本發(fā)明涉及一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法。
背景技術：
近年來，因疾病、創(chuàng)傷、人口老齡化等原因導致的骨損傷患者數(shù)量劇增。骨缺損修復主要采用自體骨或同種異體骨移植以及人工骨替換等方法。其中自體骨移植因其良好的骨誘導性和生物相容性，迄今仍是骨修復的“金標準”。但由于來源受限、供骨部位易感染等問題，臨床應用受到限制；而異體骨則存在不同程度的免疫排異反應及潛在的病源傳播風險。盡管目前已經(jīng)有不少骨修復材料獲得臨床應用，但單純材料生物活性普遍不足，嚴重影響了其臨床使用效果。
對骨生長和修復有促進作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白生長因子的發(fā)現(xiàn)為提高骨修復材料的活性提供了有效的手段。bmp屬于轉化生長因子tgf-β超家族成員，于1965年首次被發(fā)現(xiàn)。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)20余種bmp成員。其中bmp-2研究最為廣泛，其誘導成骨作用已得到證實，并且已分別獲美國食品和藥物管理局（fda）和歐洲藥品管理局（emea）批準用于臨床，具有廣闊的應用前景。bmp是一種疏水性非膠原酸性糖蛋白，存在于動物骨組織中，但含量極低，每千克鮮骨中僅分離出幾微克bmp，且分離過程繁雜，純度低，重復性差，質量控制困難，難以滿足臨床需求。利用基因重組技術不僅可以實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，還可以避免免疫排斥反應，具有極佳的發(fā)展前景。
目前，bmp-2可以采用真核細胞和原核細胞兩種系統(tǒng)表達。真核細胞表達系統(tǒng)使用哺乳動物細胞，其表達產(chǎn)物可以糖基化，有更好的翻譯后修飾，活性相對較高。目前的國外產(chǎn)品大多采用真核表達體系制備。但真核體系表達量低，因此表達產(chǎn)物回收及純化均困難，導致生產(chǎn)成本很高。目前國外bmp產(chǎn)品的價格十分昂貴，臨床推廣難度很大。與真核表達系統(tǒng)相比，原核細胞表達系統(tǒng)具有表達效率高、對培養(yǎng)環(huán)境耐受性強、易于控制，產(chǎn)物穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，更利于臨床推廣。但其主要問題是較難正確加工和折疊形成有活性的蛋白質，特別是可重復性的復性和純化的難度很大，致使大部分工作停留在實驗室水平，無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提出一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法。
一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率采用密碼子優(yōu)化軟件初步優(yōu)化hbmp-2的cdna序列，再根據(jù)經(jīng)驗值計算，進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hbmp-2基因的dna序列；
（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入載體pbv220，獲得優(yōu)化的hbmp-2表達質粒，經(jīng)酶切和測序驗證插入片段與設計相符；
（3）先以常規(guī)氯化鈣法采用分子克隆技術制備感受態(tài)表達系統(tǒng)，隨后用所得的表達質粒轉化大腸桿菌菌株，在抗性平板中挑取單菌落，培養(yǎng)并抽提質粒，酶切測序；
（4）挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的lb培養(yǎng)液的搖瓶中，在氣浴振蕩器中培養(yǎng)15h，溫度30℃、轉速180r·min，然后冰浴條件下加入無菌甘油，分裝后在80℃冰箱保存，備用；
（5）從含正確表達質粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液搖瓶中；在搖床中培養(yǎng)8h溫度30℃、轉速180r·min，再按體積比為1:10的比例將培養(yǎng)物接種到lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，條件：ph7.0±0.2，溫度30℃，轉速180r·min；
