本發(fā)明屬于農(nóng)作物病害檢測、鑒定及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及番茄晚疫病菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測引物組合物及其應(yīng)用，可用于番茄晚疫病菌快速、靈敏和特異的分子檢測，同時可用于番茄晚疫病的早期診斷和病菌的監(jiān)測和鑒定。

背景技術(shù)：

番茄 (Lycopersicon esculentum Miller) 別名西紅柿、洋柿子，在植物分類上屬于茄科 (Solanaceae) 番茄屬 (Lycopersicon)。番茄含有豐富的營養(yǎng)成分，既是蔬菜熟食和生食，又是水果，倍受廣大群眾的喜愛。據(jù)研究測定，每人每天食用 50～100 g鮮番茄，即可滿足人體對幾種維生素和礦物質(zhì)的需要。番茄中還含有豐富的抗氧化劑，可以防止自由基對皮膚的破壞，具有明顯的美容抗皺效果。隨著番茄在我國種植面積的不斷擴(kuò)大和種植指數(shù)的不斷指高，番茄病蟲害種類和危害程度也呈現(xiàn)逐年增加和加重的趨勢，其中，由晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染引起的番茄晚疫病是番茄生產(chǎn)上發(fā)生最普遍、危害最嚴(yán)重的病害之一，無論在露地還是保護(hù)地都造成重大損失，是一種流行性很強(qiáng)的毀滅性病害，一般年份減產(chǎn)20%-30%，嚴(yán)重時可達(dá)40%-60%，甚至絕收。番茄晚疫病常與番茄其它病害（如灰霉病、早疫?。┗旌习l(fā)生，而且發(fā)病初期癥狀具一定的相似性，常給病害的正確診斷造成極大的困難，在生產(chǎn)中常因病害診斷不準(zhǔn)確，未能達(dá)到實(shí)施“對癥下藥”的正確防治措施而致使病害造成慘重?fù)p失的現(xiàn)象時有發(fā)生。因此建立番茄晚疫病菌快速檢測體系，在發(fā)病初期或癥狀顯現(xiàn)之前對植株是否攜帶晚疫病菌進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測，這對于病害的準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)報(bào)、制定適時有效的防治措施、控制病害的傳播和流行（蔓延）以及減少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失都具有重要的理論和實(shí)際意義。

植物病原菌傳統(tǒng)的檢測方法是采用選擇性培養(yǎng)基從土壤、植物組織或水體中分離菌株，再對這些菌株的形態(tài)等進(jìn)行鑒定，來確定是否存在病原菌，或者用肉眼和借助顯微鏡技術(shù)對發(fā)病癥狀進(jìn)行判定。傳統(tǒng)的檢測方法不僅費(fèi)時、準(zhǔn)確度低，而且要求檢測人員要有豐富的經(jīng)驗(yàn)，最重要一點(diǎn)是易遺漏潛育期或隱癥的病害，以致延誤病害的防治，導(dǎo)致病害的暴發(fā)，因此傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法已不能滿足現(xiàn)代植物病理學(xué)研究的需要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，應(yīng)用PCR、血清免疫學(xué)等技術(shù)對病原菌進(jìn)行特異和快速分子檢測的成功例子已越來越多，但這些分子生物學(xué)技術(shù)在一定程度上也存在了一些不足之處，如血清免疫學(xué)檢測技術(shù)在血清的制備過程耗時耗力，常常受到抗血清質(zhì)量的影響，且可能存在交叉反應(yīng)，特異性較差，容易造成假陽性，PCR快速檢測技術(shù)主要包括常規(guī)PCR、巢式PCR（Nest-PCR）和實(shí)時熒光定量PCR等，PCR技術(shù)檢測時間較長，需要依靠PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)等貴重儀器設(shè)備，不利于基層生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，上述缺欠限制了這些先進(jìn)方法的推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)是由日本榮研公司開發(fā)的一種簡便、快速、準(zhǔn)確及廉價的核酸高效擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)可在60℃~65℃恒溫條件下，利用高活性的鏈置換DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 對目的DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增。在1小時內(nèi)，能夠?qū)⑸倭靠截悢?shù)的目的基因擴(kuò)增至10⁹~10¹⁰個拷貝數(shù)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)物不僅可以通過濁度儀、real-time PCR儀及凝膠電泳儀進(jìn)行檢測，而且還可以通過SYBR GreenⅠ、鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)染色后，肉眼識別。由于LAMP反應(yīng)簡單、快速、高效、經(jīng)濟(jì)，且無需特殊設(shè)備，檢測結(jié)果可由肉眼判斷，極適合于在基層生產(chǎn)部門推廣應(yīng)用，因而具有極為廣泛的應(yīng)用前景。目前LAMP檢測主要應(yīng)用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測，在植物病原菌檢測中報(bào)道較少，關(guān)于番茄晚疫病菌的LAMP檢測尚未見報(bào)道。在LAMP檢測中，國內(nèi)外多數(shù)研究人員主要利用rDNA/ITS序列為靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異引物來對植物病原菌進(jìn)行快速檢測、鑒定。然而疫霉屬卵菌的PCR分子檢測技術(shù)研究結(jié)果表明，rDNA/ITS在疫霉屬的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設(shè)計(jì)引物很難將兩個相似高的種區(qū)分開。因此要對疫霉屬病原菌進(jìn)行高靈敏性和特異性檢測，應(yīng)從疫霉菌其它基因上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測。目前用于疫霉菌PCR分子檢測的靶標(biāo)基因主要有elicitin 基因、Ras家族相關(guān)的Ypt1編碼基因、線粒體Cox1和Cox2編碼基因以及可能編碼儲存蛋白的Lpv基因等。

