本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測和診斷領域。具體地說，本發(fā)明涉及一種新型的融合抗原，包含該融合抗原的免疫檢測試劑盒及其應用。

背景技術：

戊型肝炎(簡稱戊肝)也稱為腸道傳播性非甲非乙型肝炎，由戊型肝炎病毒(Hepatitis E ViRus,HEV)感染所致。HEV在歐美少見，但在遠東地區(qū)廣泛流行，近20％的中國人帶有戊型肝炎抗體，意味著曾受感染。豬和其他動物都可以攜帶戊型肝炎病毒，可能是此病毒的儲源。孕婦感染HEV病情重，易發(fā)生肝功能衰竭，尤其妊娠晚期病死率高。HEV形態(tài)和基因組結構與杯狀病毒較為相似，主要經(jīng)消化道傳播。急性病毒肝炎期內(nèi)，血液里會出現(xiàn)IgM戊型肝炎抗體，三到數(shù)月后會被IgG抗體取代，并保持數(shù)年。

HEV是一種RNA病毒，基因組由非編碼區(qū)，非結構區(qū)和結構區(qū)組成，有3個開放閱讀框架(ORF1、ORF2和ORF3)編碼病毒蛋白。ORF-1位于病毒基因組5’端，編碼病毒非結構蛋白；ORF2位于病毒基因組3’端，編碼病毒衣殼蛋白；ORF3位于ORF1與ORF2之間，與兩者都有不同程度的重疊，編碼病毒調(diào)控蛋白。目前戊型肝炎的血清學檢測仍以檢測抗HEV抗體為主，高質(zhì)量的HEV免疫檢測試劑盒的研制需要高質(zhì)量的重組抗原。

各國在戊型肝炎防治領域的研究重點主要集中在疫苗和診斷方面。多年來，有效的HEV疫苗研制工作仍未成功，對HEV感染的及時和準確診斷成為了目前戊型肝炎預防控制工作中的重點。在戊型肝炎診斷方面，HEV抗體檢測是目前HEV診斷的通用方法和重要手段。通過對各種血制品和受檢人群的血液或其他體液進行HEV抗體篩查，能有效的檢測出戊型肝炎病毒感染。

目前在HEV免疫抗體檢測試劑盒中以間接法和捕獲法的應用最為廣泛。間接法主要測IgG，原理是：在酶免反應板上面包被HEV抗原，加入待檢標本，孵育后加入已標記酶的二抗，標本中如存在HEV抗體，則HEV抗體將吸附到固相支持物上面，然后通過二抗上的酶結合物將信號放大，用酶標儀獲得判定結果。捕獲法主要檢測IgM，原理是使用已包被抗人IgMμ鏈的反應板，加入樣品稀釋液和待測標本，孵育后加入經(jīng)酶稀釋液適當稀釋的已標記的抗原酶結合物，孵育后加入顯色液和終止液，酶標儀讀取OD值。

HEV免疫檢測試劑盒質(zhì)量關鍵指標是靈敏度和穩(wěn)定性，實質(zhì)是由用于試劑盒的抗原的質(zhì)量決定，而高質(zhì)量的抗原需要在活性和穩(wěn)定性方面均表現(xiàn)優(yōu)秀。抗原活性和穩(wěn)定性是由抗原的氨基酸組成決定的，一般的規(guī)律是，體外表達的重組抗原如果是在上清中表達量高、折疊充分，其構象將更接近天然抗原，活性和穩(wěn)定性方面更好。

由于HEV抗原本身疏水性強，表達量低且活性差，獲得的抗原量少，故大多數(shù)表達HEV抗原的方法就是在抗原上融合表達一段融合蛋白，形成融合蛋白-抗原的嵌合抗原，使用該方法表達出來的重組抗原在可溶性和表達量方面均有更好的表現(xiàn)，現(xiàn)有技術中普遍采用的融合蛋白有TRX(硫氧還蛋白)和GST(谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶)等融合蛋白。這些融合蛋白運用在HEV抗原表達上有利于提高抗原的表達量，但融合蛋白用于檢測試劑后均存在靈敏度不高、穩(wěn)定性較差的情況。

