本發(fā)明涉及一種用于評價人員防護裝備防護性能的細菌標準物質及其制備方法，屬于生物安全技術領域。

背景技術：
：

人員防護裝備和設施在隔離傳染源，阻斷微生物氣溶膠的傳播途徑和保護易感人群三方面均發(fā)揮著重要作用，生物安全柜、生物防護口罩、生物防護服等，都是防護和阻斷呼吸道傳染病病原傳播感染最有效的常用人員防護裝備。在這些防護裝備的性能評價中，微生物防護性能評價最為關鍵。

粘質沙雷氏菌是一種傳統(tǒng)的空氣生物學模式菌，其粒譜集中在3.3-0.65μm。經(jīng)過很多學者研究表明，粘質沙雷菌具有典型的菌落顏色、耐霧化能力強、容易消毒避免對環(huán)境造成污染等優(yōu)點，適合作為生物檢測指示菌，應用于生物安全柜等人員防護裝備的防護性能評價中。

但是，在人員防護裝備防護性能測試的實際現(xiàn)場實驗中，檢驗人員往往只能根據(jù)工作經(jīng)驗配制指示細菌懸液，很難保證其量值完全一致。此外，配制指示細菌懸液的過程比較繁瑣，而且浪費大量人力、物力和時間，從而大大影響了評價結果的準確性和評價工作的效率。因此，為保證人員防護裝備防護性能評價的準確性和可比性，非常有必要制備一種人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種人員防護裝備微生物防護性能評價的細菌標準物質，以及所述標準物質的制備方法。

為實施上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種人員防護裝備微生物防護性能評價用細菌標準物質，其特征在于，包括有粘質沙雷氏菌。

所述粘質沙雷氏菌用2mL穩(wěn)定劑水溶液復水后，粘質沙雷氏菌活菌濃度為0.5×10¹⁰～5.0×10¹⁰CFU/mL。

所述的標準物質，由兩個組分組成：

1)粘質沙雷氏菌，為含粘質沙雷氏菌菌體和菌體保護劑的凍干物；

2)用于菌體凍干物復水的穩(wěn)定劑水溶液。

所述菌體保護劑，其成分選自葡萄糖、明膠、卵黃中的一種或多種；

所述凍干物優(yōu)選為餅狀或球狀；

所述穩(wěn)定劑水溶液含無機鹽、牛血清白蛋白和抗壞血酸。

制成所述菌體保護劑的原料組成為：葡萄糖0～10重量份，明膠0～10重量份，卵黃0～10重量份；優(yōu)選的組成為：葡萄糖5～7重量份，明膠1～2重量份，卵黃2～3重量份。

所述穩(wěn)定劑水溶液中各成分的質量體積百分比：0.1～1.0％的氯化鈉、0.1～1.0％的牛血清白蛋白和0.2～2％的抗壞血酸，其余是水。

上述標準物質的制備方法，其特征是，用生理鹽水將粘質沙雷氏菌菌體稀釋至10¹⁰級，將配制成新鮮菌勻液與保護劑按照1:1的體積比混合，于-70℃下預凍4h后凍干，得到所述標準物質。

所用的粘質沙雷氏菌的培養(yǎng)方法是：挑取單菌落于已高壓滅菌的營養(yǎng)肉湯中，30℃±1℃下，180×g搖床培養(yǎng)12h。

制備得到的標準物質于-20℃下保存。

所述標準物質的定值方法，為營養(yǎng)瓊脂平板涂布法，具體操作如下：

用2mL穩(wěn)定劑水溶液對標準物質進行復水溶解，充分混勻后制備成S₀樣品勻液；

再用無菌磷酸鹽緩沖液對充分溶解后的樣品S₀進行10倍系列稀釋；根據(jù)給出的粘質沙雷氏菌活菌濃度范圍進行估算，選擇三個稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取0.2mL樣品勻液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，將平板靜置10min后，倒置于培養(yǎng)箱，30℃±1℃下培養(yǎng)12～24h；

選擇有典型的粘質沙雷氏菌菌落且菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)和記錄稀釋因子；菌落計數(shù)以菌落形成單位CFU表示，實驗結果以活菌濃度表示，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，計算標準值；定值結果表示為：標準值±擴展不確定度。

