本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過瞬時(shí)表達(dá)對植物基因進(jìn)行定點(diǎn)插入的方法及獲得的瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞、組織和突變植株。
背景技術(shù)：
：：基因組定點(diǎn)修飾工具主要包括三大類型序列特異性核酸酶：鋅指核酸酶(Zincfingernuclease,ZFN)、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(Transcriptionactivator-likeeffectornuclease,TALEN)和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)系統(tǒng)(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats/CRISPRassociated,CRISPR/Cas9system)。它們的共同特征是能夠作為核酸內(nèi)切酶切割特定的基因組DNA序列，產(chǎn)生基因組DNA雙鏈斷裂(Double-strandbreak,DSB)。如果在產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂的同時(shí)人為提供一段DNA序列(供體DNA)，該供體DNA序列可以定向的插入基因組DNA雙鏈斷裂處，從而產(chǎn)生供體DNA的定點(diǎn)插入。瞬時(shí)表達(dá)體系是指利用農(nóng)桿菌、基因槍、PEG等誘導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化等方法將外源基因(序列特異性核酸酶及供體DNA序列)轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，通過外源基因的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)現(xiàn)對植物基因組改造，由于瞬時(shí)表達(dá)后的細(xì)胞或組織在無選擇壓力的情況下進(jìn)行再生，可以提高植物的再生效率；同時(shí)，未整合到植物基因組上的外源基因會(huì)被植物細(xì)胞降解，這樣獲得的突變體植物具有較高的生物安全性。所以，通過瞬時(shí)表達(dá)體系更容易，更適合實(shí)現(xiàn)對植物基因組的改造，有利于基因編輯技術(shù)在植物上的有效利用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種通過瞬時(shí)表達(dá)對植物基因進(jìn)行定點(diǎn)插入的方法及獲得的瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞、組織和定點(diǎn)插入突變植株。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種通過瞬時(shí)表達(dá)對植物基因進(jìn)行定點(diǎn)插入的方法，包括如下步驟：以目的植物的細(xì)胞或組織為瞬時(shí)表達(dá)對象，在目的植物的細(xì)胞或組織中瞬時(shí)表達(dá)序列特異性核酸酶及一段供體DNA序列，在特異性核酸酶的作用下，目的基因被剪切并產(chǎn)生雙鏈斷裂，供體DNA序列插入到雙鏈斷裂處，完成對基因的定點(diǎn)插入。在所述目的植物的細(xì)胞或組織中瞬時(shí)表達(dá)序列特異性核酸酶及一段供體DNA序列包括如下步驟：向目的植物的細(xì)胞或組織中直接導(dǎo)入靶標(biāo)片段的核酸酶或?qū)胗糜诒磉_(dá)特異于靶標(biāo)片段的核酸酶的遺傳物質(zhì)，同時(shí)導(dǎo)入供體DNA序列。所述遺傳物質(zhì)為DNA質(zhì)粒、DNA線性片段或體外轉(zhuǎn)錄的RNA。所述序列特異性核酸酶為能實(shí)現(xiàn)基因組編輯的核酸酶，鋅指核酸酶ZFN、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶TALEN或CRISPR/Cas9核酸酶。所述供體DNA序列為單鏈DNA或雙鏈DNA。所述細(xì)胞為任何能作為瞬時(shí)表達(dá)受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的細(xì)胞；所述組織為任何能作為瞬時(shí)表達(dá)受體并能經(jīng)過組織培養(yǎng)再生為完整植株的組織。所述細(xì)胞為原生質(zhì)體細(xì)胞或懸浮細(xì)胞；所述組織為愈傷組織、幼胚、成熟胚、葉片、莖尖、幼穗或下胚軸。向所述目的植物的細(xì)胞或組織中導(dǎo)入序列特異性核酸酶及一段供體DNA序列方法為基因槍法、農(nóng)桿菌侵染法、PEG誘導(dǎo)原生質(zhì)體法、電極法、碳化硅纖維介導(dǎo)法或真空滲入法。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。上述方法獲得的瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞、瞬時(shí)表達(dá)組織和培養(yǎng)后得到的定點(diǎn)插入突變植株。本發(fā)明的有益效果是：可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因，消除隨機(jī)整合帶來的負(fù)效應(yīng)。可以實(shí)現(xiàn)基因疊加，將多個(gè)優(yōu)良性狀結(jié)合在一起。通過分子標(biāo)記的定點(diǎn)插入，可以標(biāo)記特定基因。