本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，特別涉及應用于分子測序技術中的一種從楊樹木材(分為濕心材和健康邊材)中提取微生物基因組DNA的方法。

背景技術：

楊樹是我國重要的速生用材樹種之一。第七次全國森林資源清查數(shù)據(jù)顯示，我國楊樹林總面積已達1010.26萬hm²，其中人工林為757.23萬hm²，占全國人工喬木林總面積的18.9％，栽培面積居世界首位。但濕心材現(xiàn)象發(fā)生十分嚴重，給楊木加工利用帶來不利影響。據(jù)在湖北省嘉魚縣的調查，9個楊樹品種的病株率都達100％，胸徑處變色直徑占胸徑的31.38％～64.35％，變色面積達5.49％～42.31％，成年大樹變色比率可達50％以上。濕心材(Wetwood)是一種世界性病害，其典型病狀是活立木髓心及中央木質部呈水浸狀，木材呈現(xiàn)褐色至紅褐色，是樹木生長中的一種反?，F(xiàn)象。濕心材表現(xiàn)出含水率高、顏色深、抽提物多以及pH值偏酸或偏堿性，木材物理與化學性質(例如木材密度、弦向干縮系數(shù)、抗彎強度、抗彎彈性模量、離子含量等)發(fā)生變化等特點。由于濕心材干燥時易皺縮、開裂，刨削難，木材變色，且呈堿性的濕心材很難用脲醛樹脂膠合，直接影響干燥、制材和膠合板質量，導致商品價值大幅下降。作為紙漿材時，還直接影響出漿率與印刷光澤度。因此，濕心材是木材加工利用中的一大難題，造成巨大的經濟損失，但目前生產上缺乏有效的防治措施。

病原微生物在濕心材的形成過程中起著非常重要的作用，這是目前被普遍接受的一種觀點。然而，這些病原微生物包括哪些種類，哪些微生物在其中起主導作用目前還不清楚。長期以來，由于研究手段的制約導致楊樹濕心材研究進展相對緩慢。以往的研究幾乎都是采用傳統(tǒng)的組織分離培養(yǎng)法分離病原菌，而該方法本身存在一定不足。例如，濕心材中的氣體以CH₄、N₂、CO₂等為主，不含O₂或極少O₂，所以濕心材中主要應為兼性或專性厭氧微生物；分離和培養(yǎng)專性厭氧菌的方法不同于分離培養(yǎng)需氧菌、兼厭氧性菌及真菌的方法；有許多微生物的生長條件是不確定的，易受到培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件選擇性的限制，而且菌株之間存在相互競爭，部分微生物是存活的但不可培養(yǎng)，因而通過組織培養(yǎng)法對微生物進行分離培養(yǎng)，進而鑒定就有較大的局限性。

目前并沒有從木材中直接提取微生物基因組DNA的方法?，F(xiàn)有的提取微生物基因組DNA的樣品主要包括土壤樣品、植物組織樣品、可培養(yǎng)的微生物樣品等，方法主要有試劑盒法、酶解法、化學或者熱裂解法、磁珠或超聲波機械破壁，又或者是上述幾種方法的結合。采用這些方法提取木材中微生物的基因組DNA，得到的DNA均濃度很低，且大多污染嚴重，不能滿足后期采用16S rDNA/ITS測序及宏基因組(Metagenomics)測序的要求。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種從楊樹木材(分為濕心材和健康邊材)中提取微生物基因組DNA的方法，以滿足16S rDNA/ITS測序及宏基因組(Metagenomics)測序等分子測序技術對于基因組DNA的高質量要求。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，發(fā)明人通過大量試驗研究并不懈探索，最終獲得了如下技術方案：一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，該方法包含下述步驟：

(1)收集楊樹濕心材或健康邊材樣本，經液氮研磨后加入活性炭及提取緩沖液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉，混勻；所述的提取緩沖液包含下列組分：1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸鈉緩沖液pH8.0，蛋白酶K濃度為20mg/ml，十二烷基硫酸鈉的質量濃度為10％；

