本發(fā)明涉及一種采用微生物發(fā)酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，特別是一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺，英文名稱(chēng)：(S)-(+)-2,2-Dimethylcyclopropanecarboxamide，是合成西司他丁的中間體，在西司他丁的合成中有著重要的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中，(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的合成采取的生產(chǎn)工藝主要是：甘氨酸乙酯鹽酸鹽經(jīng)重氮化反應(yīng)制得重氮乙酸乙酯，與異丁烯在自制的手性催化劑—（R,R）-(+)-2,2＇-亞異丙基雙(4-叔丁基-2-噁唑啉)與三氟甲磺酸亞銅的絡(luò)合物催化下進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)環(huán)丙烷化反應(yīng)，制得(S)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯，堿性條件下水解，再與氯化亞砜反應(yīng)得到酰氯后氨解制得(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺。該制備方法存在的缺陷是制備成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、污染環(huán)境。為此，尋找一種操作簡(jiǎn)單、制備周期短，環(huán)境友好的制備(S)-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，成為現(xiàn)階段該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種采用微生物發(fā)酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，以解決現(xiàn)有的化學(xué)方法制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺中存在的產(chǎn)物收率低且環(huán)境污染嚴(yán)重的問(wèn)題。

本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案是這樣的。一種采用微生物發(fā)酵法制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，包括以下步驟：

（1）菌種繁殖

將赤紅球菌菌種接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌種繁殖的條件為：將濃度10⁹-10¹⁰個(gè)/ml的赤紅球菌菌種以0.1%-0.2%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

待步驟（1）中的菌種培養(yǎng)基OD₆₀₀為20-30，培養(yǎng)時(shí)間36-44小時(shí)，

pH5.5-6.0時(shí)，以5%-10%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25-30℃；

（3）細(xì)胞分離

將步驟（2）得到的發(fā)酵液進(jìn)行培養(yǎng)基分離，除去培養(yǎng)基，得到菌體；

（4）轉(zhuǎn)化原料

將菌體用30-50倍發(fā)酵液體積的純水混勻后逐滴加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰，控制反應(yīng)溫度25℃-28℃，滴加中維持2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰濃度小于10g/L，轉(zhuǎn)化結(jié)束后檢測(cè)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰濃度低于0.2g/L，則反應(yīng)結(jié)束，得到S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺和菌體的混合液；

（5）成品提取

用至少2倍量的氯仿或丙酮對(duì)上述混合液依次進(jìn)行萃取、過(guò)濾、脫色、蒸餾得到粗品，粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過(guò)濾、蒸餾，然后加入至少2倍量己烷或者甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。

優(yōu)選的，步驟（1），種子培養(yǎng)基中各組分濃度：葡萄糖 10-15g/L、K₂HPO₄ 0.3-0.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3-0.6g/L、磷酸二氫鉀 0.3-0.6g/L、尿素5.0-10g/L、味精 0.05-0.2g/L，酵母膏5-8g/L、種子培養(yǎng)基的pH為6.0-7.0。

優(yōu)選的，步驟（2），發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分濃度：葡萄糖 30-40g/L， K₂HPO₄10-15g/L，MgSO₄·7H₂O 15-20g/L，KH₂PO₄10-15g/L，尿素10-15g/L，味精1.0-3.0g/L，酵母膏5-10g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.0-7.0。

優(yōu)選的，步驟（3），細(xì)胞分離培養(yǎng)基采用超濾膜，即中空玻璃纖維膜分離，這樣可以連續(xù)操作除去培養(yǎng)基，操作時(shí)間短，生產(chǎn)效率高，并且保證細(xì)胞分離過(guò)程中不會(huì)被破壞。

本發(fā)明取得的有益效果如下：

提高了2,2-二甲基環(huán)丙烷甲腈的利用率，發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到35%以上。

發(fā)酵中采用單水相體系且提取操作中溶媒種類(lèi)少，用量小，環(huán)境污染小，成本低，降低了成品提取的難度，操作簡(jiǎn)單，環(huán)境友好。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明。需要指出的是，所給出的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺及煙酰胺的方法，包括如下步驟：

（1）菌種繁殖

將濃度10⁷個(gè)/ml的恥垢分枝桿菌菌種以2%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分：葡萄糖 12g/L、磷酸氫二鉀 0.5g/L、硫酸鎂·7H₂O 0.5g/L、磷酸二氫鉀 0.5g/L、尿素8g/L、味精 0.1g/L，酵母膏6g/L、種子培養(yǎng)基的pH為6.0-7.0。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

待步驟（1）中的菌種培養(yǎng)基OD₆₀₀為30時(shí)，以10%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；

發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：溫度25℃，發(fā)酵初始pH 6.0，溶氧量40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)周期44h。

（3）細(xì)胞分離

采用膜過(guò)濾，大約用水量為發(fā)酵液量體積的4-5倍體積將培養(yǎng)基除去，得到細(xì)胞。

（4）底物轉(zhuǎn)化

將步驟（3）中得到的菌體與30-50倍體積的純水混勻，而后逐滴加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰，保證底物濃度低于10 g/L，滴加溫度在25-28℃，滴加完成后檢測(cè)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰濃度低于0.1g/L，則反應(yīng)結(jié)束，得到S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺和菌體的混合液。

（5）成品提取

用4-6倍量的氯仿將所述混合液依次進(jìn)行萃取、脫色、過(guò)濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進(jìn)行脫色、過(guò)濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為39.0%，最終效價(jià)15.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量 99.40%。