通過基因調(diào)控元件的定點(diǎn)插入，可以調(diào)控特定基因的表達(dá)。附圖說明圖1為原生質(zhì)體中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥的內(nèi)源基因TaGW2的定點(diǎn)突變結(jié)果圖(a為電泳圖，b為回收a中未切開條帶測序結(jié)果)。圖2為基因槍法瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)及供體DNA序列(ssDNA-1)對小麥的內(nèi)源基因TaGW2的定點(diǎn)插入結(jié)果圖(a為電泳圖，b為回收a中條帶測序結(jié)果。圖3為基因槍法瞬時(shí)表達(dá)TALEN系統(tǒng)及供體DNA序列(ssDNA-2)對小麥的內(nèi)源基因TaMLO的定點(diǎn)插入結(jié)果圖(a為電泳圖，b為回收a中條帶測序結(jié)果)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。表達(dá)載體pTaU6-gRNA：在文獻(xiàn)“Shan,Q.etal.TargetedgenomemodificationofcropplantsusingaCRISPR-Cassystem.NatureBiotechnology31:686-688,(2013)”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。表達(dá)載體p163-Ubi-Cas9及小麥TaMLO基因靶向TALENs載體T-MLO：在文獻(xiàn)“Wang,Y.,Cheng,X.,Shan,Q.,Zhang,Y.,Liu,J.,Gao,C.,andQiu,J.L.(2014).Simultaneouseditingofthreehomoeoallelesinhexaploidbreadwheatconfersheritableresistancetopowderymildew.NatureBiotechnology.32,947–951”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。小麥品種“科農(nóng)199”在文獻(xiàn)“李俊明；張相岐；張愛民；王志國；安調(diào)過；紀(jì)軍；王靜.高產(chǎn)廣適小麥新品種—科農(nóng)199.麥類作物學(xué)報(bào).368-368(2007)”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。小麥品種“Bobwhite”在文獻(xiàn)“Souzaetal.Parentageanalysisofinternationalspringwheatyieldnurseries.CropSci.38:337–341，(1998)”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。實(shí)施例1、利用基因槍法瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9核酸酶及供體DNA序列獲得小麥內(nèi)源基因TaGW2的定點(diǎn)插入突變體一、靶標(biāo)片段target-C14的設(shè)計(jì)Target-C14：5’-CCTCTAGAAATACCCCATCCTG-3’；(GenbankNo.HQ404374所示的TaGW2基因中，第802-823位，SEQIDNO.1)二、含有C14核苷酸片段pTaU6-gRNA質(zhì)粒的制備C14是能與靶標(biāo)target-C14互補(bǔ)結(jié)合的RNA的編碼DNA。合成下述帶有粘性末端(下劃線部分)的單鏈引物：C14F：5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’SEQIDNO.2C14R：5’-AAACCTAGAAATACCCCATCCTG-3’SEQIDNO.3經(jīng)過引物退火程序形成有粘性末端的雙鏈DNA，插入到pTaU6-gRNA質(zhì)粒的兩個(gè)BbsI酶切位點(diǎn)之間，即得含有C14的pTaU6-gRNA質(zhì)粒，質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證陽性質(zhì)粒，即在pTaU6-gRNA質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)BbsI處正向插入5’-CTTGCAGGATGGGGTATTTCTAG-3’所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒為陽性，命名為pTaU6-gRNA-C14。三、將CRISPR/Cas9系統(tǒng)導(dǎo)入至小麥原生質(zhì)體將p163-Ubi-Cas9載體和步驟二獲得的pTaU6-gRNA-C14質(zhì)粒導(dǎo)入至小麥原生質(zhì)體，具體過程如下：1.小麥苗的種植小麥種子種于培養(yǎng)室，溫度25±2℃，光照度1000Lx，光照14～16h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間約1-2周。2.原生質(zhì)體分離1)取小麥幼嫩的葉片，用刀片將其中間部分切成0.5-1mm的絲，放入0.6M的甘露醇溶液(溶劑為水)中避光處理10分鐘，再用濾網(wǎng)過濾，將其放入50ml酶解液中消化5小時(shí)(先抽真空酶解0.5h，再10rmp緩慢搖晃4.5h)。注：酶解溫度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完輕輕搖晃酶解液，使原生質(zhì)體釋放出來。