本發(fā)明旨在尋找番茄晚疫病菌中新的分子檢測靶標(biāo)基因。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，廣泛存在于真核生物中，在真核生物進(jìn)化上非常保守，目前尚無針對該靶標(biāo)基因進(jìn)行晚疫病菌分子檢測的報(bào)道。

本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)原理，選取疫霉菌β-tubulin基因?yàn)闄z測靶標(biāo)，在β-tubulin基因序列的6個區(qū)域設(shè)計(jì)了4條番茄晚疫病菌特異性引物，通過對反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立以SYBR Green Ⅰ為熒光顯色指示劑的番茄晚疫病菌可視化LAMP 檢測技術(shù)。該技術(shù)操作簡單、靈敏度和特異高，且無需貴重儀器設(shè)備，適宜于田間番茄晚疫病的早期診斷和病原菌的檢測和鑒定，對番茄晚疫病及時、有效的防治具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供用于檢測番茄晚疫病菌的LAMP引物組合物和應(yīng)用，針對現(xiàn)有技術(shù)中對番茄晚疫病菌檢測和鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征，方法耗時長、程序繁瑣、經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)、準(zhǔn)確度低，難以做到對病害發(fā)生的及時監(jiān)測和控制病原菌的傳播、流行的問題，以及現(xiàn)有PCR分子檢測需要依靠擴(kuò)增儀等貴重儀器，且檢測時間較長等問題，提供了番茄晚疫病菌新的分子檢測方法，對番茄晚疫病菌進(jìn)行LAMP檢測，檢測周期短、準(zhǔn)確性高、靈敏性高、肉眼觀察檢測結(jié)果。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的包括下列步驟（技術(shù)方案）：

1. 番茄晚疫病菌LAMP檢測特異性引物組合物的設(shè)計(jì)：通過測定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它鐮孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，對疫霉屬及其它病原菌不同種間β-tubulin基因序列進(jìn)行比對分析，利用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設(shè)計(jì)一套番茄晚疫病菌特異性LAMP引物組，由1對外側(cè)引物F3/B3和1對內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP組成，F(xiàn)3/B3和FIP/BIP引物序列如下：F3: 5’-GCCGATGAGGTCATGTGC-3’，B3: 5’-GTTCACGGCCAGCTTACG-3’，F(xiàn)IP: 5’-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3’，BIP: 5’-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA-3’。

2. 番茄晚疫病菌LAMP檢測方法的建立，包括以下步驟：

（1）提取待測樣品基因組DNA。

用于檢測病原菌純培養(yǎng)物時，采用CTAB法進(jìn)行提取基因組DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

