本發(fā)明屬于生物技術領域，具體地，涉及一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全的基因組的引物組及方法。

背景技術：

豬流行性腹瀉的病原為豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，其主要誘發(fā)豬只腸道疾病，其癥狀表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉，食欲下降，脫水，且具有顯著的日齡依賴現(xiàn)象。特別對于7日齡內的新生仔豬，在缺乏有效母源抗體下，死亡率可高達100％。2010年底，我國養(yǎng)豬場大范圍爆發(fā)了PED，且近年來仍未得到有效控制對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。2013年4月美洲國家陸續(xù)爆發(fā)PED疫情，隨后亞洲其他國家和部分歐洲國家也相繼爆發(fā)PEDV疫情，再次給世界范圍內的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的危害?；诮炅餍幸岸局甑某霈F(xiàn)及大流行，傳統(tǒng)商品疫苗已經(jīng)對變異毒株缺乏產(chǎn)生充分的抵抗作用。由此，對新流行的PEDV變異株的研究及分析其分子流行病學，可為揭示新發(fā)PEDV感染致病的分子機制和特異性診斷的研制提供必要的理論參考依據(jù)。

豬流行性腹瀉病毒在組成結構上為具有囊膜，且囊膜上有花瓣樣纖突，核酸類型為線性，單股正鏈，不分節(jié)段的RNA病毒。在所有RNA病毒中，冠狀病毒的基因組長度都相對較長。而PEDV完整的基因組核苷酸約有28,038nt，其基因組序列類似于mRNA一樣，5’端具有帽子結構，3’端擁有Poly(A)尾巴。從5’端到3’端，基因結構順序依次為5’UTR-Replicase(ORF1a/b)-S-ORF3-E-M-N-3’UTR；主要編碼的結構蛋白有纖突蛋白(Spike，S)、膜蛋白(Membrane，M)、包膜蛋白(Envelope，E)和核衣殼蛋白(Nucleocapsid，N)。而非結構蛋白有復制酶多聚蛋白(Open Reading Frame 1，ORF1a/b)和ORF3蛋白(Open Reading Frame 3，ORF3)。PEDV基因組5′端非翻譯區(qū)(5′UTR)長296nt，包含一個長約65nt-98nt前導序列(L)，Kozak序列(GUUCAUGC)和一個短小的開放閱讀框(ORF)。3′UTR長度約為334nt，擁有一個所有冠狀病毒都有，但位置不同的保守8堿基(GGAAGAGC)序列。PEDV的復制酶多聚蛋白ORF1a/b(pp1ab)由兩個亞單位蛋白ORF1a和ORF1b共同組成。在核苷酸序列中，ORF1a/b全長約20345nt，由包含46nt重疊序列的且長度分別為12354nt和8037nt的兩個大閱讀框組成，占據(jù)基因組約2/3的核苷酸數(shù)量。ORF1a/b非結構蛋白在病毒感染早期可執(zhí)行多種重要的生物學功能，其中ORF1a主要執(zhí)行蛋白切割作用及參與RNA的復制等，而ORF1b主要編碼RNA依賴性RNA聚合酶。冠狀病毒的纖突蛋白S共同擁有的包括附著于靶細胞，介導囊膜與細胞膜融合等的基本生物學功能。經(jīng)典毒株CV777(AF353511)的S蛋白由約4152nt編碼的1383個氨基酸組成。S蛋白屬于1型的膜糖蛋白，從N到C端，分別是信號肽區(qū)(1-24aa)、長的細胞外區(qū)(25-1333aa)、(1334-1356aa)和較短的細胞質尾部(1357-1383aa)。同時根據(jù)其它冠狀病毒S蛋白的同源性，還可將S蛋白分為通過折疊錨定的纖突亞蛋白S1(l-789aa)和S2(790-1383aa)。其中S1蛋白還可以再細分為具有結合受體的功能區(qū)域S1-NTD(N-terminal domain，19-252aa)和S1-CTD(C-terminal domain，509-638aa)。到目前為止，研究人員在S蛋白上鑒定出1個誘導中和抗體產(chǎn)的區(qū)域COE(99–638aa)和3個誘導中和抗體產(chǎn)生的表位，分別是SS2(748YSNIGVCK 755)，SS6(764LQDGQVKI 771)；2C10，1368GPRLQPY 1374。研究表明，PEDV在細胞內的繁殖需要蛋白水解酶的協(xié)助，并且該過程可能涉及S蛋白。當病毒附著于宿主細胞的細胞膜之后，在外源的胰蛋白酶作用下，S蛋白被酶解斷裂為兩個亞基(S1和S2)，使被侵染的細胞發(fā)生更明顯的病變。