2)加10mlW5稀釋酶解產(chǎn)物，用75μm尼龍濾膜過濾酶解液于50ml圓底離心管中。注：尼龍濾膜要浸泡在75％(體積分?jǐn)?shù))酒精里，用時(shí)要用水沖洗，再用W5浸泡2min再過濾。3)23℃，100g，離心3min，棄上清。4)用10mlW5輕輕懸起，冰上放置30min；原生質(zhì)體逐漸沉降，棄上清。5)加適量MMG溶液懸浮，至于冰上，待轉(zhuǎn)化。注：此時(shí)需要確定原生質(zhì)體的濃度，鏡檢(×100)，原生質(zhì)體數(shù)為2×105/ml至1×106/ml。3.小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化1)加10μgp163-Ubi-Cas9載體和10μgpTaU6-gRNA-C14質(zhì)粒于2ml離心管，用槍頭吸取200μl步驟2獲得的原生質(zhì)體輕彈混勻，靜止3-5min，再加250μlPEG4000，輕彈混勻，避光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化30min；2)加900μlW5(室溫)顛倒混勻，100g，離心3min，棄上清；3)加1mlW5，顛倒混勻，輕輕轉(zhuǎn)至6孔板中，已預(yù)先加入1mlW5，23℃培養(yǎng)過夜。四、PCR/RE實(shí)驗(yàn)分析CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥內(nèi)源基因TaGW2的突變結(jié)果小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后48小時(shí)提取基因組DNA，以該DNA為模板，進(jìn)行PCR/RE(PolymeraseChainReaction/Restrictiondigestion)實(shí)驗(yàn)分析。同時(shí)設(shè)置野生型小麥的原生質(zhì)體作為對照。PCR/RE分析方法參考了文獻(xiàn)Shan,Q.etal.RapidandefficientgenemodificationinriceandBrachypodiumusingTALENs.MolecularPlant(2013)，由于小麥內(nèi)源基因TaGW2(GenbankNo.HQ404374)的靶標(biāo)片段(GenbankNo.HQ404374的第802-823位)上存在限制性內(nèi)切酶XbaI的識(shí)別序列(5’-TCTAGA-3’)，因而實(shí)驗(yàn)中采用限制性內(nèi)切酶XbaI進(jìn)行PCR/RE檢測實(shí)驗(yàn)。其中，PCR擴(kuò)增所用引物為：TaGW2-F：5’-TCCTGCTTGTGGGAGCTTTATG-3’SEQIDNO.4TaGW2-R：5’-ATGCCAACCCTTGCGTGTGCGT-3’SEQIDNO.5PCR/RE實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果見圖1(a為電泳圖。其中，第1泳道為Marker；Marker從下往上依次為100、250、500、750、1000、2000、3000bp；泳道2和3為導(dǎo)入了sgRNA：Cas9系統(tǒng)的原生質(zhì)體DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶XbaI酶切結(jié)果；泳道4為野生的原生質(zhì)體DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶XbaI酶切結(jié)果；泳道5為野生型的原生質(zhì)體PCR產(chǎn)物。b為回收a中未切開條帶測序結(jié)果，表明在TaGW2基因的靶位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)突變。WT表示野生型基因序列，“-”表示發(fā)生了刪除突變的序列，“+”表示發(fā)生了插入突變的序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量，小寫字母為插入的核苷酸)。結(jié)果表明在TaGW2基因靶位點(diǎn)發(fā)生了突變，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果表明在TaGW2基因的靶位點(diǎn)都發(fā)生了堿基插入/刪除(insertion/deletion,indel)類型的突變。五、利用基因槍法瞬時(shí)表達(dá)CRISPR/Cas9系統(tǒng)及供體DNA序列(ssDNA-1)對小麥內(nèi)源基因TaGW2進(jìn)行定點(diǎn)插入。ssDNA-1序列(114bp)：其中下劃線標(biāo)識(shí)的為同源序列，即基因組上雙鏈斷鏈兩側(cè)的序列；其他為loxP序列；邊框內(nèi)的序列為HindIII酶切位點(diǎn)。1)取“科農(nóng)199”小麥幼胚用高滲培養(yǎng)基進(jìn)行高滲處理4小時(shí)；2)使用基因槍對經(jīng)步驟1)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚進(jìn)行轟擊，將pTaU6-gRNA-C14質(zhì)粒，p163-Ubi-Cas9載體以及單鏈供體ssDNA-1導(dǎo)入所述小麥幼胚細(xì)胞中；每次所述轟擊的轟擊距離為6cm，轟擊壓力為1100psi，轟擊直徑為2cm，所述轟擊使用金粉對待導(dǎo)入DNA進(jìn)行分散；每次所述轟擊中所述金粉的使用量為200μg，所述待導(dǎo)入DNA為0.1μg(pTaU6-gRNA-C14質(zhì)粒，p163-Ubi-Cas9載體以及單鏈供體ssDNA-1各0.033μg)；所述金粉的粒徑為0.6μm。