所述計算標準值，按如下公式：

式中，

C為粘質沙雷氏菌活菌濃度，CFU/mL；

N為平板上粘質沙雷氏菌典型菌落的總數(shù)，CFU；

d為稀釋因子，無量綱；

v為平板上粘質沙雷氏菌勻液的接種體積，mL。

本發(fā)明的優(yōu)點如下：

1、本發(fā)明提供的保護劑配方可以有效降低粘質沙雷氏菌在冷凍干燥過程中的死亡率

通過對保護劑成分的篩選和優(yōu)化，找到了適合粘質沙雷氏菌穩(wěn)定保存的凍干保護劑配方。

2、本發(fā)明提供的用于菌體凍干物復水的穩(wěn)定劑水溶液可以保證標準物質復水溶解后在4℃下穩(wěn)定保存8小時。

3、制備的細菌標準物質在4℃下，可儲存14天；在-20℃下可長期儲存，且便于運輸，其均勻性、穩(wěn)定性符合人員防護裝備防護性能評價工作的要求。

4、該標準物質使用方便，按照使用說明將第二組分加入第一組分中進行復水溶解后，即可使用，避免了每次現(xiàn)場測試評價前，人工配制指示菌勻液耗時和操作繁瑣的缺點。

5、通過對平板計數(shù)方法的優(yōu)化，建立了適合粘質沙雷氏菌標準物質的定值方法——營養(yǎng)瓊脂平板涂布法，并建立了定值結果的計算公式。

附圖說明：

圖1粘質沙雷氏菌的生長曲線；

圖2標準物質的短期穩(wěn)定性考察結果；

圖3標準物質的長期穩(wěn)定性考察結果。

具體實施方式

以下結合具體實施方式詳細說明本發(fā)明技術方案，并不以此限定本發(fā)明的實施范圍。凡依照本發(fā)明公開內容所做的本領域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質(粘質沙雷氏菌標準物質)的制備

一、材料、儀器與方法

1.試驗材料

粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)標準菌株ATCC8039(軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所菌種保藏庫)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽液(Phosphate Buffered Saline，PBS)、無菌生理鹽水(0.85％)(北京陸橋技術有限責任公司)；氯化鈉、牛血清白蛋白、抗壞血酸、葡萄糖、明膠、卵黃(美國Sigma公司)；棕色西林瓶(深圳市寶安區(qū)沙井博海玻璃制品廠)。

2.儀器與設備

Beta1-8LD plus冷凍干燥機(德國Christ公司)；CR21G高速冷凍離心機(日本Hitachi公司)；HVE-50高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)；HWS-400恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Milli-Q Advantage純水儀(美國Millipore公司)；CP225D電子天平(德國Sartorius公司)。

3.主要培養(yǎng)基的配制

(1)營養(yǎng)肉湯(NB)

稱取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，1.0g葡萄糖，5.0g氯化鈉于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調pH值至7.5±0.2，分裝試管，121℃高壓滅菌15min備用。

(2)營養(yǎng)瓊脂(NA)

稱取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化鈉，15.0g瓊脂于1L蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調pH值至7.3±0.2，分裝試管，121℃高壓滅菌15min備用。

(3)磷酸鹽(PBS)緩沖液

pH7.2～7.4PBS的磷酸鹽儲存液：磷酸二氫鉀34.0g，氫氧化鈉7.0g，加蒸餾水溶解，調節(jié)pH值后用容量瓶定容至1000mL，裝入高壓滅菌瓶，121℃高壓滅菌30min；

pH7.2～7.4PBS的磷酸鹽稀釋液：取1.25mL磷酸鹽儲存液加入蒸餾水，調節(jié)pH值后用容量瓶定容至1000mL，裝入高壓滅菌瓶，121℃高壓滅菌30min；

4.菌種復活、鑒定與培養(yǎng)

吸取1mL無菌生理鹽水于標準粘質沙雷氏菌菌種凍存管中，待其溶解后，用無菌接種環(huán)沾取少量菌液，接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃±1℃培養(yǎng)18-24h，復蘇菌種。挑取單菌落接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基37℃±1℃下培養(yǎng)12h。

