本發(fā)明屬于抗癌藥物設(shè)計(jì)、合成領(lǐng)域，具體涉及香豆素衍生物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著城市化、工業(yè)化進(jìn)程的加速，環(huán)境污染和食品安全問(wèn)題日益突出，加之人們不良生活方式和行為習(xí)慣的影響，癌癥已成為嚴(yán)重影響人類健康、威脅人類生命的重大疾病之一，是人類在二十一世紀(jì)期待攻克的主要難題之一。癌癥不僅給病人造成身體和精神上的折磨，還給患者家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，同時(shí)造成勞動(dòng)力的巨大損失和社會(huì)資源的驚人消耗，因此如何治愈這一嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，減少病人的痛苦，已成為全世界各國(guó)的首要任務(wù)。
化學(xué)治療(chemotherapy)，簡(jiǎn)稱化療，是目前使用最廣泛的一類治療癌癥以及非癌癥疾病的方法，主要是利用化學(xué)合成類藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。常用的抗腫瘤化療藥有阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核、順鉑等。這些小分子化合物除了可以通過(guò)被動(dòng)運(yùn)輸或者借助于載體的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)以外，還可以通過(guò)與一些親和試劑如DNA當(dāng)中的嘌呤結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯或引發(fā)細(xì)胞凋亡，達(dá)到化療的目的，化療在臨床腫瘤治療方面已經(jīng)取得了顯著的效果。
香豆素是一類重要的天然香料，大量存在于自然界的一些植物如黑香豆、胡蘿卜、芹菜、香菜以及柑橘類當(dāng)中，對(duì)人類的健康有很大的幫助。由于香豆素具有成本低且副作用小的特點(diǎn)而被用作補(bǔ)充和替代藥物，被用于抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化和抗凝等方面。經(jīng)過(guò)對(duì)腎癌細(xì)胞的體外活性研究表明，7-羥基香豆素不僅具有非常好的細(xì)胞毒性而且也是有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，這種香豆素對(duì)幾種人癌細(xì)胞系(如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞系以及淋巴癌細(xì)胞系)和異種移植模型都有非常好的體外活性。低聚乙二醇單甲醚是一種兩親性分子，在香豆素衍生物上引入低聚乙二醇單甲醚可以改善香豆素衍生物的兩親性，提高香豆素衍生物的生物相容性。本發(fā)明致力于合成一系列香豆素衍生物，并研究了它們的離體抗腫瘤活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一類香豆素衍生物及其制備方法和應(yīng)用，通過(guò)小分子哌嗪和低聚乙二醇單甲醚鏈的引入，使得所制得的香豆素衍生物具有良好的兩親性，這有利于藥物在生物體內(nèi)的代謝和細(xì)胞對(duì)藥物的攝??；從而得到了一種具有較高生物相容性，毒副作用小，抗癌活性高的新藥；本發(fā)明合成的化合物結(jié)構(gòu)單一，產(chǎn)品容易提純；合成方法比較簡(jiǎn)單，副反應(yīng)少，產(chǎn)率較高，原料易得，成本低，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一、一種香豆素衍生物，具有通式Ⅰ的結(jié)構(gòu)：
，n=1～3
制備方法包括以下步驟：
（1）以化合物、炔丙醇為起始原料，合成化合物1，其結(jié)構(gòu)式為：
（2）接著以化合物，n=1～3和化合物1為起始原料，合成化合物Ⅰ。
具體制備方法為：
步驟（1）具體制備方法為：將化合物、炔丙醇、三苯基磷和DEAD按摩爾比為1:2:2:5加入到50 mL圓底燒瓶中，以無(wú)水四氫呋喃作溶劑，冰浴下反應(yīng)1小時(shí)，然后轉(zhuǎn)到室溫反應(yīng)過(guò)夜；反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，所得粗產(chǎn)物以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑經(jīng)硅膠柱色譜純化分離后得到化合物1，產(chǎn)率為50%-58%；
步驟（2）具體制備方法為：將化合物，n=1～3和化合物1按摩爾比2:1加入至7 mL DMF和水的混合液中，然后再將0.1-1當(dāng)量的CuSO4·5H2O、0.2-2當(dāng)量的抗壞血酸鈉加入至混合液中，室溫下劇烈攪拌24小時(shí)；反應(yīng)液用CH2Cl2 和水萃?。挥袡C(jī)層經(jīng)無(wú)水Na2SO4 干燥后減壓旋干；然后以二氯甲烷-甲醇為洗脫劑，硅膠柱層析分離得到化合物Ⅰ，產(chǎn)率為75%-80%。所述的DMF和水的混合液中：DMF和水的體積比為6:1。
所述的香豆素衍生物Ⅰ，均可用于制備化學(xué)治療的藥物。
化學(xué)治療是目前使用最廣泛的一類治療癌癥以及非癌癥疾病的方法，主要是利用化學(xué)合成類藥物來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。常用的抗腫瘤化療藥有阿霉素、柔紅霉素、絲裂霉素、氟脲嘧啶脫氧核、順鉑等。香豆素是一類重要的天然香料，對(duì)人類的健康有很大的幫助。香豆素不僅具有非常好的細(xì)胞毒性而且也是有效的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，這種香豆素對(duì)幾種人癌細(xì)胞系(如胃癌、結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞系以及淋巴癌細(xì)胞系)和異種移植模型都有非常好的體外活性。本發(fā)明合成了一系列香豆素衍生物，母體通過(guò)用哌嗪和聚乙二醇單甲醚修飾從而增加了其抗癌活性和生物相容性。