此外，S蛋白與體外培養(yǎng)病毒適應能力以及病毒滴度的衰減有關系。ORF3是PEDV惟一輔助基因，其完整的ORF3基因有675nt編碼225aa。而在體外細胞傳代過程中，ORF3核苷酸可以出現(xiàn)不同樣式的缺失，充分表現(xiàn)了其多樣性，與病毒毒力有關。在經(jīng)典疫苗CV777和韓國DR13疫苗毒株中，ORF3基因出現(xiàn)了的49nt的缺失可以作為PCR診斷中，區(qū)分PEDV野毒與細胞致弱毒株的基因標記。2012年，Wang等首次發(fā)現(xiàn)ORF3蛋白和SARS-CoV的3a蛋白一樣，能夠在細胞表面形成鉀離子通道，提高病毒的滴度。PEDV的E基因由231nt組成，編碼76個氨基酸。該蛋白在病毒包膜和病毒粒子的組成等方面起著關鍵的作用。然而，在DR13致弱毒株中，存在21nt的缺失，E基因在PEDV的致病性和結構作用上仍有待研究。研究發(fā)現(xiàn)，E蛋白可以定位于內質網(wǎng)和核仁表面，引起內質網(wǎng)應激效應，不能影響腸道細胞IEC的細胞復制周期，但是可以上調白介素8和細胞凋亡Bcl-2的表達。M基因全長681nt，在目前研究中，其不存堿基的缺失，序列保守性僅次于N基因。M蛋白作為PEDV主要的囊膜結構蛋白，其在病毒粒子的裝配和出芽過程發(fā)揮著重要作用。Laude,H.在其研究中發(fā)現(xiàn)，TGEV在細胞感染中，可以激發(fā)機體產(chǎn)生α-干擾素(IFN-α)。M蛋白還可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體。除此之外，張志榜等還鑒定了M基因的線性表位195WAFYVR200，且該表位不能被TGEV陽性血清識別。PEDV N基因由1326nt組成，編碼441個氨基酸。在PEDV基因組中，在核苷酸數(shù)量和種類上，保守性最高。N蛋白作為一種RNA結合蛋白，能與感染細胞中細胞核磷蛋白共定位于細胞核，根據(jù)呂茂杰報道，其發(fā)現(xiàn)N基因核仁定位信號和N蛋白核仁定位機制提供了依據(jù)。因其富含堿性氨基酸，如賴氨酸和精氨酸殘基等而表現(xiàn)出高度的堿性，在pH＝9.0的低滲非離子溶劑中有最大的溶解度。在冠狀病毒已知結構蛋白中，只有N蛋白是磷酸化的蛋白。絲氨酸殘基被認為是潛在的磷酸化位點，PEDV CH/S毒株的N蛋白總共擁有35個絲氨酸殘基，約占其總氨基酸殘基數(shù)的7.9％，且主要集中在兩個堿性區(qū)域內(57-190aa和199-391aa)。PEDV N蛋白被證實可以抑制干擾素調節(jié)因子3活性和Ⅰ型干擾素的表達，由此影響機體的免疫系統(tǒng)。Xu等研究發(fā)現(xiàn)N蛋白可以延長感染細胞的S周期，同時引起內質網(wǎng)應激和上調白介素8的表達。經(jīng)廣泛的流行調查，目前國內外流行的變異PEDV毒株S基因編碼區(qū)全長4161nt，而CV777作為經(jīng)典毒株的S基因長度僅為4152nt。其原因主要為變異株在S基因的S1片段有15nt插入和6nt缺失。據(jù)Chen等調查，由于進化差異，PEDV的S基因呈現(xiàn)了序列長度和核苷酸差異的多樣性。在NCBI數(shù)據(jù)庫的序列中，S基因長度從3359-4255nt，多達11種長度類型。而4161nt的長度的序列同樣占絕大部分(約68.4％)，且均為2010年后被檢測到的，表明目前該種類的毒株具有較明顯的進化優(yōu)勢。除此之外，MF3809/2008/South Korea(KF779469)，TC-PC177-P2，Tottori2/JPN/2014以及TTR-2/JPN/2014(LC063828)等近年分離得到的變異毒株在S基因中存在大片段的核苷酸缺失，也屬罕見。在序列同源性中，變異毒株與CV777毒株均不高，且存在核苷酸的插入和缺失，提示著PEDV變異毒株相對于30多年前的經(jīng)典毒株表現(xiàn)較快的變異速度。在主要抗原中和位點中，變異株與經(jīng)典毒株有著多處氨基酸的突變。這些位點的變化可能是目前疫苗株不能對變異毒株產(chǎn)生良好保護的主要原因。然而關于這些突變的位點以及氨基酸的插入和缺失對S結構基因影響是否對其抗原性、毒力等生物功能仍有待進一步探索。除了S基因的變化，在基因組其他位置，眾多可缺失的基因位置和數(shù)量都有所差異，也豐富了PEDV毒株的生物多樣性，從而也使得該病毒的研究存在更多的不確定性。例如在ORF1a/b基因中，在1036-1043位氨基酸中，可有8個氨基酸缺失(Attenuated DR13等毒株)；再者在E基因中，67–87位核苷酸位置上，存在21核苷酸缺失(Attenuated DR13毒株)；在ORF3基因中，在246位核苷酸開始，存在49個核苷酸的缺失等。