3)將經(jīng)步驟2)所述轟擊的小麥幼胚進(jìn)行高滲培養(yǎng)16小時(shí)；4)將經(jīng)步驟3)所述高滲培養(yǎng)的小麥幼胚依次進(jìn)行14天愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、28天分化培養(yǎng)和14-28天生根培養(yǎng)，獲得小麥植株。5)將經(jīng)步驟4)產(chǎn)生的500×4株“科農(nóng)199”小麥幼苗提取DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測得到2株具有明顯基因定點(diǎn)插入的突變體。6)對2株插入突變體中的TaGW2基因進(jìn)行A、B、D特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)2株植物的定點(diǎn)插入均發(fā)生在D基因組上，其中，特異引物分別為：6AS-F：CTGCCATTACTTTGTATTTTGGTAATASEQIDNO.76BS-F：GTTCAGATGGCAATCTAAAAGTTSEQIDNO.86DS-F:GCATGTACTTTGATTGTTTGCGTGASEQIDNO.96S-2R：TCCTTCCTCTCTTACCACTTCCCSEQIDNO.10突變體的檢測結(jié)果如圖2(a為電泳圖。其中，第1泳道為Marker；從下往上依次為100、250、500、750、1000bp；第2，3泳道為檢測突變體定點(diǎn)插入結(jié)果，第4泳道為野生型對照。b為回收a中條帶測序結(jié)果，表明在TaGW2基因的靶位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)插入。其中，WT表示野生型基因序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量，下劃線標(biāo)記(堿基為部分供體DNA序列)。結(jié)果表明在TaGW2基因靶位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)插入，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果證實(shí)了突變的產(chǎn)生(測序結(jié)果見圖2中b)。實(shí)施例2、利用基因槍法瞬時(shí)表達(dá)TELEN核酸酶及供體DNA序列獲得小麥內(nèi)源基因TaMLO的定點(diǎn)插入突變體一、靶序列的設(shè)計(jì)選擇TaMLO基因?yàn)槟康幕?，利用已發(fā)表的TaMLO基因靶向TALENs載體T-MLO表達(dá)特異于靶標(biāo)片段的核酸酶。T-MLO載體可表達(dá)成對TALEN蛋白，所述TALEN蛋白由能夠識(shí)別靶標(biāo)片段并與其結(jié)合的DNA結(jié)合域和FokI結(jié)構(gòu)域組成。靶標(biāo)片段為：TaMLO-A基因:TaMLO-B基因:TaMLO-D基因：二、利用基因槍法瞬時(shí)表達(dá)T-MLO及供體DNA序列(ssDNA-2)對小麥內(nèi)源基因MLO基因進(jìn)行定點(diǎn)插入；ssDNA-2序列(75bp)：CGCTGCTGCTCGCCGTCACGCAGAACAGAAACTGATCTCTGAAGAAGACCTGCCATCTCCGGGATATGCATCTCCSEQIDNO.11其中下劃線標(biāo)識(shí)部分為同源序列，即基因組上雙鏈斷鏈兩側(cè)的序列；未標(biāo)記部分為Myc-Tag序列。(1)以小麥品種“Bobwhite”幼胚為材料，進(jìn)行基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化及組織培養(yǎng)過程見實(shí)施例1中步驟五。(2)將經(jīng)步驟(1)產(chǎn)生的200×4株小麥幼苗提取DNA。利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增MLO基因，檢測得到1株具有明顯基因定點(diǎn)插入的突變體。所用引物序列為：TaMLO-F:GTCTTCGCCGTCATGATCATCGTCTCCSEQIDNO.12TaMLO-R:TGGTATTCCAAGGAGGCGGTCTCTGTCTSEQIDNO.13(3)將該插入突變體TaMLO基因進(jìn)行A、B、D特異性擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)定點(diǎn)插入發(fā)生在A基因組上。用于擴(kuò)增TaMLO-A基因的引物對如下：上游引物：5’-TGGCGCTGGTCTTCGCCGTCATGATCATCGTC-3’SEQIDNO.14下游引物：5’-TACGATGAGCGCCACCTTGCCCGGGAA-3’SEQIDNO.15用于擴(kuò)增TaMLO-B基因的引物對如下：上游引物：5’-ATAAGCTCGGCCATGTAAGTTCCTTCCCGG-3’SEQIDNO.16下游引物：5’-CCGGCCGGAATTTGTTTGTGTTTTTGTT-3’SEQIDNO.17用于擴(kuò)增TaMLO-D基因的引物對如下：上游引物：5’-TGGCTTCCTCTGCTCCCTTGGTGCACCT-3’SEQIDNO.18下游引物：5’-TGGAGCTGGTGCAAGCTGCCCGTGGACATT-3’SEQIDNO.19突變體的檢測結(jié)果如圖3所示(a為電泳圖。其中，第1泳道為Marker；Marker從下往上依次為100、250、500、750、1000、2000、3000、5000bp；第2泳道為檢測突變體定點(diǎn)插入結(jié)果，第3泳道為野生型對照。