本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)：
（1）合成路線設(shè)計(jì)合理，步驟簡(jiǎn)單，反應(yīng)容易實(shí)現(xiàn)，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高，分離純化簡(jiǎn)單；
（2）該系列香豆素衍生物具有較強(qiáng)的抗癌活性，有利于化學(xué)治療；
（3）兩親性基團(tuán)的引入提高了抗癌藥物的生物相容性，使得其具有較好的抗腫瘤效果；
（4）產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一，組分明確，所用原料低廉，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
以下具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)闡述關(guān)于本發(fā)明中相關(guān)化合物的制備過(guò)程、純化方法、理化性質(zhì)表征以及離體抗腫瘤活性測(cè)試，以便全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制此發(fā)明，本發(fā)明并不僅局限于以下實(shí)例。
實(shí)施例1（n=1）
（1）向50 mL圓底燒瓶中加入25 mL無(wú)水四氫呋喃，然后將該反應(yīng)瓶置于冰水浴中，加入三苯基磷 (2.05 g，7.82 mmol)，攪拌溶解后依次加入化合物 (1.43 g，5.21 mmol)、炔丙醇 (0.61 mL，10.43 mmol)和DEAD(4.1 mL，26.05 mmol)；所得混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜；TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，減壓蒸餾除去溶劑，所得粗產(chǎn)物以二氯甲烷-甲醇 (15:1，v/v)為洗脫劑經(jīng)硅膠柱色譜分離純化得白色固體 (0.94 g，58％)。
結(jié)構(gòu)表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ7.50 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.91 (m, 2 H, ArH), 4.74 (d, J = 2.4 Hz, 2 H, CH2C≡C-), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.62 (br s, 4 H, NCH2), 2.55 (t, J = 2.4 Hz, 1 H, CH≡C-), 2.46 (s, 3 H, CH3), 2.42 (s, 3 H, CH3)；高分辨質(zhì)譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計(jì)算值 (m/z[M+H+])為313.1552，實(shí)際測(cè)試值為313.1545。
（2）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol) 和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌5分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.09 g，0.62 mmol)和 (0.10 g，0.31 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24 h；TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾掉無(wú)水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用二氯甲烷-甲醇(10:1, v/v)為洗脫機(jī)經(jīng)硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.11 mg，78﹪)。
結(jié)構(gòu)表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ8.05 (s, 1 H, triazole-H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.38 (m, 2 H, ArH), 5.66 (s, 2 H, OCH2) 4.82 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 4.05 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.68-3.70 (m, 2 H, CH2), 3.43-3.46 (m, 2 H, CH2), 3.26 (s, 3 H, CH3), 3.17 (br s, 4 H, NCH2), 2.84 (br s, 4 H, NCH2), 2.48 (s, 3 H, CH3), 2.29 (s, 3 H, CH3); 高分辨質(zhì)譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計(jì)算值 (m/z[M+H+])為457.2325，實(shí)際測(cè)試值為457.2316。
實(shí)施例2（n=2）