用于檢測植物組織中存在番茄晚疫病菌時，采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μL加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增；

用于檢測土壤樣品中存在番茄晚疫病菌時，采用土壤DNA提取試劑盒，提取DNA。

（2）LAMP反應(yīng)體系的建立：以步驟（1）提取的DNA為模板，利用外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM外側(cè)引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL；

（3）LAMP反應(yīng)條件：64 ℃溫育60 min；

（4）反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黃色）判斷為陰性，不存在番茄晚疫病菌。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明建立了番茄晚疫病菌的快速、簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的LAMP檢測技術(shù)體系，可用于帶菌植株組織和土壤中番茄晚疫病菌的檢測，或用于番茄晚疫病的發(fā)病前期、初期檢測，對于確定病害防治的最佳時期具有十分重要的意義。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果：

1、特異性強(qiáng)、結(jié)果可靠：靶標(biāo)基因的選擇是LAMP檢測的重要因素之一。普通PCR常用的靶標(biāo)基因有核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)( Internal transcribed space ,ITS )，然而疫霉屬卵菌的分子檢測技術(shù)研究結(jié)果表明，rDNA-ITS在疫霉屬的近緣種之間變化很小，從ITS序列上設(shè)計(jì)引物很難將兩個相似高的種區(qū)分開。因此要對疫霉屬病原菌進(jìn)行高靈敏性和特異性檢測，應(yīng)從疫霉菌其它基因上設(shè)計(jì)引物進(jìn)行檢測。β-tubulin是真核生物看家（管家）基因之一，廣泛存在于真核生物中，在真核生物進(jìn)化上非常保守，種間存在豐富的變化，是相比rDNA‐ITS更好的分子檢測靶標(biāo)。本發(fā)明分析了番茄晚疫病菌β-tubulin基因和其他病原菌在序列上的差異，選取6個特定區(qū)域，設(shè)計(jì)了4條特異性的LAMP引物，6個區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，具有很強(qiáng)的特異性。本發(fā)明利用所設(shè)計(jì)出的LAMP引物基礎(chǔ)上建立了番茄晚疫病菌LAMP檢測方法，只有番茄晚疫病菌能檢測出來，其它病原菌均未檢測出，多次試驗(yàn)結(jié)果均一致，說明本發(fā)明LAMP檢測方法特異性強(qiáng)，結(jié)果可靠。

2、靈敏度高： 本發(fā)明對番茄晚疫病菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達(dá)到10fg/ μL，具有很高的靈敏性。

3、實(shí)用性好：本發(fā)明的LAMP檢測方法不像PCR檢測法需要要熱循環(huán)儀（PCR儀）等貴重儀器設(shè)備，這樣就擺脫了對熱循環(huán)儀等貴重設(shè)備的依賴，只要有穩(wěn)定的熱源，LAMP 反應(yīng)就可以發(fā)生，極大擴(kuò)展了LAMP使用的范圍。同時本發(fā)明的LAMP反應(yīng)只需在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束之后通過的顏色變化便可直接判斷結(jié)果，從而增加了其在帶菌的植株和土壤中檢測的應(yīng)用價值。

4、操作簡便快速：本發(fā)明提供的檢測番茄晚疫病菌的LAMP方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中番茄晚疫病菌的生物學(xué)檢測方法所需周期長、費(fèi)時費(fèi)力、繁瑣、特異性差及PCR檢測技術(shù)需要熱循環(huán)儀等貴重設(shè)備，無法快速檢測番茄晚疫病菌的問題。本發(fā)明檢測方法在64℃等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到番茄晚疫病菌，不需要復(fù)雜儀器，只需一個恒溫設(shè)備即可，能較好滿足對番茄晚疫病菌的現(xiàn)場檢測。

附圖說明

圖1 為本發(fā)明番茄晚疫病菌的LAMP特異性檢測。圖中1、2為番茄晚疫病菌，3-7分別為辣椒疫霉菌、大豆疫霉菌、煙草疫霉菌、惡疫霉菌、棕櫚疫霉菌，8為陰性對照，1-2顯示綠色熒光。

圖2 為本發(fā)明番茄晚疫病菌LAMP檢測靈敏性。圖中1-9模板DNA濃度分別為1ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg、100ag、10 ag，10為陰性對照，1-6顯示綠色熒光。