因此，HEV免疫檢測領域急需能夠具備高抗原活性、高檢測靈敏度和高穩(wěn)定性的重組抗原，以便作為包被抗原或者標記抗原用作檢測試劑來檢測HEV抗體，提升試劑質(zhì)量。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提供一種可溶性好、折疊構象接近天然的HEV基因工程重組抗原，用它改善現(xiàn)有HEV抗體檢測試劑盒的靈敏度、穩(wěn)定性。

本發(fā)明的另外一個目的是為了提供一種可提高重組蛋白的表達量、可溶性、折疊正確的融合蛋白，含有編碼該融合蛋白的核酸序列，以及含有上述核酸序列的質(zhì)粒載體，克隆有上述質(zhì)粒載體的宿主細胞克隆子。

在第一方面，本發(fā)明提供一種融合抗原，所述融合抗原包含融合蛋白和目的抗原片段，

其中，所述融合蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白；或

(b)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在具體的實施方式中，所述目的抗原片段包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面所述的融合抗原的編碼核苷酸序列。

在第三方面，本發(fā)明提供一種表達載體，所述表達載體包含本發(fā)明第二方面所述的編碼核苷酸序列。

在第四方面，本發(fā)明提供一種宿主細胞，所述宿主細胞包含本發(fā)明第三方面所述的表達載體或在基因組中整合有本發(fā)明第二方面所述的編碼核苷酸序列。

在第五方面，本發(fā)明提供一種融合蛋白，所述融合蛋白是：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的蛋白；或

(b)由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的缺失或添加而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在優(yōu)選的實施方式中，(b)所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成的且具有(a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。

在第六方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第五方面所述融合蛋白的編碼核苷酸序列。

在第七方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測試劑盒，所述試劑盒裝有：

(a)本發(fā)明第一方面所述的重組抗原；和

(b)用于免疫檢測的其它試劑。

在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測試劑盒是HEV免疫檢測試劑盒。

在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測試劑盒還裝有使用說明書。

在第八方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的融合抗原或本發(fā)明第五方面所述的融合蛋白在制備免疫檢測試劑盒或免疫檢測試劑中的用途。

在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測試劑盒是HEV免疫檢測試劑盒，所述免疫檢測試劑是HEV免疫檢測試劑。

在第九方面，本發(fā)明提供一種免疫檢測方法，所述方法包括利用本發(fā)明第一方面所述的融合抗原或本發(fā)明第七方面所述的免疫檢測試劑盒來檢測樣品中的抗體。

在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測方法可以是非診斷目的的。

在優(yōu)選的實施方式中，所述抗體是HEV抗體。

應理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優(yōu)選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的R載體的構建過程的示意圖。

圖2是本發(fā)明的R-HEV表達質(zhì)粒的構建過程的示意圖。

具體實施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)將本發(fā)明的特定融合蛋白(在本文稱為R蛋白)和HEV抗原融合表達后得到的融合抗原在抗原活性和穩(wěn)定性方面均具有顯著優(yōu)勢。將該融合抗原作為包被抗原或者標記抗原應用于HEV免疫檢測試劑檢測HEV抗體時，檢測的靈敏度以及穩(wěn)定性有明顯的提高。在此基礎上完成了本發(fā)明。

定義

除非另有說明，本發(fā)明中使用的術語定義如下。

本發(fā)明中使用的術語“融合蛋白”是指用于與目的抗原片段融合表達成融合抗原的蛋白。

本發(fā)明中使用的術語“融合抗原”是指上述融合蛋白與目的抗原片段一起融合表達的產(chǎn)物。

本發(fā)明中使用的術語“重組抗原”是指利用基因工程重組技術，將編碼目的抗原片段所對應的核苷酸序列克隆入表達載體，形成重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒導入宿主細胞并表達的抗原。