實(shí)施例2

將實(shí)施例1中的滴加溫度改為在30℃，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為36.3%，最終效價(jià)14.5g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1發(fā)酵罐的接種量改為15%，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為39.3%，最終效價(jià)15.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1中將轉(zhuǎn)化底物的濃度改為20 g/L，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為30.6%，最終效價(jià)12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例5

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中溶氧量更改為20%，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為32.6%，最終效價(jià)13g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例6

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中溶氧量更改為30%，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為36.6%，最終效價(jià)14.6g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例7

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中溶氧量更改為40%，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為40.6%，最終效價(jià)16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例8

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中pH值更改為5.0-5.5，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為33.6%，最終效價(jià)13.4g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例9

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中pH值更改為5.5-6.0，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為40.6%，最終效價(jià)16.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例10

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中pH值更改為6.0-6.5，其余操作與實(shí)施例1相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為39.6%，最終效價(jià)15.8g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例11

將實(shí)施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中pH值更改為7.0-8.0，其余操作與實(shí)施例2相同。

測(cè)試結(jié)果：2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為30.6%，最終效價(jià)12.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

綜合分析實(shí)施例1、實(shí)施例5至實(shí)施例11，可見(jiàn)發(fā)酵培養(yǎng)的合適pH為弱酸性或中性環(huán)境；最合適的溶氧控制為30%-40%；最合適的發(fā)酵溫度為27-29℃；最合適的發(fā)酵接種量10%；轉(zhuǎn)化底物濃度控制低于10g/L；轉(zhuǎn)化溫度控制在24-28℃。

實(shí)施例12

單水相系統(tǒng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰，制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺的方法，包括如下步驟：

（1）菌種繁殖

將濃度10¹¹個(gè)/ml的赤紅球菌菌種以2%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分：葡萄糖12g/L，酵母膏6.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸鎂0.4g/L,磷酸氫二鉀0.4g/L,磷酸二氫鉀0.4g/L, PH值為6.5～7.0；

種子罐培養(yǎng)的條件為：溫度28±0.5℃，發(fā)酵初始pH 為7.0，溶氧量40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期36h；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

待步驟（1）中的菌種培養(yǎng)基OD₆₀₀為30時(shí)，以10%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)；

發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸氫二鉀1.5g/L,磷酸二氫鉀1.5g/L,誘導(dǎo)劑3ppm， PH值為6.5～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：溫度28℃，發(fā)酵初始pH 為7.0，溶氧量30%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)周期100h；

（3）細(xì)胞分離

將步驟（2）得到的發(fā)酵液分理處細(xì)胞，具體操作為采用連續(xù)膜過(guò)濾系統(tǒng)，用4-5倍體積的水洗，除去培養(yǎng)基，得到細(xì)胞。

（4）底物轉(zhuǎn)化

將步驟（3）得到的細(xì)胞，與30-50倍體積的純水混勻，而后開(kāi)始滴加轉(zhuǎn)化的底物。逐滴加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰，保證原料濃度低于10 g/L，滴加溫度在25-28℃，滴加完成后，檢測(cè)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰濃度低于0.1g/L，反應(yīng)結(jié)束，得到混合溶液。

（5）成品提取

用4-6倍量的氯仿將上述混合溶液依次進(jìn)行萃取、脫色、過(guò)濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進(jìn)行脫色、過(guò)濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。

測(cè)試結(jié)果： 2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為33.1%，最終效價(jià)13.2g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

實(shí)施例13

單水相系統(tǒng)發(fā)酵轉(zhuǎn)化底物制備S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺及煙酰胺的方法，包括如下步驟：

（1）菌種繁殖

將濃度10¹⁰個(gè)/ml的赤紅球菌菌種以3%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分：葡萄糖12g/L，酵母膏7.0g/L,味精0.1g/L,尿素0.8g/L,硫酸鎂0.4g/L,磷酸氫二鉀0.4g/L,磷酸二氫鉀0.4g/L, PH值為6.5～7.0；

種子罐培養(yǎng)的條件為：溫度28±0.5℃，發(fā)酵初始pH 為6.5，溶氧量45%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期36h；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)

待步驟（1）中的菌種培養(yǎng)基OD₆₀₀為30時(shí)，以10%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)；

發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分：葡萄糖35g/L，酵母膏9g/L,味精2.6g/L,尿素13g/L,硫酸鎂2g/L,磷酸氫二鉀1.5g/L,磷酸二氫鉀1.5g/L,誘導(dǎo)劑3ppm， PH值為6.5～7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：溫度28℃，發(fā)酵初始pH 為7.0，溶氧量30%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)周期100h；

（3）細(xì)胞分離

將步驟（2）得到的發(fā)酵液分理處細(xì)胞，具體操作為采用連續(xù)膜過(guò)濾系統(tǒng)，用4-5倍體積的水洗，除去培養(yǎng)基，得到細(xì)胞。

（4）底物轉(zhuǎn)化

將步驟（3）得到的細(xì)胞，與30-50倍體積的純水混勻，而后開(kāi)始滴加轉(zhuǎn)化的底物。逐滴加入2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰，保證底物濃度低于10 g/L，滴加溫度在25℃-28℃，滴加完成后，檢測(cè)2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰濃度低于0.1g/L,則反應(yīng)完全，得到混合溶液。

（5）提取

用4-6倍量的氯仿將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過(guò)濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進(jìn)行脫色、過(guò)濾、蒸餾，然后加入4倍量的甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。

測(cè)試結(jié)果： 2,2-二甲基環(huán)丙烷甲氰的轉(zhuǎn)化率為34.2%，最終效價(jià)13.7g/L，得到的S-(+)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酰胺含量大于99.0%。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。