本發(fā)明屬于植物種質(zhì)資源評價技術(shù)領域，具體涉及一種基于SSR分子標記構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)資源庫的方法。

背景技術(shù)：

豐富的遺傳資源是新品種選育等各項研究工作的基礎。但是，由于實際工作中真正利用的資源數(shù)量有限，而資源數(shù)量太大不利于對種質(zhì)資源進行全面的保存與利用。為此，F(xiàn)rankle于1984年提出了核心種質(zhì)的概念，即通過科學的方法，從整個種質(zhì)資源中選出能以最小的資源數(shù)量和遺傳重復最大限度保留整個資源遺傳多樣性的那部分資源，以此來深入評價和有效保護利用整體種質(zhì)資源，并與Brown將其進一步發(fā)展，而原種質(zhì)中除核心種質(zhì)外的資源稱為保留種質(zhì)，被用作核心種質(zhì)的候補資源。

核心種質(zhì)的構(gòu)建有利于對種質(zhì)資源進行有效的研究、評價、利用與保護，被許多國際育種工作者所關注。到目前為止，國內(nèi)外己對50多個物種進行了核心種質(zhì)的構(gòu)建。中國在核心種質(zhì)構(gòu)建方面的研究起步較晚，但已在如綠豆、苜蓿、大豆、小麥、水稻、板栗、野生板栗、野蘋果、葡萄、李、桃、梨、果梅、普通杏、柚類、核桃、桃、柿、石榴和棗樹等作物上進行了研究。目前，關于甘薯核心種質(zhì)的構(gòu)建僅有少量報道，且是基于表型性狀數(shù)據(jù)研究構(gòu)建方法。然而，甘薯農(nóng)藝性狀多為數(shù)量性狀，其表現(xiàn)型值易于受環(huán)境條件影響而導致測量數(shù)據(jù)不準確，進而會影響核心種質(zhì)構(gòu)建結(jié)果的有效性。

簡單重復序列(Simple Sequence Repeat，SSR)，是一種基于PCR技術(shù)的分子標記，它能在分子水平上檢測個體的核苷酸差異，其具有多個優(yōu)點：

(1)在真核生物基因組中分布廣、多態(tài)性高；

(2)SSR產(chǎn)物進行凝膠電泳分離時堿基分辨率高、共顯性標記遺傳信息量大；

(3)呈孟德爾式遺傳，穩(wěn)定性好，技術(shù)要求低，成本低廉，可重復性高。

基于上述優(yōu)點，采用SSR標記構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)，可克服田間農(nóng)藝性狀多態(tài)性低和易受環(huán)境影響的缺點。

截止目前，尚未見有基于SSR分子標記的甘薯核心種質(zhì)構(gòu)建方法的相關報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種基于SSR分子標記的甘薯核心種質(zhì)資源庫的構(gòu)建以及結(jié)合表型性狀進行評價的方法，該方法能夠高效、可靠的建立52份甘薯種質(zhì)資源的核心種質(zhì)，對甘薯種質(zhì)資源的保存、評價及創(chuàng)新利用均具有重要意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種基于SSR分子標記構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)資源庫的方法，包括如下步驟：

(1)采用備份保存方式進行甘薯種質(zhì)資源的繁育和保存；

(2)采用植物基因組試劑盒進行甘薯種質(zhì)資源DNA的提取，和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并利用微量核酸蛋白檢測儀檢測DNA濃度；

(3)甘薯SSR引物的合成及多態(tài)性引物的篩選，得到14對多態(tài)性好的甘薯SSR引物；

(4)甘薯每份種質(zhì)資源的PCR擴增及帶型記錄；

(5)依據(jù)SSR標記的帶型數(shù)據(jù)，采用兩種取樣方法和三種遺傳距離構(gòu)建核心種質(zhì)；

(6)采用多態(tài)性位點數(shù)(NPL)、多態(tài)性位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和香農(nóng)信息指數(shù)(I)來評價原種質(zhì)、核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性，分別對核心種質(zhì)與原種質(zhì)及保留種質(zhì)的各指標進行t檢驗，來評價核心種質(zhì)的代表性；

(7)利用表型數(shù)據(jù)采用主坐標分析法以及均值差異百分率(MD)、方差差異百分率(VD)、極差符合率(CR)和變異系數(shù)變化率(VR)對構(gòu)建的甘薯核心種質(zhì)進行進一步的驗證。

作為優(yōu)選，步驟(3)中所述的14對多態(tài)性好的甘薯SSR引物分別為引物對CB283-F和CB283-R、引物對CB223-F和CB223-R、引物對CB200-F和CB200-R、引物對CB144-F和CB144-R、引物對CB141-F和CB141-R、引物對CB940-F和CB940-R、引物對IB3-F和IB3-R、引物對IB8-F和IB8-R、引物對IB10-F和IB10-R、引物對IB12-F和IB12-R、引物對IB13-F和IB13-R、引物對IB16-F和IB16-R、引物對IB19-F和IB19-R、引物對IB21-F和IB21-R，其分別具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.28所示的序列。