本發(fā)明的融合蛋白

本發(fā)明提供了一種新型融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的融合蛋白的親水性氨基酸較多，其融合性好、構象穩(wěn)定。將此段多肽作為融合蛋白在活性和穩(wěn)定性方面相較其它融合蛋白有明顯的優(yōu)勢。

鑒于本發(fā)明的教導以及現(xiàn)有技術，本領域技術人員還應明白“本發(fā)明的融合蛋白”還應包括所述蛋白的變異形式，所述變異形式具有與“本發(fā)明的融合蛋白”相同或相似的功能，但其氨基酸序列與SEQ ID NO:1所示氨基酸序列有少量差異。這些變異形式包括(但不限于)：一個或多個(通常為1-30個，較佳地1-10個，更佳地1-6個，最佳地1-3個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或多個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為6個或3個以內(nèi))氨基酸。例如，本領域技術人員熟知，用性能相近或相似的氨基酸進行取代，例如，異亮氨酸與亮氨酸相互取代時，不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。再例如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸，例如為便于分離而添加的標簽通常不會改變所得蛋白質(zhì)的功能。例如，本申請實施例中的融合蛋白即是在N端帶有6*his標簽的蛋白。

除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還應包括“本發(fā)明的融合蛋白”的活性片段。通常，該片段具有“本發(fā)明的融合蛋白”的氨基酸序列的至少約20個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。

本發(fā)明還提供“本發(fā)明的融合蛋白”的類似物。這些類似物與“本發(fā)明的融合蛋白”的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的蛋白并不限于上述例舉的代表性蛋白。

修飾(通常不改變一級結構)形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的蛋白。

因此，鑒于本發(fā)明的教導和現(xiàn)有技術，本領域技術人員可根據(jù)，例如下表所示進行氨基酸替換而產(chǎn)生保守性變異的突變體。

有鑒于此，本發(fā)明提供的融合蛋白還包括這樣的衍生蛋白，所述衍生蛋白由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過一個或數(shù)個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成，且具有氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白的功能。

在優(yōu)選的實施方式中，所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成；在進一步的實施方式中，所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列經(jīng)過1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基的缺失或添加而形成；在進一步優(yōu)選的實施方式中，所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成；在最優(yōu)選的實施方式中，所述的衍生蛋白是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加1-10個，更優(yōu)選1-6個，還要優(yōu)選1-3個，最優(yōu)選1個氨基酸殘基而形成。

在本發(fā)明的融合蛋白的基礎上，本發(fā)明還提供所述融合蛋白的編碼核苷酸序列。

基于本發(fā)明的內(nèi)容，本領域技術人員可以采用熟知的各種方法獲得本發(fā)明的融合蛋白(R蛋白)。例如，但不限于：全基因合成SEQ ID NO：1的編碼核苷酸序列，將合成好的核苷酸序列經(jīng)過酶切、連接，將該基因構建到一個不帶有融合蛋白基因的載體中成為R載體。抽提載體質(zhì)粒進行酶切電泳鑒定獲得陽性菌株。誘導目的蛋白表達，進行SDS-PAGE電泳觀察表達蛋白的分子量和表達量。純化相應的基因工程重組蛋白R。

本發(fā)明的融合抗原

在本發(fā)明的融合蛋白的基礎上，本發(fā)明人進一步地將上述融合蛋白與目標蛋白融合表達，發(fā)現(xiàn)可提高目標蛋白在上清中的表達量和可溶性。因此，將該融合蛋白與目的抗原片段融合表達得到的融合抗原，用于免疫試劑可以明顯提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。

在具體的實施方式中，將本發(fā)明的融合蛋白與，例如(但不限于)HEV ORF2蛋白的366-630位氨基酸(SEQ ID NO:2)融合表達得到融合抗原。將該融合抗原應用于HEV免疫檢測，可以明顯提高HEV檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。

在本發(fā)明的融合抗原的基礎上，本發(fā)明還提供了所述融合抗原的編碼核苷酸序列；包含所述的編碼核苷酸序列的表達載體；以及包含所述的表達載體或在基因組中整合有所述的編碼核苷酸序列的宿主細胞。

