本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是一種高分子量透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
目前國(guó)內(nèi)大部分微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的企業(yè)采用的工藝發(fā)酵周期長(zhǎng)，一般在36-40左右，產(chǎn)物分子量低，產(chǎn)品透光率差(一般在90％左右)，蛋白質(zhì)含量高，其成品葡萄糖醛酸含量一般為35-38％，部分廠家透明質(zhì)酸產(chǎn)品形態(tài)為纖維狀，此種透明質(zhì)酸溶解困難，一般要2天左右，且收率低于75％，為了滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)不斷擴(kuò)大的需求市場(chǎng)，透明質(zhì)酸的生產(chǎn)工藝亟待改善。
目前大都采用發(fā)酵法來(lái)生產(chǎn)HA，早在1983年日本資生堂采用鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸。隨后發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的研究越來(lái)越廣泛，如日本專(zhuān)利No.58-566922、美國(guó)專(zhuān)利No.60-500997、韓國(guó)專(zhuān)利No.10-250573等。由于發(fā)酵液中含有菌體、蛋白質(zhì)以及核酸等物質(zhì)，從發(fā)酵液中提取HA的方法主要有以下幾種：A.大量稀釋膜濾法，由于發(fā)酵液中菌體等雜質(zhì)較多，極易造成膜孔堵塞，且大量稀釋易形成操作體積過(guò)大；B.高速離心法，除去菌體時(shí)對(duì)設(shè)備的要求很高；C.氯仿法，菌體沉淀中夾帶較多的HA，HA的回收率低，且氯仿對(duì)環(huán)境污染；D.乙醇沉淀法，是一種較為常用的方法，但由于該法操作時(shí)所用設(shè)備及車(chē)間均必須防爆，這勢(shì)必增加了操作的危險(xiǎn)性和生產(chǎn)成本。
現(xiàn)有方法中，對(duì)透明質(zhì)酸蛋白的微量含量一般沒(méi)有辦法再將其去除，微量的蛋白含量容易造成過(guò)敏(因人而異)反應(yīng)，尤其是用在化妝品領(lǐng)域中，微量蛋白的含量依然存在較大的害處。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種產(chǎn)品純度高、蛋白含量低的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
一種提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法，其步驟包括：⑴發(fā)酵液的一次處理、發(fā)酵液的一次處理⑵發(fā)酵液的純化、⑶透明質(zhì)酸的干燥；具體過(guò)程如下：
⑴發(fā)酵液的一次處理
將發(fā)酵液經(jīng)板框過(guò)濾后得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液沉淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行板框過(guò)濾至澄清，得到二次過(guò)濾液；
將二次過(guò)濾液經(jīng)過(guò)外部包裹磁化線(xiàn)圈的一段金屬管道，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行磁化處理，磁場(chǎng)強(qiáng)度為1-3萬(wàn)高斯，經(jīng)過(guò)磁化后，水分子變小，提高透明質(zhì)酸的溶解度，再將濾液用紫外照射10-30秒，使溶液中的蛋白凝結(jié)，獲得微聚集效應(yīng)，再經(jīng)0.3-0.5微米的濾膜或?yàn)V板過(guò)濾，使微量蛋白得以去除；，且在板框過(guò)濾的介質(zhì)中加入5wt％的納米磁珠；
⑵發(fā)酵液的進(jìn)一步純化
將過(guò)濾后的濾液再加入乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，再用乙醇溶液噴淋，獲得沉淀，得到明質(zhì)酸沉淀物；
⑶透明質(zhì)酸的干燥
將上述步驟得到的全部沉淀物經(jīng)2-3次無(wú)水乙醇脫水，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明質(zhì)酸。
而且，所述板框過(guò)濾使用的硅藻土中加入活性炭，用于脫色，活性炭的加入量為總硅藻土的20wt％。
而且，所述乙醇溶液的濃度為：95-98％(v/v)。
而且，所述Nacl溶液的濃度為：0.1-2mol/L。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
1、本發(fā)明提高的純化方法純化效果好，尤其是蛋白去除率高，透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率高，可達(dá)到8-10g/L，其回收率高達(dá)95％，使用性能更加優(yōu)越，溶解性更好，其透光率達(dá)到99％。
2、本發(fā)明采用獨(dú)創(chuàng)的噴淋制粉技術(shù)，使產(chǎn)品結(jié)構(gòu)形態(tài)更加細(xì)膩，3、本發(fā)明將發(fā)酵液經(jīng)二次過(guò)濾液經(jīng)過(guò)外部包裹磁化線(xiàn)圈的一段金屬管道，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行磁化處理，磁場(chǎng)強(qiáng)度為1-3萬(wàn)高斯，經(jīng)過(guò)磁化后，水分子變小，提高透明質(zhì)酸的溶解度，再將濾液用紫外照射10-30秒，使溶液中的蛋白凝結(jié)，獲得微聚集效應(yīng)，再經(jīng)0.3-0.5微米的濾膜或?yàn)V板過(guò)濾，使微量蛋白得以去除；能夠?qū)⑼该髻|(zhì)酸開(kāi)發(fā)成無(wú)過(guò)敏級(jí)化妝品級(jí)和醫(yī)用級(jí)產(chǎn)品。