作為優(yōu)選，步驟(4)中PCR擴增的反應體系為10uL，其中：2×Es Taq MasterMix(Dye)為5uL，引物5‘10uM和引物3‘10uM分別為0.4uL，模板DNA 100ng/uL為0.2uL，ddH₂O補足至10uL。

作為優(yōu)選，所述的2×Es Taq MasterMix(Dye)的終濃度為1×，所述的引物5‘10uM和引物3‘10uM的終濃度均為0.4uM，所述的模板DNA 100ng/uL是終濃度為20ng。

作為優(yōu)選，步驟(4)中PCR擴增的反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性45s，45-62℃退火30s，72℃延伸45s，35個循環(huán)；72℃終延伸10min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明首次公開了一種基于SSR分子標記的甘薯核心種質(zhì)資源庫的構(gòu)建及評價方法。首先從保存的甘薯種質(zhì)資源頂端嫩葉中提取DNA，然后通過篩選出的多態(tài)性SSR引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增結(jié)果記錄各個種質(zhì)資源的帶型數(shù)據(jù)。對獲得的SSR標記“0”、“1”數(shù)據(jù)進行分析，依據(jù)整體聚類取樣各組種質(zhì)均能進入核心種質(zhì)的原則，采用位點優(yōu)先取樣法結(jié)合Jaccard遺傳距離構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)，同時利用表型數(shù)據(jù)進行評價確認。

(2)本發(fā)明的方法中SSR標記擴增帶型清晰穩(wěn)定，重復性好。同時，與基于農(nóng)藝性狀表型數(shù)據(jù)構(gòu)建核心種質(zhì)比較而言，基于分子標記數(shù)據(jù)構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)，具有省時省力、穩(wěn)定性好等特點。

(3)本發(fā)明的方法采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構(gòu)建的52份核心種質(zhì)，能夠以最小的資源份數(shù)最大限度地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性，代表性強，對甘薯核心種質(zhì)資源的保存、評價與創(chuàng)新利用都具有重要意義。

附圖說明

圖1為不同取樣條件下2種取樣策略和3種遺傳距離保留的多態(tài)性位點數(shù)；

其中：SM-SM遺傳距離；J-Jaccard遺傳距離；N-Nei&Li遺傳距離；P-位點優(yōu)先取樣法；R-隨機取樣法。

圖2為位點優(yōu)先取樣策略構(gòu)建的核心種質(zhì)與原種質(zhì)的主坐標圖；

其中，1-原種質(zhì)，2-核心種質(zhì)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步詳細的闡述，但本發(fā)明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：

1.材料與方法

1.1材料

378份甘薯種質(zhì)資源分別來自于國內(nèi)外甘薯種植區(qū)，分為4組，其中Ⅰ組來源于國內(nèi)南方薯區(qū)(297份)，Ⅱ組來源于國內(nèi)長江中下游薯區(qū)(51份)，Ⅲ組來源于國內(nèi)北方薯區(qū)(23份)，Ⅳ組來源于國外(7份)，以上材料均種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院明陽基地甘薯種質(zhì)資源圃中。

1.2方法

1.2.1材料的繁育和保存

甘薯種質(zhì)資源均通過大田和溫室大棚兩種方式雙份保存于資源圃中。

1.2.2甘薯種質(zhì)資源基因組DNA提取

在廣西農(nóng)業(yè)科學院明陽基地甘薯種質(zhì)資源圃中，選取378份甘薯種質(zhì)資源(表1)植株的頂部嫩葉，利用康為世紀的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取后的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量后，利用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白測定儀檢測DNA濃度，并稀釋到所需濃度。

1.2.3 SSR引物的合成及多態(tài)性引物的篩選

通過查閱文獻找尋甘薯相關SSR引物序列，共查找到目標SSR引物72對，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用表型性狀差異明顯的兩份種質(zhì)資源對72份引物進行篩查，篩選出多態(tài)性好的14對引物用于所有種質(zhì)資源材料的PCR擴增，多態(tài)性引物見(表3)。

1.2.4甘薯每份種質(zhì)資源的PCR擴增及帶型記錄

SSR-PCR反應采用康為世紀的2×Es Taq MasterMix(Dye)試劑進行PCR反應，擴增在BIO-RAD S 1000PCR儀上進行，擴增產(chǎn)物采用8％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，采用硝酸銀進行銀染，并記錄帶型數(shù)據(jù)。具體PCR反應體系見表2和表3：

