔酶A途徑的相關基因即編碼泛酸激酶的的基因coaA、編碼磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脫羧酶的基因dfp、和編碼磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因hemA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因coaA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因dfp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因coaD的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因hemA以pRSFDuet-1為表達載體進行共表達。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述基因coaA、dfp、coaD共用一個表達載體，所述表達載體包括pUC19和pETDuet-1。

本發(fā)明要解決的第二個問題是提供所述大腸桿菌工程菌株的構建方法，所述方法是以大腸桿菌為宿主，以pRSFDuet-1為表達載體表達hemA基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法還以pUC19或pETDuet-1載體，并表達coaA、dfp、coaD基因。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法是將coaA、dfp和coaD基因通過同源重組方法連接載體pUC19和pETDuet-1載體。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體包括以下步驟：

(1)將來源于莢膜紅細菌的基因hemA通過擴增利用同源重組方法連接到同樣通過擴增得到的載體pRSFDuet-1中，獲得重組表達載體pRSFDuet-1-hemA；(2)將來源于大腸桿菌的coaA、dfp、coaD基因通過同源重組方法連接到載體pUC19和pETDuet-1載體中，分別得到表達載體pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD；(3)將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA轉化E.coli BL21(DE3)；或將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA與pUC19-coaA-dfp-coaD共轉化至E.coli BL21(DE3)；或將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA與pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共轉化E.coli BL21(DE3)。

本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供一種發(fā)酵生產5-氨基乙酰丙酸的方法，所述方法是將所述大腸桿菌工程菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃，200～220r/min培養(yǎng)24-32h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有：(NH₄)₂SO₄15g/L，KH₂PO₄5.0g/L，Na₂HPO₄·12H₂O 15g/L，MgSO₄·7H₂O 1.0g/L，酵母提取物1.0g/L，葡萄糖20g/L。

本發(fā)明還提供所述大腸桿菌工程菌在制備含5-氨基乙酰丙酸的產品中的應用。

有益效果：本發(fā)明在表達C4途徑關鍵基因hemA的基礎上，共表達大腸桿菌輔酶A途徑的相關基因即編碼泛酸激酶的的基因coaA、編碼磷酸泛酰半胱氨酸合成酶和脫羧酶的基因dfp、編碼磷酸CoA焦磷酸化酶的基因coaD，取得了意料不到的技術效果：共表達coA途徑關鍵基因的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD在250m L搖瓶培養(yǎng)中能夠積累5-氨基乙酰丙酸700mg/L，相比于對照菌株提高了46％，有效地利用C4途徑促進5-氨基乙酰丙酸的合成，實現了微生物發(fā)酵法直接發(fā)酵葡萄糖合成5-氨基乙酰丙酸，縮短發(fā)酵周期、降低生產成本。

附圖說明

圖1為大腸桿菌中ALA C4合成途徑；

圖2為大腸桿菌中輔酶A合成途徑；

圖3為重組質粒pRSFDuet-1-hemA構建菌落PCR電泳圖；M：DL 5000Marker；

圖4為重組質粒pUC19-coaA-dfp-coaD和pETDuet-1-coaA-dfp-coaD構建菌落PCR電泳圖；M：DL 5000Marker；1-12：pUC19-coaA-dfp-coaD質粒構建菌落PCR結果；13-24：pETDuet-1-coaA-dfp-coaD質粒構建菌落PCR結果；M：DL 5000Marker；

圖5為重組菌搖瓶發(fā)酵ALA產量；從左至右分別為E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD，E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。

具體實施方式

ALA分析方法：采用Mauzerall和Granick的分光光度法：將樣品稀釋至2mL，加入1mL的乙酸鹽緩沖液，0.5mL的乙酰丙酮，然后煮沸15min。冷卻至室溫，取2mL的反應液至新管中，然后加入2mL的改良Ehrlich’s試劑，反應20min，利用分光光度計554nm下檢測。

培養(yǎng)基：

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，瓊脂20，pH 7.0；

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，氯化鈉10，酵母粉5.0，pH 7.0，裝液量20mL/250mL；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：(NH₄)₂SO₄15，KH₂PO₄5.0，Na₂HPO₄·12H₂O 15，MgSO₄·7H₂O 1.0，酵母提取物1.0，葡萄糖20，pH 7.0，裝液量30mL/250mL。

培養(yǎng)條件：

菌種培養(yǎng)：甘油管劃線，然后挑取單菌落劃線平板37℃培養(yǎng)，作為種子來源；

種子培養(yǎng)：平板挑取菌體，37℃，220r/min，根據要求添加卡那霉素100μg/mL和氨芐霉素100μg/mL，培養(yǎng)約12h，轉接發(fā)酵培養(yǎng)基；