本領域技術人員可以采用熟知的各種方式制備本發(fā)明的融合抗原。例如，以構建好的R載體為模板，選擇合適的酶切位點，同時擴增SQE ID NO：2所示的HEV ORF2基因片段，并且該片段帶有跟R載體能夠連接到一起的酶切位點，按照通用的分子克隆過程構建載體。載體構建好后，通過克隆，菌株培養(yǎng)，獲取相應的質(zhì)粒。選取合適的宿主菌株，培養(yǎng)表達并純化相應的蛋白。

例如，在具體的實施方式中，所述制備方法包括：

(a)將編碼含有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2蛋白質(zhì)片段的核苷酸序列連于質(zhì)粒載體，形成重組質(zhì)粒；

(b)將步驟(a)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入宿主細胞，形成克隆子細胞；

(c)培養(yǎng)步驟(b)中的克隆子細胞，表達該重組蛋白；

(d)純化重組蛋白。

本發(fā)明的免疫檢測試劑盒

基于本發(fā)明的融合蛋白以及融合抗原，本領域技術人員會理解，所述本發(fā)明的融合蛋白以及融合抗原可用于制備相應的免疫檢測試劑盒或免疫檢測試劑。

所述免疫檢測試劑盒裝有本發(fā)明的重組抗原以及用于免疫檢測的其它試劑。本領域技術人員應理解，如果所述重組抗原中的目的抗原片段是上述HEV ORF2蛋白的366-630位氨基酸(SEQ ID NO:2)，則所述免疫檢測是HEV免疫檢測試劑盒，但不限于此。

在進一步的實施方式中，本發(fā)明的免疫檢測試劑盒還裝有使用說明書。

本領域技術人員可以利用本發(fā)明的融合抗原或免疫檢測試劑盒或來檢測樣品中的抗體，例如，但不限于HEV抗體。在優(yōu)選的實施方式中，所述免疫檢測方法可以是非診斷目的的。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1.本發(fā)明的融合蛋白與其他目的蛋白融合表達后，能提高目的蛋白的表達量和溶解性，有利于目的蛋白可溶表達，使目的抗原的空間構象接近天然抗原；

2.采用本發(fā)明的融合蛋白與目的蛋白融合表達出來的重組抗原的活性和穩(wěn)定性等均優(yōu)于目前常用的其他方式所表達的抗原，從而顯著提高了免疫檢測的靈敏度。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或本領域已知的文獻，例如各種教科書中所述的條件，例如分子克隆實驗指南(第二版)(J.薩姆布魯克等著)中所述的條件；或者按照市售可得儀器或試劑的使用說明書，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1.構建帶有R融合蛋白的載體

本發(fā)明所使用的表達載體質(zhì)粒為pET-28a(+)(Novagen公司)，在實施本發(fā)明的過程中pET-28a(+)并不是必須表達載體，其它許多表達載體如pQE32(Qiagen公司)均可用于實施本發(fā)明。

針對SEQ ID NO：1所示氨基酸序列，用生物相關軟件推導出大腸桿菌喜好的密碼子序列，序列前端加入NcoI酶切位點以及6個His標簽序列CCATGGGCCATCACCACCATCACCAC，序列末端加入BamHI、XhoI酶切位點序列，兩個酶切位點之間加入一個終止密碼子GGATCCTAACTCGAG，序列送生工生物全基因合成。

將合成好的含有目標序列的載體質(zhì)粒，分別用NcoI和XhoI酶(本發(fā)明所采用的各種分子生物學用酶均購自NEB公司)同時酶切，之后回收酶切產(chǎn)物，連接到用NcoI和XhoI酶切之后的pET-28a載體上，經(jīng)過克隆，PCR鑒定重組子，得到陽性克隆子，抽提質(zhì)粒，得到重組載體R1該步驟可參見圖1。