PEDV作為單股RNA類病毒，相比DNA類病毒存在更高的突變概率。雖然從90年代就開始應用疫苗免疫PED，但2006年Chen等報道有少量即使免疫了二聯(lián)疫苗的豬場仍然會發(fā)生PED疫情。直到2010年底，PED疫情在我國大面積流行，這表明PEDV毒株一直在不斷變異，現(xiàn)行疫苗對其的抵抗作用越來越小。據(jù)目前報道，體外試驗中變異毒株與CV777毒株的血清學反應結果是不高的。雖然近年的G2亞群毒株仍然不斷擴散，但是自從2006年以后，G1亞群毒株被報道的頻率遠遠少于G2亞群，這應是CV777為基礎的疫苗發(fā)揮了很大的作用。所以，獲得足夠的PEDV基因信息，對防控和診治PED的疫情將提供關鍵的診斷基礎。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術中豬流行性腹瀉病毒基因信息少，難以防控和診治的缺陷和不足，提供一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的引物組。本發(fā)明通過設計22對引物組對PEDV進行全覆蓋式地擴增，更便利地擴增出PEDV全長基因，將龐大的基因組細分為多段，可便于定點研究特定區(qū)段的核苷酸變化，包括位點突變、核苷酸插入與缺失等，以更好把握PEDV基因的變化動態(tài)，了解毒株的變化，為解決該病提供準確的分子信息。

在該方案中，本發(fā)明首要需克服的技術問題是如何設計匹配引物組，能夠在實現(xiàn)擴增PEDV全長基因信息目的得基礎上，能夠將PEDV的引物擴增片段長度控制在約1600bp以內，以適應當前相對比較成熟且廉價的第一代基因測序技術，且由引物擴增得到的序列片段間可以首尾相連，且有足夠的重疊序列(35～931bp)。以及摸索設計出來的22對引物各自的最佳退火溫度和時間，探索出最佳的PCR體系和程序。

本發(fā)明的目的是提供一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的引物組。

本發(fā)明的另一目的是提供利用上述引物組擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的方法。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案給予實現(xiàn)的：

一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的引物組，所述引物組包括22個引物對，各引物對上下游引物依次如如SEQ NO.1～SEQ NO.44所示。

本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中CV777(AF353511)的核苷酸序列，利用生物信息學方法，設計并篩選了用于擴增PEDV全長基因組核苷酸信息的22對引物，運用分子生物學手段成功擴增出來了22對擴增產(chǎn)物，利用基因測序技術和生物信息學技術，獲得PEDV全長基因信息。而所述PEDV基因組的5’和3’末端都采用了小片段擴增設計，使擴增產(chǎn)物控制在700bp內，主要是兼顧了要使用非常規(guī)的引物擴增5’UTR前端和3’UTR末端序列，如采用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification擴增技術擴增5’UTR最前端和3’UTR最末端準確的核苷酸序列。本發(fā)明設計的引物組相鄰兩個擴增片段之間具有39～931bp的重疊同源序列，便于測序拼接，同時所有引物組的擴增片段均小于1600bp，易于PCR反應的進行。