發(fā)酵培養(yǎng)：以2％(按體積比)接種量轉接，0h時添加0.1-0.5mM IPTG誘導基因表達，根據轉入質粒的抗性添加卡那霉素(100μg/mL)或氨芐霉素(100μg/mL)，37℃，220r/min培養(yǎng)，周期24-32h。

實施例1重組質粒的構建及鑒定

(1)重組質粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD的構建。

引物如下：

RSF-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTCGCGCTCGAC

RSF-R:CTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG

hemA-F:TGTTTAACTTTAATAAGGAGGAAAATATATGGACTACAATCTGGCACTCG

hemA-R:CGAGCTCGGCCACGAAGTGCTCAGGCAGAGGCCTCGGCGCGA

pUC19-F:TGATGGCGAAGTTAGCGTAGGTCATAGCTGTTTCCT

pUC19-R:CTCTTTTATACTCATTACGAGCCGGAAGCATAAAG

pET-F:GATGGCGAAGTTAGCGTAGGGCGCGCCTGCAGGTCGACAAGCTTG

pET-R:GTTTGCTCTTTTATACTCATGAATTCGGATCCTGGCTGTGGTG

coaA-19F:TGCTTCCGGCTCGTAATGAGTATAAAAGAGCAAACGTTAAT

coaA-ETF:CACAGCCAGGATCCGAATTCATGAGTATAAAAGAGCAAAC

coaA-R:ACCGGCCAGGCTCATTTATTTGCGTAGTCTGACCTCTTCT

dfp-F:AGACTACGCAAATAAATGAGCCTGGCCGGTAAAAAAATCG

dfp-R:CGCCCGTTTTTGCATTTAACGTCGATTTTTTTCATCATAA

coaD-F:AAAAATCGACGTTAAATGCAAAAACGGGCGATTTATCCGG

coaD-19R:CAGCTATGACCTACGCTAACTTCGCCATCAGCGCC

coaD-ETR:CACCACAGCCAGGATCCGATAACTTCGCCATCAGCGCC

以pRSFDuet-1質粒為模板，以引物RSF-F和RSF-R進行擴增，獲得pRSFDuet-1線性載體；以莢膜紅細菌ATCC 11166基因組為模板，以引物hemA-F和hemA-R擴增hemA基因，獲得hemA基因片段，將pRSFDuet-1線性載體與hemA基因片段通過同源重組反應進行連接，獲得重組質粒pRSFDuet-1-hemA。

以pUC19質粒為模板，以引物pUC19-F和pUC19-R進行擴增，獲得pUC19線性載體；以大腸桿菌基因組為模板，以引物coaA-19F和coaA-R擴增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R擴增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-19R擴增coaD基因，分別獲得coaA-19、dfp、coaD-19基因片段，將pUC19線性載體、coaA-19、dfp、coaD-19片段通過同源重組反應進行連接，獲得重組質粒pUC19-coaA-dfp-coaD。

以pETDuet-1質粒為模板，以引物pET-F和pET-R進行擴增，獲得pETDuet-1線性載體；以大腸桿菌基因組為模板，以引物coaA-ETF和coaA-R擴增coaA基因，以引物dfp-F和dfp-R擴增dfp基因，以引物coaD-F和coaD-ETR擴增coaD基因，分別獲得coaA-ET、dfp、coaD-ET基因片段，將pETDuet-1線性載體、coaA-ET、dfp、coaD-ET片段通過同源重組反應進行連接，獲得重組質粒pETDuet-1-coaA-dfp-coaD。

反應條件為：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min/kb(32個循環(huán))；72℃10min進行PCR反應，并以1％瓊脂糖凝膠電泳驗證并回收PCR擴增產物，將片段(0.04ng/bp)和載體(0.02ng/bp)混于同一PCR管中，加入4μl重組酶緩沖液和2μl重組酶，加ddH₂O補齊至20μl，在37度反應30min。將反應產物化轉至E.coli JM109，挑選陽性克隆子提取質粒并送上海生工測序驗證，菌落PCR結果電泳圖如圖3和圖4(箭頭所示為目的條帶)。

(2)ALA發(fā)酵重組菌株的構建

基本方法是將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA轉化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A1。將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA，pUC19-coaA-dfp-coaD共轉化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A2。將構建的重組質粒pRSFDuet-1-hemA，pETDuet-1-coaA-dfp-coaD共轉化E.coli BL21(DE3)，獲得重組菌A3。