(2)放入58～62℃水浴1.5～3h，期間顛倒混勻3～4次，然后進行第一次離心，轉移第一次離心后的上層水相；

(3)向所述第一次離心后的水相中加入PEG6000，混勻靜置后進行第二次離心，去掉第二次離心后的上層水相；

(4)向所述第二次離心后的沉淀中加入TE和醋酸鉀，混勻靜置后進行第三次離心，轉移第三次離心后的上層水相；

(5)向所述第三次離心后的水相中加入等體積的苯酚-氯仿-異戊醇溶液，混勻靜置后進行第四次離心，轉移第四次離心后的上層水相；苯酚-氯仿-異戊醇溶液中苯酚、氯仿和異戊醇的體積比為25：24：1；

(6)向所述第四次離心后的上層水相中加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，混勻室溫靜置0.5-1.5h后進行第五次離心，收集沉淀；

(7)向所述第五次離心后收集到的沉淀先后采用75％酒精、無水酒精洗滌，然后進行第六次離心得到DNA沉淀，使用TE溶解DNA沉淀，再加入RNase A，水浴后得到所提取的微生物基因組DNA。

需要說明的是，步驟(3)中采用PEG6000在不同的鹽溶液中可以結合形成孔徑不同的網(wǎng)狀結構，DNA和其他雜質分子在PEG6000中的沉降系數(shù)不同的原理，通過高速離心，使沉降系數(shù)較高的DNA沉淀下來，而其他雜質分子被網(wǎng)狀結構阻隔，從而純化DNA。步驟(5)中苯酚使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用；氯仿可加速有機相與液相的分層。在抽提DNA的過程中，為了混合均勻，通常進行劇烈震蕩，此時會在混合液內產生大量氣泡，而異戊醇的作用是降低分子表面張力，因而能在提取過程中減少氣泡的產生。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(2)中所述的第一次離心是在12000rpm、4℃下進行，離心時間為15～25min。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(3)中向所述第一次離心后的水相中加入1/2體積的PEG6000。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(3)中第二次離心是在12000rpm、4℃下進行，離心時間為4～6min。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(4)中TE緩沖液包含下列組份：10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸，醋酸鉀的濃度為5M。鉀離子置換SDS的鈉離子，形成不溶于水的PDS，將大量蛋白同步沉淀下來。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(4)中第三次離心和步驟(5)中第四次離心均是在12000rpm、4℃下進行，離心時間為12～18min。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(6)中第五次離心和步驟(7)中第六次離心是在10000rpm、4℃下進行，離心時間為8～12min。

優(yōu)選地，如上所述的一種從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法，其中步驟(7)中是在37℃下水浴，時間為10～20min。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明涉及的從楊樹木材中提取微生物基因組DNA的方法具有如下優(yōu)點和進步性：

(1)將CTAB法和SDS法進行了結合，優(yōu)點在于先使用提取緩沖液來裂解微生物細胞壁，再用活性炭來吸附多糖多酚類物質，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使糖類酚類物質容易去除。

(2)在將CTAB法和SDS法進行了結合的過程中，最大程度地裂解微生物細胞壁，釋放核酸并且最低程度地減少對基因組DNA的降解和破壞，避免了DNA總量的損耗。對微生物細胞壁的裂解完全、對菌種類型沒有特異性要求，使得本方法提取得到的基因組DNA具有濃度高、無污染的優(yōu)點，用分光光度計測定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于標準值，完全能滿足后期采用16S rDNA/ITS測序及宏基因組測序(Metagenomics)的要求。

(3)適用于樣本菌體為所有微生物種類的楊樹木材。一般來說，革蘭氏陽性菌或真菌較難破壁，革蘭氏陰性菌的細胞壁厚約2～3nm，而革蘭氏陽性菌細胞壁厚約20～80nm，真菌的細胞壁厚度高達100～250nm，因此革蘭氏陽性菌和真菌的基因組提取在困難程度上較高，而本發(fā)明所提供的基因組DNA的提取方法，由于結合了SDS和CTAB法的優(yōu)點，增大了提取過程中對細菌細胞壁的裂解能力和裂解程度，可成功地對革蘭氏陽性菌或真菌完成基因組DNA提取，并獲得高濃度、高質量的基因組。