實施例2.構建含有HEV融合抗原基因的表達質(zhì)粒

PCR擴增HEV的基因ORF2區(qū)段中SEQ ID NO：2所對應的DNA片段，其上游引物帶有BamHI位點，下游引物帶有XhoI位點且XhoI位點之前帶有終止密碼子TAA。PCR的片段經(jīng)過回收和酶切之后，分別連接到經(jīng)過BamHⅠ和XhoI酶切之后的R1載體，經(jīng)過克隆，PCR鑒定重組子，得到的陽性克隆R1-HEV。該步驟可參見圖2。

實施例3.含有HEV融合抗原的表達和純化

將R1-HEV質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21DE3細胞，涂布于含50ug/ml硫酸卡那霉素)的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆，用含50ug/ml卡那霉素的500ml LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD600約0.8，用終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導培養(yǎng)：37℃，3小時。離心收集菌體，每升菌液收集的菌體用20ml超聲緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl)重懸，超聲破碎，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定顯示融合抗原超過70％表達在超聲上清液中。

為進一步證明本發(fā)明中的融合蛋白具有活性高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，將上述HEV的ORF2中SEQ ID NO：2所對應的片斷和其他不同融合蛋白TRX、GST分別進行融合表達(這二個融合蛋白的制備過程，和R1-HEV類似，在此不再贅述)，并將其結果作對比實驗，來進行關于R融合蛋白優(yōu)越性說明。即將R1-HEV，TRX-HEV、GST-HEV在同一條件進行誘導表達并比較。對比實驗步驟：各取R1-HEV，TRX-HEV、GST-HEV克隆子分別用含同一濃度卡那霉素的500ml LB培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.8左右，使用終濃度為0.5mM的IPTG進行誘導，誘導條件為：37℃，3小時。離心20分鐘收集菌體，每升菌液的菌體用20ml超聲緩沖液(50mM TRis-HCl，pH8.0，100mM NaCl)重懸，超聲破碎，離心20分鐘，收集上清部分，分別取相同體積的經(jīng)處理樣品進行SDS-PAGE電泳，通過軟件分析凝膠，得出各融合蛋白占總上清蛋白的百分比，結果如下：

從上述結果可以看到，R1-HEV在上清中融合蛋白的表達量好于其它二種。

分別將各重組蛋白的上清進行純化：使用5倍柱床體積的平衡緩沖液(50mM TRis-HCl，pH8.0，100mM NaCl，5mM咪唑)平衡Ni-NTA親和柱，加入超聲上清樣品，用5倍柱床體積的平衡緩沖液洗去未結合的蛋白，再用洗脫緩沖液(50mM TRis-HCl，100mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)，洗脫目的蛋白，測定蛋白濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。R1-HEV表達純化的融合抗原在下文簡寫為R1-HEV Ag，其他融合抗原類似，分別命名為TRX-HEV Ag、GST-HEV Ag。

實施例4.融合抗原包被固相載體

將R1-HEV Ag融合抗原以0.5ug/ml的濃度加入至碳酸鹽緩沖液(50mM，pH9.6)，混勻并常溫放置30分鐘成包被液。將包被液按100ul/孔加入酶標反應板，2～8℃包被過夜。次日吸去包被液，用PBST(10mM PBS，0.1％Tween-20，pH7.4)洗滌液洗板一次，然后吸干。將含有5％蔗糖和1％BSA的封閉液注滿每孔，37℃封閉1～2小時，吸去封閉液，最后甩干反應板中的殘留液體。將反應板真空抽干，裝入鋁鉑袋并放入干燥劑，熱封，放2～8℃保存，備用。其他融合抗原包被方法相同。

實施例5.各融合抗原包被的反應板間接ELISA檢測HEV抗體

在包被酶標板中先每孔加入樣品稀釋液100μl，再加入待測標本10μl(陽性血清)，37℃溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。按100ul/孔加入含有20％新生牛血清和一定量的兔抗人IgG-HRP的的PB緩沖液(10mM，pH7.4)，37℃溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干。(TRX-HEV Ag，GST-HEV Ag的實驗方法同R1-HEVAg)