實施例2重組菌搖瓶發(fā)酵驗證

菌株：

A1:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA

A2:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pUC19-coaA-dfp-coaD

A3:E.coli BL21(DE3)pRSFDuet-1-hemA pETDuet-1-coaA-dfp-coaD

將重組菌A2和A3分別進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵，以未共表達CoA相關基因的菌株A1為對照，37℃，220r/min發(fā)酵24-32h，測定ALA產量。結果顯示(圖5)，通過高拷貝質粒和中拷貝質粒組合表達coaA、dfp、coaD，與對照菌株A1相比，ALA產量均有提高。使用pUC19表達CoA相關基因的重組菌A2的ALA產量為654mg/L,比對照菌株A1提高了約37％；使用質粒pETDuet-1表達CoA相關基因的重組菌A3的ALA產量為700mg/L,比對照菌株A1提高了約46％。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學

<120> 一種生產5-氨基乙酰丙酸的大腸桿菌工程菌

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1230

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggactaca atctcgcgct cgacaaagcg atccagaaac tccacgacga gggacgttac 60

cgcacgttca tcgacatcga acgcgagaag ggcgccttcc ccaaggcgca gtggaaccgc 120

cccgatggcg gcaagcagga catcaccgtc tggtgcggca acgactatct gggcatgggc 180

cagcacccgg tcgttctggc cgcgatgcat gaggcgctgg aagcggtcgg ggccggttcg 240

ggcggcaccc gcaacatctc gggcaccacg gcctatcacc gccgtctgga agccgagatc 300

gccgatctgc acggcaagga agcggcgctt gtcttctcct cggcctatat cgccaatgac 360

gcgacgctct cgacgctgcg cgtgcttttc cccggcctga tcatctattc cgacagcctg 420

aaccacgcct cgatgatcga ggggatcaag cgcaatgccg ggccgaagcg gatcttccgt 480

cacaatgacg tcgcccatct gcgcgagctg atcgccgctg atgatccggc cgcgccgaag 540

ctgatcgcct tcgaatcggt ctattcgatg gatggcgact tcggcccgat caaggaaatc 600

tgcgacatcg ccgatgaatt cggcgcgctg acctatatcg acgaagtcca tgccgtcggc 660

atgtatggcc cccgcggcgc gggcgtggcc gagcgtgacg gtctgatgca ccgcatcgac 720

atcttcaacg gcacgctggc gaaagcctat ggcgtcttcg gcggctacat cgccgcttcg 780

gcgaagatgg tcgatgccgt gcgctcctat gcgccgggct tcatcttctc gacctcgctg 840

ccgccggcga tcgccgctgg cgcgcaggcc tcgatcgcgt ttttgaaaac cgccgaaggg 900

cagaagctgc gcgacgcgca acagatgcac gcgaaggtgc tgaaaatgcg gctcaaggcg 960

ctggggatgc cgatcatcga ccatggcagc cacatcgttc cggtggtcat cggtgacccc 1020

gtgcacacca aggcggtgtc ggacatgctc ctgtcggatt acggcgttta cgtgcagccg 1080

atcaacttcc cgacggtgcc gcgcggcacc gaacggctgc gcttcacccc ctcgccggtg 1140

catgacctga aacagatcga cgggctggtt catgccatgg atctgctctg ggcgcgctgt 1200

gcgctgaatc gcgccgaggc ctctgcctga 1230

<210> 2

<211> 951

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtataa aagagcaaac gttaatgacg ccttacctac agtttgaccg caaccagtgg 60

gcagctctgc gtgattccgt acctatgacg ttatcggaag atgagatcgc ccgtctcaaa 120

ggtattaatg aagatctctc gttagaagaa gttgccgaga tctatttacc tttgtcacgt 180

ttgctgaact tctatataag ctcgaatctg cgccgtcagg cagttctgga acagtttctt 240

ggtaccaacg ggcaacgcat tccttacatt atcagtattg ctggcagtgt cgcggtgggg 300

aaaagtacaa ccgcccgtgt attgcaggcg ctattaagcc gttggccgga acatcgtcgt 360

gttgaactga tcactacaga tggcttcctt caccctaatc aggttctgaa agaacgtggt 420

ctgatgaaga agaaaggctt cccggaatcg tatgatatgc atcgcctggt gaagtttgtt 480

tccgatctca aatccggcgt gccaaacgtt acagcacctg tttactcaca tcttatttat 540

gatgtgatcc cggatggaga taaaacggtt gttcagcctg atattttaat tcttgaaggg 600

ttaaatgtct tacagagcgg gatggattat ccacacgatc cacatcatgt atttgtttct 660

gattttgtcg atttttcgat atatgttgat gcaccggaag acttacttca gacatggtat 720

atcaaccgtt ttctgaaatt ccgcgaaggg gcttttaccg acccggattc ctattttcat 780

aactacgcga aattaactaa agaagaagcg attaagactg ccatgacatt gtggaaagag 840

atcaactggc tgaacttaaa gcaaaatatt ctacctactc gtgagcgcgc cagtttaatc 900

ctgacgaaaa gtgctaatca tgcggtagaa gaggtcagac tacgcaaata a 951

<210> 3

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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acccctgaac tggtgcgtcg tttgcgcgat cgcggggccg acgtccgcgt agccatgacc 120