圖3 為本發(fā)明檢測方法對發(fā)病植株和帶菌土壤中番茄晚疫病菌的檢測。圖中1為陽性對照，2-3為番茄晚疫病發(fā)病葉片，4為番茄晚疫病發(fā)病田塊土壤，5-6為健康番茄葉片，7為高壓滅菌土壤，8為陰性對照， 1-4顯示綠色熒光。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述， 但不用來限制本發(fā)明的范圍。以下實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，或已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)中所述的操作技術(shù)規(guī)程，或按照廠商所建議的實(shí)驗(yàn)條件。

實(shí)施例 1：番茄晚疫病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測特異性引物組合物的設(shè)計(jì)及引物特異性驗(yàn)證

1.供試菌株基因組DNA的提取

采用CTAB 法提取供試菌株（表1）基因組 DNA，具體方法如下：取少量菌絲粉于1.5 mL離心管中（菌絲粉剛蓋過半圓形底部為宜），加入900 μL 2%CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）提取液（2% CTAB；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0；20 mmol/L EDTA，pH8.0；1.4 mol/L NaCl）和90 μL SDS（十二烷基苯磺酸鈉）【注：CTAB，SDS需60℃預(yù)熱】，使用振蕩器振蕩混勻，60℃水浴1h（DNA釋放至緩沖液中），12000 r·min^-1離心15 min；取上清液700 μL，加等體積酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比25:24:1），輕輕振蕩混勻，12000 r·min^-1離心9 min；取上清液500 μL，加入等體積氯仿再抽提一次，12000 r·min^-1離心5 min；取上清液350 μL，加入1/10體積3 mol·L^-1 NaAc和2倍體積無水乙醇，-20℃沉淀30 min，12000 r·min^-1離心5 min；棄去上清液，加入700μL 冰70%乙醇進(jìn)行洗滌（稍離心；傾掉上清液），在超凈工作臺上晾干無酒精味，加入30~60 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA，pH 8.0） 溶液進(jìn)行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度計(jì)檢測 DNA 濃度并稀釋至100 ng/μL待用。

表1 供試菌株

2. 番茄晚疫病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）特異引物組合物的設(shè)計(jì)

通過測定番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）和其它鐮孢菌（Phytophthora spp）的β-tubulin基因序列，對疫霉屬及其它病原菌不同種間β-tubulin基因序列進(jìn)行比對分析，利用在線LAMP引物設(shè)計(jì)軟件Primer software Explorer V4 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html; Eiken Chemical Co., Japan)設(shè)計(jì)一套黃瓜枯萎病菌特異性LAMP引物組，由1對外側(cè)引物F3/B3和1對內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP組成，F(xiàn)3/B3和FIP/BIP引物序列發(fā)下：F3: 5’-GCCGATGAGGTCATGTGC-3’，B3: 5’-GTTCACGGCCAGCTTACG-3’，F(xiàn)IP:5’-AGTGGGGGTGGTGAGCTTCACTG-GACAATGAGGCCCTGTA-3’，BIP:5’-GGTGACCTGAACCACTTGGTGTGTTC- AGCTGACCGGGGAA- 3’。

3.番茄晚疫病菌LAMP檢測方法的建立及引物特異性驗(yàn)證

以表1供試菌株的DNA為模板，利用外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM外側(cè)引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：64 ℃溫育60 min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法進(jìn)行測定。待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，存在番茄晚疫病菌，橙色（橘黃色）判斷為陰性，不存在番茄晚疫病菌。

4.引物特異性驗(yàn)證結(jié)果

LAMP擴(kuò)增結(jié)果表明，供試的菌株中只有番茄晚疫病菌顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，其余疫霉菌和真菌顯色結(jié)果為橙色（附圖1），說明所設(shè)計(jì)的番茄晚疫病菌外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP可以將番茄晚疫病菌與其它病原菌區(qū)分開來，具有種的特異性，可用于番茄晚疫病菌快速可靠的檢測和鑒定。