每孔加入含0.8％檸檬酸、1.7％檸檬酸鈉的顯色劑A及含0.2‰TMB(生工，貨號TB0514)、5mM檸檬酸、0.5mM EDTA-2Na、4％無水乙醇、0.3％丙酮的顯色劑B各50ul，37℃避光顯色10分鐘。每孔加50ul，含2M硫酸的終止液終止反應，酶標儀450nm波長(參考波長630nm)空白孔校零后讀取OD值。

本發(fā)明人用相同方法將TRX-HEV Ag、GST-HEV Ag包被固相載體，用間接ELISA檢測上述HEV陽性血清，得到了表2的結果，結果表明本發(fā)明融合蛋白連接HEV抗原包被檢測活性高于其他二種融合抗原。

表2.各融合抗原包被的反應板間接ELISA檢測HEV抗體的靈敏度比較

實施例6.各融合抗原包被的反應板的穩(wěn)定性

將各融合抗原包被的酶標反應板于37℃放置6天，取出反應板室溫平衡30分鐘以上。與4℃反應板一同檢測陽性樣本。將各反應板于2～8℃放置14個月，取出反應板室溫平衡30分鐘以上，分別檢測10份陽性血，方法同上。結果見表3。實驗表明，本發(fā)明融合蛋白連接HEV抗原包被反應板后存放穩(wěn)定性好于其他二種融合抗原包被的反應板。

表3.各融合抗原包被的反應板的穩(wěn)定性比較

本發(fā)明的融合蛋白R連接HEV目的蛋白之后表達的重組抗原，包被反應板之后用于ELISA檢測HEV抗體，活性、穩(wěn)定性等指標均優(yōu)于TRX-HEV Ag、GST-HEV等表達載體表達的HEV抗原。

實施例7.融合抗原標記HRP

融合抗原標記HRP采用經(jīng)典NaIO4法。稱取10mg辣根過氧化物酶(HRP，美國SIGMA公司，貨號P8375)溶解于1ml超純水中，再緩慢滴加1ml超純水新鮮配制的5mg/ml NaIO4(生工生物，貨號ST1244)溶液，4℃避光30分鐘后加入5％乙二醇(生工生物，貨號0518A60)溶液1ml，4℃避光30分鐘。然后立即加入2mg/ml的R1-HEVAg抗原1ml，4℃避光對碳酸鹽緩沖液(50mM，pH9.6)透析過夜。次日，向混合物中滴加0.2ml新鮮配制的5mg/ml NaBH4(美國SIGMA公司，貨號71321)溶液，混勻，4℃靜置2小時。將上述溶液對PBS緩沖液(150mM，pH7.4)4℃透析過夜。加入終濃度50％的甘油混勻后-20℃避光保存?zhèn)溆茫麨镽1-HEV Ag-HRP，其它融合抗原標記方法和名稱相同。

實施例8.標記HRP的各融合抗原ELISA檢測HEV抗體

捕獲法檢測各酶結合物的活性，取已包被抗人IgMμ鏈的反應板(上?？迫A生物工程股份有限公司)，每孔加入樣品稀釋液100μl，再加入待測標本10μl(陽性血)，加入經(jīng)酶稀釋液適當稀釋的各抗原酶，加入顯色液和終止液，酶標儀后讀取OD值。

表4.各HEV融合抗原標記HRP后檢測HEV抗體的活性比較

本發(fā)明人用相同的方法將R-HEV Ag、TRX-HEV Ag、GST-HEV Ag分別標記上HRP，再用捕獲法ELISA檢測HEV陽性樣本，得到了表4的結果，結果表明本發(fā)明融合蛋白連接HEV基因并標記后檢測活性高于其他二種融合抗原。