(4)本發(fā)明有助于避開楊樹濕心材研究中微生物的組織分離培養(yǎng)與鑒定，通過直接提取木材樣品中微生物的基因組DNA，采用16S rDNA/ITS測序及宏基因組(Metagenomics)測序等分子測序技術開展研究。

附圖說明

圖1為實施例1和對比試驗例1～例7提取到的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳的結果圖。其中，M為λ/HindIII DNA Marker(23Kb)，泳道號中“1”指實施例1，“2”～“8”指對比例1～例7，“-1”、“-2”、“-3”指三個重復；(a)濕心材樣品；(b)健康邊材樣品。

圖2為實施例1和對比試驗例1～例7提取到的基因組DNA經PCR后進行瓊脂糖凝膠電泳的結果圖。其中，M為Marker1(600bp)，泳道號中“1”指實施例1，“2”～“8”指對比例1～例7，“-1”、“-2”、“-3”指三個重復，H₂O為陰性對照；(a)濕心材樣品中微生物DNA的16S V3-V4區(qū)；(b)健康邊材樣品中微生物DNA的16S V3-V4區(qū)；(c)濕心材樣品中微生物DNA的16S V4區(qū)；(d)健康邊材樣品中微生物DNA的16S V4區(qū)；(e)濕心材樣品中微生物DNA的16S V4-V5區(qū)；(f)健康邊材樣品中微生物DNA的16S V4-V5區(qū)；(g)濕心材樣品中微生物DNA的ITS1區(qū)；(h)健康邊材樣品中微生物DNA的ITS1區(qū)；(i)濕心材樣品中微生物DNA的ITS2區(qū)；(j)健康邊材樣品中微生物DNA的ITS2區(qū)。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結合附圖對本發(fā)明的各實施方式進行詳細的闡述。然而，本領域的普通技術人員可以理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術細節(jié)。但是，即使沒有這些技術細節(jié)和基于以下各實施方式的種種變化和修改，也可以實現(xiàn)本申請各權利要求所要求保護的技術方案。

實施例1

以下采用本發(fā)明所提供的方法分別對楊樹濕心材、健康邊材樣品提取微生物基因組DNA，每個處理3次重復。

實驗操作：

1.提取緩沖液、TE緩沖液的制備：

提取緩沖液：1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸鈉緩沖液pH8.0，高壓滅菌。

TE緩沖液：10mM Tris-HCl和1mM EDTA。

2.提取步驟

(1)用液氮研磨樣品。

(2)取1g研磨后的濕心材或健康邊材樣品，加入0.6g活性炭，加入5mL提取緩沖液(1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸鈉緩沖液pH8.0)，加入75μL蛋白酶K(20mg/ml)，渦旋混勻，加入1000μL SDS(10％)，渦旋混勻。

(3)放入60℃水浴2小時，期間顛倒混勻3～4次。

(4)離心(12000rpm，20min，4℃)。

(5)取上清液于新的10ml離心管中，加入1/2體積PEG6000，室溫放置1小時。

(6)離心(12000rpm，5min，4℃)。

(7)去上清，向沉淀中加入1ml TE(pH8.0)，再加入100μL醋酸鉀(5M)，在4℃下放置15min。

(8)離心(10000rpm，15min，4℃)。

(9)取上清至新的2ml管中，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇25：24：1，顛倒混勻靜置10min。

(10)離心(12000rpm，10min，4℃)