一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的方法，所述方法為：提取PEDV總RNA，反轉成cDNA，分別利用上述上述22個引物對進行PCR擴增反應，分別進行克隆測序(將PCR產(chǎn)物連接克隆載體，選取陽性克隆，DNA測序鑒定)，最后拼接序列，得到PEDV全基因組序列。

其中，所述PCR產(chǎn)物均小于1600bp，易于PCR反應的進行。

所述PCR擴增反應同時在一個溫度梯度PCR儀中進行，通過采用同一個PCR反應程序，不同引物對應不同退火溫度，一次性、高效地完成PEDV的全基因組序列擴增。

優(yōu)選地，所述PCR儀的溫度梯度為48℃～57℃。

優(yōu)選地，所述PCR擴增反應程序為：94℃預變性1min；94℃變性6s，退火溫度下(48℃～56.1℃)退火20s，72℃延伸20s，循環(huán)36次；72℃終延伸7min；所述退火溫度對應為22個引物對各自對應的退火溫度。

優(yōu)選地，所述PCR擴增反應的體系為：上游引物(10μM)2.0μL、下游引物(10μM)2.0μL、cDNA 2.0μL、2×PrimerSTAR Max 25.0μL、ddH₂O 19.0μL。

優(yōu)選地，22個引物對分別為引物對5'、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、3'，各引物對上下游引物依次如SEQ NO.1～SEQ NO.44所示；

22個引物對的退火溫度分別為：

引物對3'、引物對9、引物對10、引物對11、引物對13、引物對16、引物對20的退火溫度均為56.1℃；

引物對1、引物對6、引物對7、引物對8、引物對14、引物對17、引物對18、引物對19的退火溫度均為55.2℃；

引物對5'、引物對2、引物對5的退火溫度均為54.1℃；

引物對3的退火溫度為53.0℃，引物對4的退火溫度為50.8℃，引物對12的退火溫度為48.9℃，引物對15的退火溫度為48.0℃。

另外，具體優(yōu)選地，上述方法中，所述克隆測序的具體方法為將PCR擴增產(chǎn)物回收純化，擴增產(chǎn)物3’末端加堿基A，然后連接至pMD18-T載體，轉化Top 10感受態(tài)細胞，篩選和鑒定重組菌后，進行測序；

所述拼接序列的具體方法為：測序結果利用Lasergene 7.10生物信息學軟件中的Editseq軟件進行去除包括引物對在內的外向端序列，全長序列的拼接及同源性分析；同時，運用NCBI中GenBank快速比對工具BLAST進行測序結果的驗證或比對搜索，完成序列與數(shù)據(jù)庫中的已有序列進行比對分析。

另外，上述引物組或/和擴增方法在豬流行性腹瀉病毒基因或基因組擴增方面的應用亦在本發(fā)明保護范圍內。

同時，本發(fā)明還提供一種擴增豬流行性腹瀉病毒基因組上特定區(qū)域的方法，所述方法為根據(jù)需要任意組合上述22個引物對進行PCR擴增反應。

另外，上述方法在豬流行性腹瀉病毒基因組特定區(qū)域研究上的應用亦在本發(fā)明保護范圍內。

優(yōu)選地，所述應用為檢測豬流行性腹瀉病毒突變位點、核苷酸插入或缺失上的應用。

本發(fā)明上述方法是一種操作簡易、快速、穩(wěn)定、分區(qū)段地擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的方法。首先以PEDV的cDNA為模板，以自行設計的22對引物，通過高保真DNA聚合酶，擴增獲得PEDV的全長序列。將22對引物擴增的PCR產(chǎn)物連接克隆載體、選取陽性克隆、DNA測序鑒定，再將所測序列通過軟件拼接，得到PEDV全長核苷酸序列信息。本發(fā)明主要優(yōu)點在于可以在一個溫度梯度PCR儀器里面，通過采用同一PCR反應程序，不同引物與不同退火溫度，一次性、高效地完成PEDV的全基因組序列擴增。由于是全覆蓋式地擴增，且擴增片段均不超過1600bp，所以也便于根據(jù)所需研究的特定區(qū)域進行定區(qū)域擴增。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的22對引物對擴增特異性和敏感性好，可對PEDV進行全覆蓋式地擴增。且引物組的5’和3’末端都采用了小片段擴增設計(主要是兼顧了如要使用SMARTer^TMRACE cDNA Amplification擴增技術擴增5’UTR最前端和3’UTR最末端的核苷酸序列)，擴增片段長度控制在1600bp以內，可以適應當前相對比較成熟且廉價的第一代基因測序技術。22對引物設計位點合適，相鄰兩個擴增片段之間具有重疊同源序列，便于測序拼接。