實施例8.標記HRP的各融合抗原放置穩(wěn)定性比較

將各融合抗原酶經(jīng)抗原酶稀釋液按一定比例稀釋后分別于37℃和2-8℃放置6天，取出，室溫平衡30分鐘以上。按捕獲法一同檢測HEV陽性樣本。將各融合抗原酶經(jīng)抗原酶稀釋液按一定比例稀釋后于2-8℃分別放置6個月和12個月，取出，室溫平衡30分鐘以上。按捕獲法一同檢測HEV陽性樣本，方法同上。結果見表5。實驗表明，本發(fā)明融合蛋白連接HEV抗原標記HRP后存放穩(wěn)定性明顯好于其他二種融合抗原標記的HRP。

表5.各HEV融合抗原標記HRP經(jīng)稀釋后穩(wěn)定性比較

本發(fā)明人通過將各融合抗原R-HEV Ag、TRX-HEV Ag、GST-HEV Ag包被和標記HRP的R-HEV Ag-HRP、TRX-HEV Ag-HRP、GST-HEV Ag-HRP分別進行快速熱穩(wěn)定性和長期存放穩(wěn)定性的研究。將各反應板和各抗原酶經(jīng)酶稀釋液適當稀釋后于37℃放置6天，取出反應板和酶分別在同一條件下檢測相同的陽性血清作為37℃熱穩(wěn)定性研究，如表4。同樣，將各反應板和各抗原酶經(jīng)酶稀釋液適當稀釋后于2-8℃放置14個月，分別在同一條件下檢測相同的陰、陽性質(zhì)控血清作為長期存放穩(wěn)定性研究，如表5。結果表明本發(fā)明融合蛋白連接HEV基因的融合抗原用于HEV檢測試劑穩(wěn)定性明顯優(yōu)于其他二種融合抗原。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

序列表

<110> 上?？迫A生物工程股份有限公司

<120> 一種新型融合抗原和包含其的檢測試劑盒及應用

<130> P2016-1948

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 本發(fā)明的融合蛋白

<400> 1

Lys Lys Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro

1 5 10 15

Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val

20 25 30

Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Tyr Pro Ile Val Glu Ile Tyr Asn Lys Asp

35 40 45

Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp

50 55 60

Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Glu Glu Leu Met Phe Asn Leu Gln

65 70 75 80

Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala

85 90 95

Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Asn Lys Asp Val Gly Val Asp

100 105 110

Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Asp Asn Leu Val Asp Leu Ile

115 120 125

Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Gly Gly

130 135 140

Gly Glu

145

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HEV ORF2蛋白的366-630位氨基酸

<400> 2

Leu His Phe Thr Gly Thr Asn Gly Val Gly Glu Val Gly Arg Gly Ile

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Phe Asn Leu Ala Asp Thr Leu Leu Gly Gly Leu Pro

20 25 30

Thr Glu Leu Ile Ser Ser Ala Gly Gly Gln Leu Phe Tyr Ser Arg Pro

35 40 45

Val Val Ser Ala Asn Gly Glu Pro Thr Val Lys Leu Tyr Thr Ser Val

50 55 60

Glu Asn Ala Gln Gln Asp Lys Gly Ile Ala Ile Pro His Asp Ile Asp

65 70 75 80

Leu Gly Glu Ser Arg Val Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln His Glu

85 90 95

Gln Asp Arg Pro Thr Pro Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val

100 105 110

Leu Arg Ala Asn Asp Val Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr

115 120 125

Asp Gln Thr Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Asn Pro Met Tyr Val Ser Asp

130 135 140

Thr Val Thr Phe Val Asn Val Ala Thr Gly Ala Gln Gly Val Ser Arg

145 150 155 160

Ser Leu Asp Trp Ser Lys Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Ile Thr

165 170 175

Ile Gln Gln Tyr Ser Lys Thr Phe Tyr Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys

180 185 190

Leu Ser Phe Trp Glu Ala Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn

195 200 205

Tyr Asn Thr Thr Ala Ser Asp Gln Ile Leu Ile Glu Asn Ala Ala Gly

210 215 220

His Arg Val Cys Ile Ser Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Gly Ser Gly Pro

225 230 235 240

Val Ser Ile Ser Ala Val Gly Val Leu Ala Pro His Ser Val Leu Ala

245 250 255

Ala Leu Glu Asp Thr Val Asp Tyr

260