5.粘質沙雷氏菌標準菌株生長曲線的繪制

將培養(yǎng)好的液態(tài)菌種100μl加入100mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，30℃搖床，180×g培養(yǎng)，每隔1h取一次樣，以粘質沙雷氏菌菌液的培養(yǎng)時間為橫坐標,每次所測得的菌液的平均A₆₀₀值為縱坐標，繪制出其生長曲線。

6.保護劑的配制

選擇葡萄糖、明膠、卵黃中的一種或多種作為菌體保護劑成分。其重量百分比分別為5～7％的葡萄糖、1～2％的明膠、2～3％的卵黃。凍干保護劑用磷酸鹽緩沖液溶解；且保護劑和磷酸鹽緩沖液均需要滅菌；滅菌方法為輻照滅菌或高壓滅菌；比如，冷凍干燥保護劑經(jīng)過4kGy的Co60進行輻照滅菌，磷酸鹽緩沖液采用高溫高壓滅菌121℃，20min。

7.凍干

挑取單菌落于已高壓滅菌的營養(yǎng)肉湯中，30℃±1℃下，180×g搖床培養(yǎng)12h后，用高速冷凍離心機離心收集菌體，用生理鹽水稀釋至10¹⁰級，將保護劑與生理鹽水稀釋至10¹⁰級的新鮮菌勻液按照1:1比例配制混合液，用移液器分裝2mL至棕色西林瓶中，共制備200個單元。將制備好的樣品于-70℃下預凍4h后凍干。凍干采用的參數(shù)主要為冷阱溫度-50℃，凍干溫度-40℃，隔板最終溫度25℃，凍干壓力0.037mbar。

8.凍干存活率檢測

取3份凍干前粘質沙雷氏菌與凍干保護劑的混合液，每份各2mL，采用經(jīng)驗證的營養(yǎng)瓊脂平板涂布法測定其活菌濃度。隨即取3個單元粘質沙雷氏菌凍干標準物質，用2mL磷酸鹽緩沖液作為稀釋液將粘質沙雷氏菌凍干樣品進行復溶后，同樣采用經(jīng)驗證的營養(yǎng)瓊脂平板涂布法測定其活菌濃度。采用公式①計算凍干存活率(freeze-drying viability,FDV)。

式中，F(xiàn)DV為粘質沙雷氏菌凍干存活率；C₁為凍干前粘質沙雷氏菌活菌濃度；C₂為凍干后粘質沙雷氏菌活菌濃度。

9.標準物質的定值

每批次至少抽取9個單元的標準物質進行定值實驗。每個單元均按照以下步驟完成實驗：用2mL穩(wěn)定劑水溶液對標準物質進行復水溶解，充分混勻后制備成S₀樣品勻液；再用無菌磷酸鹽緩沖液對充分溶解后的樣品S₀進行10倍系列稀釋；根據(jù)給出的粘質沙雷氏菌活菌濃度范圍進行估算，選擇三個稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別吸取0.2mL樣品勻液涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，將平板靜置10min后，倒置于培養(yǎng)箱，30℃±1℃下培養(yǎng)12～24h；選擇有典型的粘質沙雷氏菌菌落且菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的平板，計數(shù)典型菌落數(shù)和記錄稀釋因子。菌落計數(shù)以菌落形成單位(colony-forming units，CFU)表示，實驗結果以活菌濃度(CFU/mL)表示，計數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落，按公式②計算結果。

式中，C為粘質沙雷氏菌活菌濃度；N為平板上粘質沙雷氏菌典型菌落的總數(shù)；m為典型菌落數(shù)在15CFU～150CFU范圍的平板數(shù)；d為稀釋因子；v為平板上粘質沙雷氏菌勻液接種體積。

10.標準物質的保存

制備好的標準物質于-20℃下保存。

二、實驗結果

1.粘質沙雷氏菌生長曲線測定結果

將培養(yǎng)好的液態(tài)菌種100μl加入100mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，30℃搖床，180×g培養(yǎng)，每隔1h取一次樣，以粘質沙雷氏菌菌液的培養(yǎng)時間為橫坐標,每次所測得的菌液的平均吸光值A₆₀₀為縱坐標，繪制出其生長曲線(圖1)，粘質沙雷氏菌的生長曲線分為四個時期，即起始期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和凋亡期。該菌大約在3～4h后進入對數(shù)生長期；大約在16h左右進入穩(wěn)定期，最后進入衰亡期。當菌液培養(yǎng)到對數(shù)期的中后期時，此階段的菌液活性最佳，因此選擇培養(yǎng)12h為菌體收獲期。