(2)本發(fā)明所述引物組能夠實現(xiàn)完美匹配，擴增方法通過在一個溫度梯度PCR儀中同時采用相同的PCR反應體系和程序，一次性高效地完成了PEDV的全基因組序列擴增。

(3)由于PEDV全長基因組較大，本發(fā)明的引物組和方法將龐大的基因組細分為多段，可便于定點研究特定區(qū)段的核苷酸變化，包括位點突變、核苷酸插入與缺失等，可以更好地把握PEDV基因的變化動態(tài)，了解毒株的變化，為解決該病提供準確的分子信息。

附圖說明

圖1為本發(fā)明設計的22對引物在PEDV基因組中的位置分布圖。

圖2為本發(fā)明設計的22對引物擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為5’引物對測序片段去除上游引物及其外向端序列過程圖。

圖4為由參考序列指引的22段去除引物信息的拼接效果圖。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

實施例1豬流行性腹瀉病毒(PEDV)全長引物設計

1、根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中CV777(AF353511)的核苷酸序列，經(jīng)過大量的設計篩選研究，最終得出了22對引物用于擴增PEDV全基因組，所述引物組如表1所示，引物對之間重疊的位置及大小如表2所示，引物的最佳退火溫度及溫度梯度如表3所示。

表1全長引物序列表

注：相對核苷酸位點參考毒株SHQP/YM/2013(GenBank收錄號：KJ196348)。

表2全長引物序列重疊長度表

注：引物對14與引物對15重疊區(qū)間核苷酸數(shù)量為931，主要是優(yōu)先考慮了引物對16、引物對17、引物對18的組合可以完整地擴增PEDV序列中重點研究序列區(qū)間的S基因。而促使引物對15向前推移，從而與引物對14有較多重疊。

表3全長引物最佳退火溫度及溫度梯度PCR儀設定

注：梯度PCR為8*12孔數(shù)，溫度梯度設置為(48℃～57℃)。

實施例2豬流行性腹瀉病毒(PEDV)全基因組擴增方法

1、PEDV流行毒株的獲取

采集臨床上疑似感染PEDV的豬只腸道組織樣品，低溫保存并剪取若干個黃豆大的組織塊進行研磨。研磨中混入石英砂，添加約5mL左右預冷的PBS。勻漿收集到10mL Ep管中，置-80℃超低溫冰箱中凍融3次。樣品再經(jīng)10,000×g 4℃離心10min。取上清，經(jīng)0.22μm濾膜過濾。將所得到的研磨濾液分成若干管凍存于-80℃超低溫冰箱中，待核酸提取用。

2、組織樣品總RNA的提取

用Magen超純RNA提取試劑盒提取研磨液中總RNA。取濾液250μL加入750μL的Trizol中，取250μL的PBS于滅菌離心管中，加入750μL TRIzol，劇烈振蕩，室溫下作用5分鐘。再加200μL氯仿，劇烈振蕩，室溫下放置5分鐘。4℃12,000r/min離心15分鐘。將500μL上層水相移到另一新的滅菌微量離心管中，加入500μL異丙醇，輕柔混勻，-20℃放置15分鐘。12,000r/min離心15分鐘，傾去上清液。加入1,000μL冰預冷的75％乙醇，緩慢顛倒搖勻。4℃12,000r/min離心15分鐘。輕輕棄去上清，放置3-5min以風干沉淀。加入20μL的RNase Free雙蒸水溶解RNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、病毒cDNA第一鏈的合成

參照東洋紡(上海)生物科技有限公司的改良型高效逆轉錄酶試劑盒ReverTra Ace(TRT-101)的說明書進行。取提取的RNA進行cDNA第一鏈的合成，20μL的反轉錄體系中包括以下各組分(如表4)：