gaagcggcaa aagcctttat caccccactt agcttgcagg cggtttctgg ttatcccgtt 180

tccgacagtc tgctggaccc ggcagccgaa gccgctatgg gccatattga gctgggtaaa 240

tgggctgatt tagtgattct cgcccctgcc acggcagatt tgattgcccg tgttgctgcc 300

ggaatggcga atgacctggt atcgacgatt tgtctggcta cacctgcgcc tgtagccgtg 360

ctccccgcca tgaaccagca gatgtaccgt gccgctgcca cgcagcataa tttagaggtg 420

cttgcttccc gtggtttgct catctggggg ccagacagtg gcagtcaggc ttgtggtgat 480

atcggtcctg ggcgaatgct cgatccgtta accattgtgg atatggcggt agcgcatttt 540

tcgcccgtca acgacctgaa acatctgaac attatgatta ccgccggccc gacgcgtgaa 600

ccgctcgatc cggtgcgtta tatctctaat cacagctccg gcaagatggg ttttgctatc 660

gccgccgccg ctgcccgtcg tggcgcgaac gtcacgctgg tatcaggtcc ggtttcacta 720

ccgacgccac cgtttgttaa acgtgttgat gtgatgaccg cgctggaaat ggaagccgcc 780

gtgaatgctt ctgtacagca gcaaaatatt tttatcggct gcgccgccgt ggcggattat 840

cgcgcagcta ccgtggcccc agagaaaatc aaaaagcagg ccacgcaggg tgatgaatta 900

acaataaaaa tggttaaaaa ccccgatatc gtcgcaggcg ttgccgcact aaaagaccat 960

cgaccctacg tcgttggatt tgccgccgaa acaaataatg tggaagaata cgcccggcaa 1020

aaacgtatcc gtaaaaacct tgatctgatc tgcgcgaacg atgtttccca gccaactcaa 1080

ggatttaaca gcgacaacaa cgcattacac cttttctggc aggacggaga taaagtctta 1140

ccgcttgagc gcaaagagct ccttggccaa ttattactcg acgagatcgt gacccgttat 1200

gatgaaaaaa atcgacgtta a 1221

<210> 4

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcaaaaac gggcgattta tccgggtact ttcgatccca ttaccaatgg tcatatcgat 60

atcgtgacgc gcgccacgca gatgttcgat cacgttattc tggcgattgc cgccagcccc 120

agtaaaaaac cgatgtttac cctggaagag cgtgtggcac tggcacagca ggcaaccgcg 180

catctgggga acgtggaagt ggtcgggttt agtgatttaa tggcgaactt cgcccgtaat 240

caacacgcta cggtgctgat tcgtggcctg cgtgcggtgg cagattttga atatgaaatg 300

cagctggcgc atatgaatcg ccacttaatg ccggaactgg aaagtgtgtt tctgatgccg 360

tcgaaagagt ggtcgtttat ctcttcatcg ttggtgaaag aggtggcgcg ccatcagggc 420

gatgtcaccc atttcctgcc ggagaatgtc catcaggcgc tgatggcgaa gttagcgtag 480

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctcgcgctcg ac 52

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctccttatta aagttaaaca aaattatttc tacag 35

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtttaactt taataaggag gaaaatatat ggactacaat ctggcactcg 50

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagctcggc cacgaagtgc tcaggcagag gcctcggcgc ga 42

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgatggcgaa gttagcgtag gtcatagctg tttcct 36

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctcttttata ctcattacga gccggaagca taaag 35

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatggcgaag ttagcgtagg gcgcgcctgc aggtcgacaa gcttg 45

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gtttgctctt ttatactcat gaattcggat cctggctgtg gtg 43

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgcttccggc tcgtaatgag tataaaagag caaacgttaa t 41

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cacagccagg atccgaattc atgagtataa aagagcaaac 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

accggccagg ctcatttatt tgcgtagtct gacctcttct 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agactacgca aataaatgag cctggccggt aaaaaaatcg 40

<210> 17

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

cgcccgtttt tgcatttaac gtcgattttt ttcatcataa 40

<210> 18

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

aaaaatcgac gttaaatgca aaaacgggcg atttatccgg 40

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cagctatgac ctacgctaac ttcgccatca gcgcc 35

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

caccacagcc aggatccgat aacttcgcca tcagcgcc 38