2.凍干存活率檢測結果

取3份凍干前粘質沙雷氏菌與凍干保護劑的混合液，每份各2mL，采用經(jīng)驗證的營養(yǎng)

瓊脂平板涂布法測定其活菌濃度。隨即取3個單元粘質沙雷氏菌凍干標準物質，用2mL磷酸鹽緩沖液作為稀釋液將粘質沙雷氏菌凍干樣品進行復溶后，同樣采用經(jīng)驗證的營養(yǎng)瓊脂平板涂布法測定其活菌濃度。采用公式①計算凍干存活率為92.14％，檢測數(shù)據(jù)與計算結果見表1，證明該粘質沙雷氏菌與保護劑混合后具有極高的存活率。

表1粘質沙雷氏菌凍干存活率檢測結果

3.標準物質的定值結果

將隨機抽取的9個單元的標準物質分別采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進行測試，每個單元標準物質重復3次。

將培養(yǎng)后的平板放置在生物安全柜中觀察，選擇有典型的粘質沙雷氏菌菌落且菌落數(shù)在15CFU～150CFU之間的S₈平板(稀釋因子為10^-8)計數(shù)，根據(jù)平板上的菌落數(shù)按照公式②計算粘質沙雷氏菌樣品的活菌濃度(見表2)。

按照JJF1343《標準物質定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》對定值數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗、可疑值檢驗和等精度檢驗合格后，取算數(shù)平均值作為標準物質的標準值，量值為

1.09×10¹⁰CFU/mL，相對標準偏差為6.15％(見表2)。

表2粘質沙雷氏菌標準物質的定值結果(m＝9，n＝3)

以上實驗證明，通過加入保護劑，可以有效的降低菌體在冷凍干燥過程中的死亡率，本發(fā)明的標準物質凍干存活率92.14％，凍干保護效果很好；本發(fā)明得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質的標準值為1.09×10¹⁰CFU/mL，符合人員防護裝備防護性能評價工作的要求。

以下各實驗所用粘質沙雷氏菌標準物質樣品為按實施例1方法制備。

實施例2標準物質的均勻性檢驗

一、實驗方法

1.均勻性檢驗方法

根據(jù)單元樣品抽取原則，抽取單元數(shù)以及每個樣品的重復測量次數(shù)應適合所采用的統(tǒng)計檢驗要求?？傮w單元數(shù)為N<200時，抽取單元數(shù)不少于11個；當200＜N<500時，抽取單元數(shù)不少于15個；當500＜N<1000時，抽取單元數(shù)不少于30個；當總體單元數(shù)N＞1000時，按來計算出抽取樣品數(shù)。對于均勻性好的樣品，當N＜500時，抽取單元數(shù)可不少于10個；當N＞500時，抽取單元數(shù)可不少于15個^[18,19]。因此，從200瓶粘質沙雷氏菌標準物質樣品中隨機抽取15瓶，每瓶樣品中加入2mL磷酸鹽緩沖液復水后，采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法按照實施例1中的步驟9中的操作進行檢驗，每瓶樣品重復檢測3次。最后，將計算結果通過F檢驗法進行均勻性檢驗。

2.均勻性分析方法

為檢驗樣品均勻性，設抽取了m個樣品，采用經(jīng)驗證的營養(yǎng)瓊脂平板涂布法按照3.1，在相同條件下得m組測量數(shù)據(jù)如下：

1.平均值

2.平均值

…………

平均值

設

則組間差方和

組內差方和

記ν₁＝m-1(組間自由度)

ν₂＝N-m(組內自由度)

作統(tǒng)計量F；

由此可見，該統(tǒng)計量是自由度(ν₁,ν₂)的F分布變量。

根據(jù)自由度(ν₁,ν₂)及給定的顯著性水平α，可由F表查得臨界的F_α值。若F<F_α,則認為組內與組間無明顯差異，樣品是均勻的，若F≥F_α,則懷疑各組間有系統(tǒng)差異，即樣品之間存在差異，若記這個差異的標準偏差為S_bb，則有