(11)取上清至新的1.5ml管中，加入0.7倍體積的異丙醇，室溫靜置1小時。

(12)離心(10000rmp，10min，4℃)。

(13)去上清，向沉淀中加入1ml 75％酒精，放置1min，離心(10000rpm，10min，4℃)。

(14)去上清，向沉淀中加入1ml無水酒精，放置10min,離心(10000rpm，10min，4℃)。

(15)去上清，待酒精完全揮發(fā)后，加入50μLTE溶解DNA，再加入2μL RNaseA(10mg/ml)。

(16)在37℃下水浴15min。

(17)置于-20℃保存。

表1本發(fā)明方法提取結果

以下采用的對比試驗方法均為對楊樹濕心材及健康邊材部位的樣品分別提取微生物基因組DNA，每個處理3次重復，除對比試驗例1外(嚴格按照試劑盒說明操作)，樣品量均為1g，最后均用50μL TE溶解DNA。

對比試驗例1：Power of soil kit試劑盒法

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.加入0.25g樣品到一個PowerBead Tubes中。

3.輕輕渦旋混勻。

4.檢測Solution C1。若出現(xiàn)沉淀，60℃水浴至全溶解。

5.加入60μl Solution C1，上下顛倒數(shù)次混勻。

6.把PowerBead Tubes固定在渦旋儀適配器上，最大轉速(3200rpm，若渦旋儀達不到此速度，可適當延長5～10min)渦旋連續(xù)振蕩10min(使用24頭適配器同時處理12個樣品，渦旋時間延長5-10min)。

7.室溫10000g離心30s。

8.轉移上清液至一個干凈的2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。注意：大約可獲得400-500μl上清液。

9.加入250μl Solution C2到上清中，渦旋混勻5s。4℃孵育5min。

10.室溫10000g離心1min。

11.避開沉淀小珠，轉移上清液≤600μl到一個新的收集管中。

12.加入200μl Solution C3到上清中，渦旋混勻，4℃孵育5min。

13.室溫10000g離心1min。

14.避開沉淀小珠，轉移上清液≤750μl到一個新的收集管中。

15.Solution C4使用前先搖勻。加入1200μl Solution C4到上清中，渦旋混勻5s。

16.加載約675μl上清到Spin Filter中，室溫10000g離心1min。棄去濾液，繼續(xù)加載675μl上清，室溫10000g離心1min。重復直至過濾完所有上清。注意：每個樣品共需加載3次。

17.加入500μl Solution C5到Spin Filter中，室溫10000g離心30s。

18.棄去上清。

19.室溫10000g離心1min。

20.小心轉移Spin filter到2ml Collection Tube(試劑盒提供)中，盡量避免Solution C5污染。注意：極力避免酒精沖洗液污染。

21.加入100μl Solution C6到白色濾膜中心。注意：Solution C6要加到濾膜中心，并保證整個薄膜能充分潤濕?？蛇x：無菌DNA-Free PCR Grade water貨號#17000-10也可適用于DNA洗脫。若擔心DNA降解，可使用無菌TE緩沖液代替C6進行洗脫。

22.室溫10000g離心30s。

23.棄去Spin Filter。此時收集管中的DNA可直接用于下游實驗，無需進一步純化建議DNA冷凍保存(-20℃～-80℃)。

對比試驗例2：提取土壤微生物DNA方法1

方法來自于文獻：Verma D,Satyanarayana T.An improved protocol for DNA extraction from alkaline soil and sediment samples for constructing metagenomic libraries[J].Applied biochemistry and biotechnology,2011,165(2):454-464.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.取1g研磨后的樣品，加入0.4g活性炭，加入2mL提取緩沖液(1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE PH8.0+0.1M磷酸鈉緩沖液pH8.0)，加入100μL RNA酶，加入20μL蛋白酶K(10mg/ml)渦旋混勻，放在37℃的搖床上溫浴15min(200rpm)。