表1 SSR-PCR反應體系

表2 PCR反應程序

1.2.5依據(jù)SSR標記的帶型數(shù)據(jù)，構(gòu)建核心種質(zhì)并進行構(gòu)建方法篩選和評價

1.2.5.1遺傳距離

采用NTSYSpc version 2.10e軟件使用UPGMA聚類法分別對SM遺傳距離、Jaccard遺傳距離和Nei&Li遺傳距離進行聚類。

1.2.5.2取樣策略

采用位點優(yōu)先取樣策略和隨機取樣策略對比構(gòu)建核心種質(zhì)。位點優(yōu)先取樣策略是指在聚類圖中，最先聚在一起的各組株系中，優(yōu)先選擇具有等位基因數(shù)最多的株系，若各組的兩個株系稀有等位基因數(shù)目相等，則優(yōu)先選擇具有最小等位基因頻率值的株系，若此數(shù)值仍然相同，那么進行隨機選擇，被選擇的株系再次進行聚類取樣；隨機取樣策略是指在聚類圖中，最先聚在一起的各組株系中，隨機保留某個株系，若某個組內(nèi)只有一個株系，則直接被保留，被保留的株系再次進行聚類取樣。

1.2.5.3取樣原則

在進行整體聚類抽樣時應保證每個采樣點都有種質(zhì)被抽取，如此進行逐步聚類直到其中某一組中再次聚類時無種質(zhì)被抽取。

1.2.5.4核心種質(zhì)的評價

原種質(zhì)、核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的遺傳多樣性采用多態(tài)性位點數(shù)(NPL)、多態(tài)性位點百分率(PPB)、觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)和香農(nóng)信息指數(shù)(I)來評價，以上參數(shù)采用POPGENE version 1.32軟件進行計算，利用DPS 14.50軟件分別對核心種質(zhì)與原種質(zhì)及保留種質(zhì)的各指標進行t檢驗，來評價核心種質(zhì)的代表性。

1.2.5.5核心種質(zhì)的確認

核心種質(zhì)的確認是利用表型數(shù)據(jù)及采用NTSYSpc version 2.10e軟件通過主坐標軸分析法來實現(xiàn)的，對核心種質(zhì)與原種質(zhì)間表型性狀的均值和方差分別進行F檢驗和t檢驗，用均值差異百分率(MD)、方差差異百分率(VD)、極差符合率(CR)和變異系數(shù)變化率(VR)來評價核心種質(zhì)的代表性。

MD＝(St/n)×100％

其中n為性狀總數(shù)，St為原種質(zhì)與核心種質(zhì)進行t測驗時在0.05水平上均值差異顯著的性狀個數(shù)；

VD＝(SF/n)×100％

其中n為性狀總數(shù)，SF為原種質(zhì)與核心種質(zhì)進行F測驗時得到在0.05水平上方差差異顯著的性狀個數(shù)；

其中N為性狀總數(shù)，R_I(i)為原種質(zhì)第i個性狀的極差，R_C(i)為核心種質(zhì)第i個性狀的極差；

其中n為性狀總數(shù)，CV_I(i)是原種質(zhì)第i個性狀的變異系數(shù)，CV_C(i)為核心種質(zhì)第i個性狀的變異系數(shù)；

2.結(jié)果與分析

2.1 14對SSR引物的遺傳多樣性分析

表3 14對SSR引物的多態(tài)性分析

從表3可知，14對SSR引物擴增的條代數(shù)為12-32條，遺傳多樣性指數(shù)變化范圍在0.2580-0.4164之間，香農(nóng)信息指數(shù)變化范圍在0.4075-0.6027之間。

2.2取樣方法比較及候選核心種質(zhì)的確認

從圖1可以看出，與采用隨機取樣法相比較，隨著整體聚類取樣次數(shù)的增加，采用位點優(yōu)先取樣方法所構(gòu)建的核心種質(zhì)其多態(tài)性位點數(shù)減少的較少。

表4第5次取樣后甘薯種質(zhì)資源的遺傳多樣性比較

結(jié)合圖1和表4的數(shù)據(jù)分析來看，SM遺傳距離、Jaccard遺傳距離和Nei&Li遺傳距離的有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)均為位點優(yōu)先取樣策略高于隨機取樣策略。所以，位點優(yōu)先取樣策略要優(yōu)于隨機取樣策略。同時考慮到各組取樣數(shù)的問題，根據(jù)整體聚類取樣原則，在第六次取樣時，第Ⅳ組的甘薯種質(zhì)未能進入核心種質(zhì)，因此選取位點優(yōu)先取樣策略第五次取樣后的3個種質(zhì)作為候選核心種質(zhì)進行進一步的比較。