若各n_i均相同均為n時，則上式變成：

如果此時均勻性產(chǎn)生的標準偏差可按下式計算：

二、實驗結果

采用方差分析法對人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質進行均勻性檢驗，根據(jù)自由度為(v_l＝14，v₂＝30)及給定的顯著性水平α＝0.05，可由表查得的F_臨界值為2.04，經(jīng)過公式計算得F值＝1.76<F_查表值，組內與組間無明顯差異，因此樣品是均勻的瓶間標準偏差S_bb為0.05×10¹⁰CFU/mL(詳見表3)。

表3標準物質均勻性檢驗結果(m＝15，n＝3)

以上實驗證明，本發(fā)明得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質的均勻性良好。實施例3標準物質的穩(wěn)定性考察

一、實驗方法

1.短期穩(wěn)定性考察方法

短期穩(wěn)定性考察，主要涉及標準物質在運輸過程中的穩(wěn)定性，因此對標準物質在不同溫度下進行短期穩(wěn)定性統(tǒng)計評估。短期穩(wěn)定性考察選取不同溫度(-20℃、4℃，25℃和37℃)，不同時間點(0，7，14，21和28天)，采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進行測試，每次隨機選取3瓶樣品，每瓶重復測3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質短期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)。根據(jù)人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質在不同溫度下其活菌濃度隨時間的變化來描繪出活菌濃度Y與時間X的關系，擬合成一條直線。

2.長期穩(wěn)定性考察方法

將實施例1中制備得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質儲存在-20℃下，分別在0、1、2、3、4、5、6個月時每次隨機抽取3個單元的標準物質，采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進行測試，每個單元標準物質重復測3次(N＝3，n＝3)，取平均值得出粘質沙雷氏菌標準物質長期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)，描繪出特性活菌濃度Y與時間X的關系，擬合成一條直線。

3.穩(wěn)定性考察分析方法

通過如下公式計算斜率b₁及其不確定度s(b₁)：

式中，為時間平均值；為穩(wěn)定性檢驗時測定數(shù)據(jù)的平均值；b₀為擬合直線的截距。通過查表得置信水平0.95的t分布因子，同計算斜率b₁不確定度s(b₁)相乘后與斜率b₁的絕對值比較，若|b₁|<t_0.95,n-2·s(b₁)則表明斜率是不顯著的，標準物質樣品穩(wěn)定性良好。

二、實驗結果

1.短期穩(wěn)定性考察結果

采用穩(wěn)定性考察分析方法中的公式分析標準物質在不同溫度(-20℃、4℃，25℃和37℃)和不同時間點(0，7，14，21和28天)的短期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)(表4)，結果顯示(見圖2)：當標準物質在-20℃保存時，通過公式計算斜率b₁值為-25714285，t_0.95,n-2·s(b₁)值為70181874，可得|b₁|<t_0.95,n-2·s(b₁)，所以粘質沙雷氏菌標準物質在-20℃溫度下，可以穩(wěn)定保存28天；而在4℃溫度下，可以穩(wěn)定保存14天；在25℃和37℃溫度下，標準物質不穩(wěn)定。

表4標準物質的短期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)

2.長期穩(wěn)定性考察結果

采用穩(wěn)定性考察分析方法中的公式分析標準物質在-20℃下，儲存0、1、2、3、4、5、6個月的長期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)(表5)，結果顯示(見圖3)：當標準物質在-20℃儲存時，通過公式計算斜率b₁值為-120000000，t_0.95,n-2·s(b₁)值為136191630，可得|b₁|<t_0.95,n-2·s(b₁)，所以粘質沙雷氏菌標準物質長期穩(wěn)定性考察結果顯示：粘質沙雷氏菌標準物質在-20℃下可以穩(wěn)定保存6個月。

表5標準物質的長期穩(wěn)定性考察實驗數(shù)據(jù)

以上實驗證明，本發(fā)明得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質，在4℃下，可儲存14天，便于運輸；在-20℃下，可儲存6個月以上，具有優(yōu)異的長期穩(wěn)定性。