3.加入200μL SDS(10％)，渦旋混勻。放入60℃水浴2小時，期間顛倒混勻3～4次。

4.離心(12000rpm，20min，4℃)。

5.取上清液于新的10ml離心管中，加入1mL PEG8000，室溫放置1小時。

6.離心(8000g，5min，4℃)。

7.去上清，向沉淀中加入1ml TE(pH8.0)，再加入100μL醋酸鉀(5M)，在4℃下放置15min。

8.離心(8000g，15min，4℃)。

9.取上清至新的2ml管中，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)。

10.離心(8000g，15min，4℃)。

11.取上清至新的1.5ml管中，加入0.7倍體積的異丙醇，室溫靜置1小時。

12.離心(8000g，20min，4℃)。

13.去上清液，向沉淀中加入1ml 70％酒精，放置1min，離心(8000g，10min，4℃)去上清液，待酒精完全揮發(fā)后，加入50μLTE溶解DNA，再加入2μL RNaseA(10mg/ml)。

14.置于-20℃保存。

對比試驗例3：提取土壤微生物DNA方法2

方法來自于文獻：Tsai Y L,Olson B H.Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments[J].Applied and Environmental Microbiology,1991,57(4):1070-1074.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.取1g樣品加入2mL120mM磷酸鈉緩沖液(pH 8)，在搖床上搖15min(150rpm)。

3.離心(6000g，10min)。

4.去上清液，重復步驟2-3。

5.在樣品中加入2mL裂解液〔0.15M NaCl,0.1MNa2EDTA(PH8)〕，15mg/mL溶菌酶，37℃水浴2小時，每30分鐘顛倒混勻。

6.離心，取上清，加入2mL 0.1M NaCl-0.5M Tris-HCl(pH8)-10％SDS，放在-70℃的干冰上冷凍，放在65℃的水浴鍋里融化，凍融重復3次。

7.加入2mL 0.1M Tris-HCl(pH8)-飽和苯酚，顛倒混勻，離心(6000g，10min)。

8.收集3mL的上清液，加入1.5mL的苯酚和1.5mL氯仿混合液(氯仿：異戊醇＝24：1)。

9.將2.5mL萃取的上清液再用相同體積的氯仿混合液萃取。

10.最后將萃取液用2mL的冰異丙醇沉淀，放在-20℃1小時或者一夜。

11.離心(10000g，10min)，DNA在23℃下干燥。

12.加入50μL TE溶解DNA，加入RNA酶(終濃度0.2ug/μL)，37℃水浴2小時。

13.將DNA置于-20℃保存。

對比試驗例4：提取木材DNA方法

方法來自于文獻：Verbylaite R,Beisys P,Rimas V,Kuusiene S.Comparison of ten DNA extraction protocols from wood of european aspen(PopμLus tremμLa L.)[J].Baltic Forestry,2010,16(1):35-42.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.加熱提取緩沖液到60℃。

3.取1g樣品加入5mL提取緩沖液，混合均勻。

4.60℃水浴30～120min，期間顛倒混勻數(shù)次。

5.用5mL氯仿：異戊醇＝1：1混合液萃取，離心(12000g，30s，20～25℃)。

6.取上層清液到新的離心管中，加入0.5倍體積的5M NaCl，加入40％體積冰的異丙醇，混合均勻，沉淀核酸。如果沒有看見明顯的沉淀，可在-20℃放置20min或者更久。

7.離心(12000g，1min，20～25℃)。如果看不見沉淀，可在冰上放置20min再離心，最壞的情況下，離心(12000g，10min)。

8.盡可能倒掉上清液，加入0.5～1mL的清洗緩沖液(76％乙醇，10mM醋酸銨)，輕輕渦旋，放置15～20min。一般來說，核酸會在這一步變得更純凈。

9.離心(12000g，1min，20～25℃)。如果還不充分，就離心更久時間，倒掉緩沖液，放置2-4min，干燥核酸。

10.將DNA溶于50μLTE。

11.置于-20℃保存。

對比試驗例5：提取植物組織中微生物DNA方法

方法來自于文獻：Maropola M K,Ramond J B,Trindade M.Impact of metagenomic DNA extraction procedures on the identifiable endophytic bacterial diversity in Sorghum bicolor(L.Moench)[J].Journal of microbiological methods,2015,112:104-117.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.取1g樣品，加入5mL溶菌酶緩沖液(25mM Ttis-HCl,50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mg/mL溶菌酶)，RNA酶(終濃度50ug/mL)，渦旋混勻20s。