表4反轉錄體系

將以上組分充分混勻，然后立即置于42℃水浴鍋中孵育1h，所得到的cDNA置于-20℃保存。

4、PCR擴增方法

運用22對全長引物，使用以下PCR反應體系和反應程序進行擴增(如表5)：

表5PCR反應體系

PCR擴增程序：

5、擴增產(chǎn)物的回收與純化

將所有擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈短暫照射下切取目的片段，參照Magen公司DNA快速回收試劑盒進行回收純化，具體方法如下：

(1)將目的基因DNA片段經(jīng)0.8～1％的瓊脂糖凝膠電泳分離；

(2)電泳結束后，將瓊脂糖凝膠經(jīng)EB染色后，在長波紫外燈下用潔凈、鋒利的手術刀片切取含目的基因片段的瓊脂凝膠塊，放入一個潔凈的1.5或2mL離心管中；

(3)按1:3的比例(凝膠質量:溶膠液體積(mg：mL)加入溶膠液(Extraction Buffer)；

(4)于56℃恒溫水浴或金屬洛中溫育10-15min，直到凝膠塊融化，溫育過程中每隔2～3min上下顛到混勻一次；

(5)將混合液轉移至回收柱內，6,000r/min，離心1min，棄去管內液體；

(6)將500μL溶膠液加入回收柱內，12000r/inin，離心1min，棄去管內液體；

(7)向回收柱內加入750μL洗滌液(Wash Buffer)，室溫靜置2～5min，12,000r/min，離心1min，棄去管內液體；

(8)再次于12,000r/min，離心2min，然后將回收柱轉移到無菌1.5mL離心管中，打開蓋子，室溫靜置2～5min，待其自然風干；

(9)向離心柱內加30～50μL洗脫液、ddH₂O或TE溶液，于37℃溫育5min；

(10)12,000r/min，離心3min，如有需要可將離心管中的液體再次加入到離心柱內，再次洗脫，離心管底部的液體即為回收的目的基因片段，可直接用于連接反應，或于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

6、擴增產(chǎn)物3’末端加堿基A

由于高保真酶擴增出來的PCR片段為平末端，而普通Taq酶具有在PCR產(chǎn)物3’末端加一個堿基A的特性，由此可以與粘性末端的pMD18-T載體連接，從而可以大大提高片段與載體連接的效率。具體反應體系如表6：

表6擴增產(chǎn)物3’末端加堿基A反應體系

反應程序為72℃30min。

7、PCR片段與載體連接

將3’末端加堿基A的PCR產(chǎn)物進行濃度測定，并以1:3/1:5的摩爾比例與pMD18-T載體進行連接(連接體系如表7)。

表7連接體系

上述體系經(jīng)充分混勻后，置于連接儀中，16℃連接過夜。次日將連接產(chǎn)物放入65℃水浴鍋水浴5min對連接酶進行滅活。然后將產(chǎn)物進行后續(xù)連接或置于-20℃保存。

8、連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞

(1)感受態(tài)細胞的制備

Top 10感受態(tài)細胞的制備參照J.薩姆布魯克(1998)《分子克隆實驗指南》的方法進行。挑取Top 10單菌落接種于4mL LB培養(yǎng)液中，37℃，200～220r/min振蕩培養(yǎng)12小時。取15μL菌液加到1.5mL LB液體培養(yǎng)基中，200r/min振蕩培養(yǎng)3小時，此時細菌為對數(shù)生長期。冰浴10分鐘，4℃4,000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體。加入500μL預冷的0.1M CaCl₂重懸菌體。4℃，4,000r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，用500μL預冷的0.1M CaCl₂重懸菌體。置冰上30分鐘，4℃，4100r/min離心10分鐘，棄上清，收集菌體，用100μL 0.1M CaCl₂重懸菌體，冰浴直接轉化，或加終濃度為10％的甘油，-80℃保存。