實施例4標準物質的不確定度評定

一、實驗方法

標準物質的總不確定度由4部分組成。第1部分是通過定值數(shù)據(jù)的標準偏差、測試次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計學方法計算出A類相對標準不確定度u_rel(A)；第2部分是定值過程中B類相對標準不確定度u_rel(B)，它的主要來源包括：移液器帶來的不確定度、樣品稀釋因子帶來的不確定度；第3部分是標準物質均勻性引入的相對標準不確定度u_rel(bb)；第3部分是標準物質的穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度u_rel(s)。將這4部分相對標準不確定度合成后計算得到標準值的合成不確定度u_C和擴展不確定度U＝ku_C(k＝2，置信概率95％)。

1.A類相對標準不確定度評定u_rel(A)

將隨機抽取的9個單元的標準物質分別采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進行測試，每個單元標準物質重復3次，將3次重復測試結果取平均值得出每個單元標準物質的實驗數(shù)據(jù)按如下貝塞爾公式計算出標準偏差再通過公式計算得出A類相對標準不確定度u_rel(A)。

式中，u_A為A類標準不確定度；為平均值的標準偏差；為平均值；X_i為每個單元標準物質測量結果的平均值；m為測量的標準物質數(shù)量。

式中，u_rel(A)為A類相對標準不確定度；u_A為A類標準不確定度；為平均值。

2.B類相對標準不確定度u_rel(B)

由營養(yǎng)瓊脂平板涂布法結果計算公式②以及對測量過程的分析，B類相對標準不確定度主要來源包括：a)移液器帶來的相對標準不確定度u_rel(v)，通過查詢證書獲得；b)樣品稀釋因子帶來的相對標準不確定度u_rel(d)。樣品稀釋是由1mL菌液加入9mL無菌磷酸鹽緩沖液進行稀釋，因此設菌液體積為a，稀釋液體積為b，1mL移液器的相對標準不確定度通過查詢證書獲得u_rel(a)，9mL移液器的相對標準不確定度通過查詢證書獲得u_rel(b)，u_b＝u_rel(b)*b，稀釋倍數(shù)k。按照公式如下計算得到為u_rel(d)。

式中，u_rel(d)為樣品稀釋因子的相對標準不確定度；k為稀釋倍數(shù)；a為菌液體積(1mL)；b為稀釋液體積(9mL)；u_b為稀釋液體積的標準不確定度；u_rel(a)為菌液體積的相對標準不確定度。

再通過如下公式計算合成B類相對標準不確定度u_rel(B)。

3.均勻性引入的相對標準不確定度評定u_rel(bb)

均勻性引入的標準不確定度u_bb是將實施例2中的均勻性檢驗數(shù)據(jù)通過如下公式計算標準偏差為S_bb獲得。

組間差方和

組內差方和

記ν₁＝m-1(組間自由度)

ν₂＝N-m(組內自由度)

(1)如果則均勻性的標準偏差S_bb和標準不確定度u_bb按如下公式計算：

(2)如果則均勻性的標準偏差S_bb和標準不確定度u_bb按如下公式計算：

均勻性引入的相對標準不確定度u_rel(bb)按如下公式計算：

式中，為平均值。

4.穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度評定u_rel(s)

將實施例3中的長期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)通過在不同溫度下其活菌濃度隨時間的變化來描繪出活菌濃度Y與時間X的關系，擬合成一條直線，通過如下公式計算斜率b₁不確定度s(b₁)，再通過如下公式計算穩(wěn)定性的標準偏差S_s和穩(wěn)定性的標準不確定度u_s。

u_s＝S_s＝s(b₁)·t

式中，t為給定的保存期限。

式中，為平均值。

5.合成相對標準不確定度u_rel(c)和擴展不確定度U

將A類相對標準不確定度u_rel(A)、B類相對標準不確定度u_rel(B)、均勻性引入的相對標準不確定度u_rel(bb)和穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度u_rel(s)，按照如下公式合成得出標準物質的合成相對標準不確定度u_rel(c)和擴展不確定度U。

合成相對標準不確定度u_rel(c)為：

擴展不確定度U為：

(k＝2，置信概率95％)