3.37℃水浴1小時，加入蛋白酶K(終濃度1mg/mL)，再水浴1小時。

4.加入SDS(終濃度1％)，顛倒混勻10次。

5.將混合物在65℃水浴30min，離心(14000rcf，2min)。

6.取上清，加入等體積苯酚，離心(10000rcf，1min)。

7.取上層清液，再用苯酚萃取一次。

8.加入等體積氯仿：異戊醇＝24：1，離心(10000rcf，10min)。

9.將離心管放在冰上，加入等體積冰的異丙醇，在4℃條件下放置20min，離心(10000rcf，5min)，倒掉液體。

10.將DNA沉淀放在通風櫥干燥。

11.用250μL70％的乙醇洗滌，離心(10000rcf，5min)，洗滌2次。

12.用50μL TE溶解DNA。

13.將DNA置于-20℃保持。

對比試驗例6提取培養(yǎng)的細菌DNA方法

方法來自于文獻：Pindi P K,Srinath R R,Shanker A S.Novel approaches of genomic DNA isolation for identification of cμLtivable bacteria[J].Jundishapur Journal of Microbiology,2013,6(10):e8339.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.取1g樣品，加入5mL提取緩沖液(90％乙醇，30％過氧化氫，苯酚)，在37℃溫育10小時。

3.將上清液轉移到新的離心管中，離心(12000rpm，10min)，去上清液，沉淀中含有高分子量的DNA。

4.用50μLTE溶解DNA，保存在-20℃。

對比試驗例7提取培養(yǎng)的真菌DNA方法

方法來自于文獻：Mot’kováP,Vytrasova J.Comparison of methods for isolating fungal DNA[J].Czech Journal of Food Sciences,2011,29:S76-S85.

1.用液氮研磨楊樹濕心材、健康邊材樣品(與實施例1樣品同一批次)。

2.取1g樣品，加入5mLTE緩沖液，離心(16500g，5min)。

3.去上清，加入5mL提取液(200mM Tris-HCl pH8.5，250mM EDTA，0.5％SDS)，再加入150μL醋酸鈉(3M，pH5.2)，將離心管在-80℃放置10min，解凍之后離心(16500g，5min)。

4.將上清液轉移到新的離心管中，加入等體積異丙醇，室溫放置5min，離心(16500g，15min)。

5.去上清，加入300μL70％乙醇洗滌DNA沉淀，離心(16500g，15min)。

6.去上清，將DNA放在100℃處干燥。

7.加入500μLTE溶解DNA。

8.置于-20℃保存。

測定各試驗例制備的微生物基因組DNA濃度，同時用分光光度計測定OD260/OD230、OD260/OD280值。

表2各試驗例提取的DNA濃度和純度(vol：50μL)(3個樣品的平均值±標準誤)

將本發(fā)明實施例1與對比例1～例7提取方法所得的基因組DNA在0.8％的瓊脂糖凝膠電泳下檢測其完整度，樣本上樣量均為8μL，M(λ/HindIII DNA Marker)上樣量為5μL。結果顯示，本發(fā)明方法所得DNA經瓊脂糖凝膠電泳，得到明顯的DNA條帶(見圖1)。

將本發(fā)明實施例1與對比例1～例7提取方法所得的樣品微生物DNA溶液通過表3的5對引物(細菌、真菌)進行P CR擴增來檢測所提DNA的質量，樣本上樣量均為10μL，M(Marker 1)上樣量為5μL。結果顯示，本發(fā)明方法所得DNA經5對引物擴增后，分別得到與目的片段大小完全一致的DNA條帶，而對比例1-例7只能部分得到或者得不到與目的片段大小完全一致的DNA條帶(見圖2)。這說明本發(fā)明方法所提取的DNA可直接應用于分子操作。

表3用于PCR擴增的引物序列