（6）隨后升溫至42℃進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6h；
（7）結束培養(yǎng)，在（4±2）℃溫度下離心分離（轉速7500r·min?1）收集菌體，裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
（8）將收集的菌體，與te緩沖溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例與溶菌酶混合，采用高壓均質法進行菌體破碎，離心分離（轉速10000r·min?1）并收集沉淀；
（9）加入洗滌溶液（1g沉淀物/20ml洗滌液），攪拌2h后，在（4±2）℃下離心分離，收集沉淀物；
（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗滌數(shù)次后，加入10mmol·l?1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后離心收集沉淀，得包涵體；
（11）包涵體/10ml的比例加入裂解液；
在（4±2）℃下，攪拌裂解8h，然后離心[轉速10000r·min?1，溫度（4±2）℃]30min，棄沉淀，取離心上清液加入含復性助劑的復性液中，稀釋至蛋白含量為0.1mg·ml?1，復性7d；
（12）從復性液中回收有活性的融合蛋白二倍體，然后在30～7℃下凍干，得到目標蛋白。
本發(fā)明所述方法通過截取編碼rhbmp-2羧基端氨基酸肽段的rhbmp-2的cdna制備大腸桿菌rhbmp-2菌株，通過發(fā)酵及工藝優(yōu)化，獲得bmp包涵體，經(jīng)分離純化與復性，制得成品純度高。
具體實施方式
一種重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白的制備方法，其特征在于包括以下步驟：
（1）根據(jù)大腸桿菌密碼子使用頻率采用密碼子優(yōu)化軟件初步優(yōu)化hbmp-2的cdna序列，再根據(jù)經(jīng)驗值計算，進一步更換其中部分核苷酸編碼，得到優(yōu)化的hbmp-2基因的dna序列；
（2）全基因合成hbmp-2基因dna序列，酶切后插入載體pbv220，獲得優(yōu)化的hbmp-2表達質粒，經(jīng)酶切和測序驗證插入片段與設計相符；
（3）先以常規(guī)氯化鈣法采用分子克隆技術制備感受態(tài)表達系統(tǒng)，隨后用所得的表達質粒轉化大腸桿菌菌株，在抗性平板中挑取單菌落，培養(yǎng)并抽提質粒，酶切測序；
（4）挑取重組子，接種于裝有含葡萄糖和抗生素的lb培養(yǎng)液的搖瓶中，在氣浴振蕩器中培養(yǎng)15h，溫度30℃、轉速180r·min，然后冰浴條件下加入無菌甘油，分裝后在80℃冰箱保存，備用；
（5）從含正確表達質粒的大腸桿菌抗性平板中挑取單菌落，接種于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)液搖瓶中；在搖床中培養(yǎng)8h溫度30℃、轉速180r·min，再按體積比為1:10的比例將培養(yǎng)物接種到lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h，條件：ph7.0±0.2，溫度30℃，轉速180r·min；
（6）隨后升溫至42℃進行誘導，繼續(xù)培養(yǎng)6h；
（7）結束培養(yǎng)，在（4±2）℃溫度下離心分離（轉速7500r·min?1）收集菌體，裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
（8）將收集的菌體，與te緩沖溶液按1g:10ml的比例混合，再按1g:1mg的比例與溶菌酶混合，采用高壓均質法進行菌體破碎，離心分離（轉速10000r·min?1）并收集沉淀；
（9）加入洗滌溶液（1g沉淀物/20ml洗滌液），攪拌2h后，在（4±2）℃下離心分離，收集沉淀物；
（10）沉淀物用0.5%曲拉通水溶液洗滌數(shù)次后，加入10mmol·l?1的tris（ph7.5）溶液（1g沉淀物/20mltris），清洗后離心收集沉淀，得包涵體；
（11）包涵體/10ml的比例加入裂解液；
在（4±2）℃下，攪拌裂解8h，然后離心[轉速10000r·min?1，溫度（4±2）℃]30min，棄沉淀，取離心上清液加入含復性助劑的復性液中，稀釋至蛋白含量為0.1mg·ml?1，復性7d；
（12）從復性液中回收有活性的融合蛋白二倍體，然后在30～7℃下凍干，得到目標蛋白。