(2)連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞

將獲得的連接產(chǎn)物10μL加入100μL Top 10感受態(tài)細胞中，同時設立不加任何質粒的感受態(tài)細胞做陰性對照及pET-32a質粒為陽性對照。輕輕混勻，冰浴30min，42℃熱擊90秒后立刻冰浴10min，然后加入750μL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振搖培養(yǎng)1h。振蕩培養(yǎng)后4,000r/min離心5min，棄上清，沉淀重懸于150μL LB培養(yǎng)液中，吹打混勻。取上述菌液涂布于含氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，待菌液完全吸收后，倒置放入37℃溫箱培養(yǎng)12～18h，觀察結果。

9、重組菌的篩選和鑒定

從轉化完成的LB瓊脂平板上挑取大小均一、形態(tài)圓潤的疑似陽性單菌落，通過無菌操作將各個待檢菌落挑至含有30μL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基的1.5mL的無菌離心管中，移液器吹打均勻成細菌懸浮液，同時以此懸浮液做模板進行菌落PCR鑒定(PCR體系如表8)，引物對序列如表1所述?；蚪M全長各段基因擴增分別用對應的引物進行擴增。

表8PCR體系

PCR擴增程序：

擴增產(chǎn)物進行1～2％的瓊脂糖凝膠電泳，選取能擴出強且特異目的條帶的對應的菌液至試管氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)液中搖菌，并無菌吸取300μL菌液于1.5mL Ep管中，送上海英駿生物技術有限公司進行測序。

10、全基因組測序結果處理與分析

測序結果回來后，利用Lasergene 7.10生物信息學軟件中的Editseq軟件進行去除包括引物對在內的外向端序列(例如圖3所示)，全長序列的拼接(如圖4所示)及同源性分析。同時，運用NCBI中GenBank快速比對工具BLAST進行測序結果的驗證或比對搜索。

實施例3上述分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因的引物組及方法應用案例

基于本發(fā)明人研究室成功分離得到的新發(fā)流行的PEDV野毒株，為了更好更便利地研究新毒株，為此，發(fā)明人研發(fā)了本發(fā)明上述基因擴增方法。并成功運用本發(fā)明所述的引物組和方法得到了該PEDV野毒株序列的全長序列信息。

將所述PEDV野毒株全長序列經(jīng)過美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的DNA數(shù)據(jù)庫，運用相似性比較的分析工具程序(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)，與公開數(shù)據(jù)庫進行相似性序列比較。

經(jīng)初步研究，本發(fā)明人研究室發(fā)現(xiàn)的兩株野毒株：CH/GDZH01/1311毒株與CH/GDZH02/1401毒株的核苷酸相似性為99.7％。而他們分別于二十世紀七十年代分離得到的CV777(AF3535111)毒株的核苷酸相似性分別僅為96.8％和96.6％。

另外，將CH/GDZH02/1401毒株傳代65代次后，即為CH/GDZH02/1401-P65毒株，其相對于親本毒株CH/GDZH02/1401發(fā)生了基因序列上多達14處氨基酸突變。不僅如此，尤其CH/GDZH02/1401-P65毒株在S基因胞質區(qū)，出現(xiàn)連續(xù)2個核苷酸的缺失，導致S蛋白翻譯的提前終止。有研究表明，冠狀病毒的此類這種現(xiàn)象可引起S基因過表達。此結果提示如果該傳代病毒的負責刺激機體產(chǎn)生主要抗原的纖突蛋白S過表達，將有益于疫苗開發(fā)。

再者，CH/GDZH02/1401-P65毒株在ORF3基因出現(xiàn)了連續(xù)6個核苷酸的缺失，這一位置的缺失是目前NCBI數(shù)據(jù)庫上的毒株都沒有被公開的新現(xiàn)象。且這一位點的核苷酸缺失尚未有相關試驗證明其功能，所以此位點的發(fā)現(xiàn)是一個新的發(fā)現(xiàn)同時也將是本發(fā)明人研究室后續(xù)研究的重點對象之一。

最后，本發(fā)明人已經(jīng)將本研究室分離得到的兩株PEDV野毒株和其中一株野毒株細胞傳代株的基因組序列信息提交到NCBI，其中CH/GDZH01/1311毒株接收號為KR153325、CH/GDZH02/1401毒株的接收號為KR153326，而傳代毒株CH/GDZH02/1401-P65毒株的接收號為KX016034。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農業(yè)大學

<120> 一種分段擴增豬流行性腹瀉病毒全基因組的引物組及方法

<130> 2016

<160> 44

<170> PatentIn version 3.3

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