式中，為標準物質的標準值。

二、實驗結果

1.A類相對標準不確定度評定u_rel(A)評定結果

將隨機抽取的9個單元的標準物質分別采用營養(yǎng)瓊脂平板涂布法進行測試，每個單元標準物質重復3次，將3次重復測試結果取平均值得出每個單元標準物質的實驗數(shù)據(jù)按貝塞爾公式計算出標準偏差為6.7×10⁸CFU/mL，再通過公式計算得出A類相對標準不確定度u_rel(A)為2.05％，結果見表6。

表6標準物質A類相對標準不確定度評定結果(m＝9)

2.B類相對標準不確定度u_rel(B)評定結果

B類相對標準不確定度主要來源包括：

(1)移液器帶來的相對標準不確定度u_rel(v)，查詢證書得1％(k＝2)，u_rel(v)＝u_v/k＝1％/2＝0.5％；

(2)樣品稀釋因子帶來的相對標準不確定度u_rel(d)。樣品稀釋是由1mL菌液加入9mL無菌磷酸鹽緩沖液進行稀釋，因此設菌液體積為a，稀釋液體積為b，1mL移液器的相對標準不確定度查證書U_rel(a)為1％(k＝2)，u_rel(a)＝1％/2＝0.5％；9mL移液器的的相對標準不確定度查證書U_rel(b)為1％(k＝2)，u_rel(b)＝1％/2＝0.5％，u_b＝u_rel(b)*b＝0.5％*9mL＝0.045mL，稀釋液體積的標準不確定度實際檢測經(jīng)過是經(jīng)過8次稀釋，稀釋倍數(shù)k為8。按照公式計算得到為u_rel(d)為1.79％。

式中，u_rel(d)為樣品稀釋因子的相對標準不確定度；k為稀釋倍數(shù)；a為菌液體積(1mL)；b為稀釋液體積(9mL)；u_b為稀釋液體積的標準不確定度；u_rel(a)為菌液體積的相對標準不確定度。

按照公式如下公式合成B類相對標準不確定度為1.86％。

3.均勻性引入的相對標準不確定度u_rel(bb)評定結果

將實施例2中的均勻性檢驗數(shù)據(jù)通過公式計算標準偏差為S_bb為5.0×10⁸CFU/mL，均勻性引入的相對標準不確定度u_rel(bb)為4.59％，結果見表7。

表7標準物質均勻性引入的相對標準不確定度評定結果

4.穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度u_rel(s)評定結果

將實施例3中的長期穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)通過在不同溫度下其活菌濃度隨時間的變化來描繪出活菌濃度Y與時間X的關系，擬合成一條直線，通過公式計算斜率b₁不確定度s(b₁)，再通過公式計算穩(wěn)定性的標準偏差S_s為3.0×10⁸CFU/mL和穩(wěn)定性的標準不確定度u_s為2.75％，結果見表8。

表8標準物質穩(wěn)定性引入的相對標準不確定度評定結果

5.合成相對標準不確定度u_rel(c)和擴展不確定度U評定結果

將A類相對標準不確定度、B類相對標準不確定度、均勻性引起的相對標準不確定度和穩(wěn)定性引起的相對標準不確定度按照公式合成得出標準物質的合成相對標準不確定度為6.02％，再按照公式計算得擴展不確定度為0.14×10¹⁰CFU/mL(k＝2)，結果見表9。

合成標準不確定度u_rel(c)為：

擴展不確定度U為：

(k＝2，置信概率95％)

表9標準物質不確定度評定結果

以上實驗證明，本發(fā)明得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質定值結果的不確定度來源包括：A類標準不確定度、B類標準不確定度、均勻性引起的標準不確定度和穩(wěn)定性引起的標準不確定度。標準物質的擴展不確定度為0.14×10¹⁰CFU/mL(k＝2)。

通過實施例1-4的實驗證明，本發(fā)明得到的人員防護裝備防護性能評價用細菌標準物質分裝在棕色西林瓶中，呈餅狀或球狀，1個/瓶；當使用時，吸取2mL復水的水溶液加入棕色西林瓶中復溶標準物質，其標準值為：(1.09±0.14)×10¹⁰CFU/mL，符合人員防護裝備防護性能評價工作的要求；該標準物質均勻性良好；在4℃下，可儲存14天，便于運輸；在-20℃下，可儲存6個月以上，具有優(yōu)異的長期穩(wěn)定性。