2.3候選核心種質(zhì)的評價

表5原種質(zhì)與3個候選核心種質(zhì)t檢驗結(jié)果

三個候選核心種質(zhì)SM-P、J-P和N-P的取樣數(shù)分別為52份、52份和53份。從表5遺傳多樣性各指標與原種質(zhì)t檢驗結(jié)果可知，三個候選核心種質(zhì)在觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)與原種質(zhì)均無顯著差異。但J-P核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)與原種質(zhì)的差值均數(shù)最大。

由此可見，采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離選取52份種質(zhì)時，構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳多樣性最豐富，能夠以最小的資源份數(shù)最大限度地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性，初步確定為甘薯種質(zhì)構(gòu)建核心種質(zhì)的最優(yōu)取樣方法和取樣量。

表6原種質(zhì)、核心種質(zhì)(J-P)和保留種質(zhì)遺傳多樣性對比

從表6可知，核心種質(zhì)保留了原種質(zhì)13.76的種質(zhì)，保留種質(zhì)保留了原種質(zhì)86.24％的種質(zhì)，核心種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)、多態(tài)性位點數(shù)、多態(tài)性位點百分率的保留率分別與保留種質(zhì)持平，但核心種質(zhì)的有效等位基因數(shù)、基因多樣性指數(shù)、香農(nóng)信息指數(shù)的保留率分別高于保留種質(zhì)，可見核心種質(zhì)能很好的代表原種質(zhì)。

表7核心種質(zhì)(J-P)與保留種質(zhì)t檢驗結(jié)果

同時，對核心種質(zhì)和保留種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)分別作t測驗發(fā)現(xiàn)(表7)，核心種質(zhì)與保留種質(zhì)的差異均不顯著，而有效等位基因數(shù)、Nei’s基因多樣性指數(shù)和香農(nóng)信息指數(shù)均略大于保留種質(zhì)，所以應優(yōu)先考慮核心種質(zhì)。

2.4利用7對表型性狀數(shù)據(jù)對核心種質(zhì)進行確認

采用主坐標和7個表型性狀對位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構(gòu)建的核心種質(zhì)的代表性進行確認(圖2)，核心種質(zhì)遍布于整個主坐標圖，說明了核心種質(zhì)的代表性。對核心種質(zhì)和原種質(zhì)的各表型性狀指標分別作t測驗(表8)，除葉片寬外，核心種質(zhì)其余各性狀指標與原種質(zhì)均無顯著差異。從表9可以看出，核心種質(zhì)的均值差異百分率小于1％，極差符合率和變異系數(shù)變化率分別為89.69％和100.08％，均大于80％，所以所選核心種質(zhì)能夠代表原種質(zhì)的遺傳多樣性。研究結(jié)果從表型水平上進一步證明了位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離是一種較適宜的甘薯核心種質(zhì)構(gòu)建方法。

表8原種質(zhì)與核心種質(zhì)表型性狀的遺傳變異

注：t0.05＝1.9600，t0.01＝2.5758；F0.05＝2.5700，F(xiàn)0.01＝3.9400

表9原種質(zhì)與核心種質(zhì)性狀差異百分率

3.結(jié)論

本發(fā)明首次將SSR分子標記技術(shù)用于甘薯核心種質(zhì)的構(gòu)建與評價。

表10 52份甘薯核心種質(zhì)資源

結(jié)果如表10所示，采用位點優(yōu)先取樣策略和Jaccard遺傳距離構(gòu)建的52份核心種質(zhì)，能夠以最小的資源份數(shù)最大限度地代表原種質(zhì)的遺傳多樣性，代表性強，對甘薯核心種質(zhì)資源的保存、評價與創(chuàng)新利用都具有重要意義。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所

<120> 一種基于SSR分子標記構(gòu)建甘薯核心種質(zhì)資源庫的方法

<130> ZYWS

<160> 28

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaattatag gcttcactcc ag 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttaatgcagg caagcacgc 19

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caatgctgag gctcctctga atc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggaagttcc cacagttctg acc 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatccaaaga gaaaatggcg 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcagatcaga gatgaccgaa g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtcctgaat aaattgatcg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcgagaggt ggttcttctg 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaagtgaag gaaagggc 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gttgctgttc attgttgttc 20

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atccctattt cagctcac 18

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agaccttcac tgcctttcc 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gtagagttga agagcgagca 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccatagaccc attgatgaag 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggcgacacct tagagtat 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

caccccctat tcacaa 16

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctacgatctc tcggtgacg 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagcttctcc actccctac 19

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gatcgaggag aagctccaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gccggcaaat taagtccatc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

gtaccgagcc agacaggatg 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cctttgggat tggaacacac 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

gacttccttg gtgtagttgc 20

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

agggttaagc gggagact 18

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

ggctagtgga gaaggtcaa 19

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

agaagtagaa ctccgtcacc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

gacagtctcc ttctcccata 20

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ctgaagctcg tcgtcaac 18