3、本發(fā)明在過(guò)濾的板框中增加磁珠后，能夠?qū)⒋呕蟮牡鞍滓贿M(jìn)步除去，一進(jìn)步降低雜蛋白含量，保證透明質(zhì)酸的純度，降低過(guò)敏反應(yīng)幾率。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明使用的發(fā)酵菌種屬于外來(lái)菌種，菌種分類(lèi)是獸疫鏈球菌。本發(fā)明提供的方法中，發(fā)酵液的獲得采用如下步驟：
⑴搖瓶種子液：將斜面菌種接種于裝有滅菌培養(yǎng)液400ml的1L錐形瓶中，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，光鏡觀察菌體生長(zhǎng)良好，無(wú)雜菌污染，即可接種于種子罐中；
⑵種子罐種子液：按搖瓶種子液的配方配制培養(yǎng)液60L，加入種子罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至37℃，用火焰法接種，將搖瓶種子液接種于種子罐中，通氣量60L/min，攪拌轉(zhuǎn)速120-140/min，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)，光鏡觀察菌體生長(zhǎng)良好，無(wú)雜菌污染，即可接種于發(fā)酵罐中；
⑶發(fā)酵培養(yǎng)：按種子罐的配方，把糖的用量提高到6％，配制培養(yǎng)液600L，加入1噸的發(fā)酵罐中，通蒸汽加熱，121℃滅菌30分鐘，冷卻至37℃，將種子液通過(guò)移種管道接種于發(fā)酵罐中，維持通氣量400-600L/min，攪拌轉(zhuǎn)速140-160/min，37℃培養(yǎng)24-26小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程中，糖的濃度下降至0.5％以下，PH下降很慢或不再下降時(shí)，即為發(fā)酵終點(diǎn)，得到含有透明質(zhì)酸發(fā)酵液；(以上3個(gè)步驟在馬朝梅(廣西柳州化學(xué)工業(yè)集團(tuán)有限公司)，發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸工藝研究，廣西工學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，18(3):8-12中有報(bào)道，屬于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明申請(qǐng)就不再更加詳細(xì)描述)。
本發(fā)明涉及的提高透明質(zhì)酸產(chǎn)量的方法，其步驟包括：⑴發(fā)酵液的一次處理、發(fā)酵液的一次處理⑵發(fā)酵液的純化、⑶透明質(zhì)酸的干燥；具體過(guò)程如下：
⑴發(fā)酵液的一次處理
將發(fā)酵液經(jīng)板框過(guò)濾后得濾液，加入2-4倍的乙醇溶液沉淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行板框過(guò)濾至澄清，得到二次過(guò)濾液；
將二次過(guò)濾液經(jīng)過(guò)外部包裹磁化線(xiàn)圈的一段金屬管道，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行磁化處理，磁場(chǎng)強(qiáng)度為1-3萬(wàn)高斯，經(jīng)過(guò)磁化后，水分子變小，提高透明質(zhì)酸的溶解度，再將濾液用紫外照射10-30秒，使溶液中的蛋白凝結(jié)，獲得微聚集效應(yīng)，再經(jīng)0.3-0.5微米的濾膜或?yàn)V板過(guò)濾，使微量蛋白得以去除；
在板框過(guò)濾的介質(zhì)中加入5wt％的納米磁珠，加入納米磁珠后能夠增加雜蛋白的去除率，整個(gè)溶液經(jīng)過(guò)磁化后，微聚的雜蛋白能夠與磁珠產(chǎn)生吸附作用，進(jìn)而將其除去。
板框過(guò)濾的硅藻土的型號(hào)為821號(hào)和616號(hào)，將兩種硅藻土按比例混合，得到后裝入板框進(jìn)行過(guò)濾，821號(hào)和616號(hào)硅藻土的重量比例為1：1-5。加入的納米磁珠均勻分布在板框內(nèi)即可。
⑵發(fā)酵液的進(jìn)一步純化
將過(guò)濾后的濾液再加入乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，再用乙醇溶液噴淋，獲得沉淀，得到明質(zhì)酸沉淀物；
⑶透明質(zhì)酸的干燥
將上述步驟得到的全部沉淀物經(jīng)2-3次無(wú)水乙醇脫水，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明質(zhì)酸。
⑷發(fā)酵液的萃取提純：將發(fā)酵液經(jīng)板框過(guò)濾后得濾液，加入3倍的95％乙醇沉淀，收集沉淀物，加入與濾液等體積的0.1mol/L的Nacl溶液攪拌溶解，進(jìn)行二次板框過(guò)濾至澄清，得到二次澄清液；將二次澄清液經(jīng)0.45微米的濾膜或?yàn)V板過(guò)濾后，加入乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0-5.0，得到酸處理后的三次澄清液，再用95％乙醇噴淋三次澄清液，再進(jìn)行沉淀，得到沉淀物；
板框過(guò)濾的硅藻土的型號(hào)為821號(hào)和616號(hào)，將兩種硅藻土按比例混合，得到后裝入板框進(jìn)行過(guò)濾，821號(hào)和616號(hào)硅藻土的重量比例為1：1-5。
⑸干燥制粉：將得到的全部沉淀物經(jīng)無(wú)水乙醇脫水后，用乳化泵進(jìn)行乳化制粉，得粉狀沉淀，進(jìn)一步用無(wú)水乙醇脫水后，50-60℃真空干燥后，含水控制在10％以下，即得透明質(zhì)酸。
經(jīng)本發(fā)明得到的透明質(zhì)酸產(chǎn)品產(chǎn)率高，可達(dá)到8-10g/L，其回收率為95％。
產(chǎn)品性能指標(biāo)：
性狀：白色粉末或細(xì)小顆粒；
氣味：無(wú)臭無(wú)味；
pH(1g/L)：6.9-7.0；
澄清度(1g/L)：透光率>99％；
干燥失重：<8％；
分子量：>1.8×106；
蛋白質(zhì)：<0.03％；
葡萄糖醛酸：≥44.5％；
敏感性降低80％。