b為回收a中條帶測序結(jié)果，表明在TaMLO基因的靶位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)插入。其中，WT表示野生型基因序列，“-/+”后邊的數(shù)字表示刪除或插入的核苷酸的數(shù)量，標(biāo)記堿基為部分供體DNA序列)。結(jié)果表明在TaMLO基因靶位點(diǎn)發(fā)生了定點(diǎn)插入，回收測序圖中的條帶，測序結(jié)果證實(shí)了突變的產(chǎn)生(測序結(jié)果見圖3中b)。采用所述方法對植物的目的基因進(jìn)行定點(diǎn)插入，從而獲得的瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞或所述瞬時(shí)表達(dá)組織屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。由所述瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞或所述瞬時(shí)表達(dá)組織培養(yǎng)后得到的定點(diǎn)插入突變植株也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。以上所述的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>吉諾沃生物科技有限公司<120>通過瞬時(shí)表達(dá)對植物基因進(jìn)行定點(diǎn)插入的方法及獲得的瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞、組織和突變植株<130><160>17<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>1cctctagaaataccccatcctg22<210>2<211>23<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>2cttgcaggatggggtatttctag23<210>3<211>23<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>3aaacctagaaataccccatcctg23<210>4<211>22<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>4tcctgcttgtgggagctttatg22<210>5<211>22<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>5atgccaacccttgcgtgtgcgt22<210>6<211>114<212>DNA<213>人工序列<400>6ccaccaggatggggtatttcataacttcgtatagcatacattatacgaagttataagctt60ataacttcgtatagcatacattatacgaagttattagaggaggagctgcaacga114<210>7<211>27<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>7ctgccattactttgtattttggtaata27<210>8<211>23<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>8gttcagatggcaatctaaaagtt23<210>9<211>25<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>9gcatgtactttgattgtttgcgtga25<210>10<211>23<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>10tccttcctctcttaccacttccc23<210>11<211>75<212>DNA<213>人工序列<400>11cgctgctgctcgccgtcacgcagaacagaaactgatctctgaagaagacctgccatctcc60gggatatgcatctcc75<210>12<211>27<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>12gtcttcgccgtcatgatcatcgtctcc27<210>13<211>28<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>13tggtattccaaggaggcggtctctgtct28<210>14<211>32<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>14tggcgctggtcttcgccgtcatgatcatcgtc32<210>15<211>27<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>15tacgatgagcgccaccttgcccgggaa27<210>16<211>30<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>16ataagctcggccatgtaagttccttcccgg30<210>17<211>28<212>DNA<213>小麥（Triticumaestivum）<400>17ccggccggaatttgtttgtgtttttgtt28當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3