實(shí)施例2：番茄晚疫病菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測靈敏度測定

1.不同濃度基因組DNA的制備

用無菌超純水對番茄晚疫病菌基因組DNA進(jìn)行稀釋，配制成10倍數(shù)量級的系列濃度備用；

2. LAMP檢測方法靈敏度測定及結(jié)果觀察

以不同濃度的番茄晚疫病菌基因組DNA為模板，利用外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM外側(cè)引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，不同濃度DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：64 ℃溫育60 min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法進(jìn)行測定，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

3. LAMP擴(kuò)增靈敏度檢測結(jié)果

LAMP擴(kuò)增靈敏度檢測結(jié)果表明，1ng、100pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg/μL濃度的番茄晚疫病菌基因組DNA顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，其余濃度及陰性對照顯色結(jié)果為橙色，說明所設(shè)計(jì)的番茄晚疫病菌外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP通過LAMP擴(kuò)增，對番茄晚疫病菌的檢測靈敏度可達(dá)10 fg/μL（附圖2）。

實(shí)施例3：發(fā)病組織中番茄晚疫病菌的LAMP檢測

樣品采集：從福建周寧、三明、連城采集番茄晚疫病發(fā)病癥狀典型的葉片及健康葉片帶回實(shí)驗(yàn)室備用；

植物組織DNA的提取：采用NaOH快速裂解法提取DNA，具體過程如下：向每毫克植物組織中加入10μL 0.5 mol/L NaOH，在研缽中將組織充分磨碎成糊后轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，12,000 rpm離心6 min，取上清液5 μL加入495μL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）混合均勻，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

LAMP擴(kuò)增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM外側(cè)引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：64 ℃溫育60 min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法進(jìn)行測定，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

檢測結(jié)果：檢測結(jié)果（附圖3）表明，番茄晚疫病發(fā)病的葉片通過LAMP擴(kuò)增，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，說明存在番茄晚疫病菌，而健康葉片及陰性對照顯色結(jié)果為橙色，說明不存在番茄晚疫病菌，該套技術(shù)能用于植物組織中番茄晚疫病菌的快速分子檢測。

實(shí)施例4：帶菌土壤中番茄晚疫病菌的LAMP檢測

樣品采集：從福建周寧、三明和連城番茄晚疫病發(fā)病嚴(yán)重的田塊采集植株根部土壤帶回實(shí)驗(yàn)室備用，以高壓滅菌的土壤為對照；

土壤DNA提?。翰捎肧igma公司的土壤DNA提取試劑盒（Sigma,DNB100,Soil DNA Isolation Kit）提取土壤中的總DNA，取1.0 μL作為PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增。

LAMP擴(kuò)增檢測及觀察：以上述提取的DNA為模板，利用外側(cè)引物F3/B3和內(nèi)側(cè)引物FIP/BIP進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，LAMP檢測反應(yīng)體系為25 μL，包括5 μM外側(cè)引物F3和B3各1.0 μL，40 μM內(nèi)側(cè)引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反應(yīng)混合液【40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄， 1.6 mol/L甜菜堿(Betaine)，2.0 mM dNTPs，0.2% Trion X-100】 12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，DNA模板1.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足至25μL；LAMP反應(yīng)條件：64 ℃溫育60 min；反應(yīng)結(jié)果的測定：采用熒光染料目測觀察法進(jìn)行測定，待LAMP反應(yīng)結(jié)束后，在LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色劑SYBR greenⅠ1.0 μL，顯色結(jié)果觀察到綠色熒光的判斷為陽性，橙色（橘黃色）判斷為陰性。

檢測結(jié)果：檢測結(jié)果（附圖3）表明，番茄晚疫病發(fā)病嚴(yán)重田塊土壤DNA通過LAMP擴(kuò)增，顯色結(jié)果可觀察到綠色熒光，說明存在番茄晚疫病菌，而高壓滅菌土壤及陰性對照顯色結(jié)果為橙色，說明不存在番茄晚疫病菌，該套技術(shù)可用于土壤中番茄晚疫病菌的快速分子檢測。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 用于檢測番茄晚疫病菌的LAMP引物組合物和應(yīng)用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccgatgagg tcatgtgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gttcacggcc agcttacg 18

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtgggggtg gtgagcttca ctggacaatg aggccctgta 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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