（1）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌5分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.13 g，0.70 mmol)和 (0.11g，0.35 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24 h。TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾掉無(wú)水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)為洗脫機(jī)經(jīng)硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.13 mg，70﹪)。
結(jié)構(gòu)表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.72 (s, 1 H, triazole-H), 7.62 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 7.05 (m, 2 H, ArH), 5.86 (s, 2 H, OCH2), 4.42 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.95 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.78-3.80 (m, 2 H, CH2), 3.68-3.74 (m, 4 H, CH2), 3.52-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 3 H, CH3), 3.18 (br s, 4 H, NCH2), 2.74 (br s, 4 H, NCH2), 2.54 (s, 3 H, CH3), 2.48 (s, 3 H, CH3); 高分辨質(zhì)譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計(jì)算值 (m/z[M+H+])為501.2587，實(shí)際測(cè)試值為501.2577。
實(shí)施例3（n=3）
（1）向10 mL的圓底燒瓶中加入1 mL水，再加入抗壞血酸鈉 (30 mg，0.15 mmol)和五水硫酸銅 (15 mg，0.06 mmol)，所得混合物在氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌數(shù)分鐘，再往上述溶液中加入用6 mL DMF溶解的化合物 (0.2 g，0.86 mmol)和 (0.13 g，0.43 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24 h；TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，將DMF旋干，并用二氯甲烷和少量甲醇溶解，將溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加水，用30 mL二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相并用無(wú)水硫酸鈉干燥。過(guò)濾掉無(wú)水硫酸鈉，減壓旋蒸除去溶劑，粗產(chǎn)物用二氯甲烷-甲醇(10:1，v/v)為洗脫機(jī)經(jīng)硅膠柱色譜純化后，得淺黃色固體 (0.17 mg，72﹪)。
結(jié)構(gòu)表征：1H NMR (400 MHz, CDCl3)：δ7.68 (s, 1 H, triazole-H), 7.53 (d, J = 8.8 Hz, 1 H, ArH), 6.93 (m, 2 H, ArH), 5.36 (s, 2 H, OCH2) 4.22 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.89 (t, J = 4.8 Hz, 2 H, CH2), 3.74-3.76 (m, 2 H, CH2), 3.64-3.70 (m, 4 H, CH2), 3.60-3.61 (m, 4 H, CH2), 3.54-3.56 (m, 2 H, CH2), 3.38 (s, 3 H, CH3), 3.20 (br s, 4 H, NCH2), 2.65 (br s, 4 H, NCH2), 2.49 (s, 3 H, CH3), 2.44 (s, 3 H, CH3); 高分辨質(zhì)譜[HRMS (ESI)]：C18H20N2O3理論計(jì)算值 (m/z[M+H+])為545.2849，實(shí)際測(cè)試值為545.2835。
應(yīng)用實(shí)例 1
對(duì)本發(fā)明實(shí)施例1-3所制得的化合物的離體光動(dòng)力抗腫瘤活性進(jìn)行了初步探究，為今后在體實(shí)驗(yàn)研究提供重要的參考，具有重要的研究?jī)r(jià)值；化合物的離體光動(dòng)力抗腫瘤活性是通過(guò)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來(lái)完成的，所用方法是MTT法；MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞中因無(wú)琥珀酸脫氫酶而不產(chǎn)生甲瓚。用二甲基亞砜（DMSO）溶解活細(xì)胞產(chǎn)生的甲瓚，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定其在570 nm波長(zhǎng)處的吸收值（OD值），可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT甲瓚形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。對(duì)本發(fā)明所涉及到的化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行了研究，并獲得了各個(gè)化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的半數(shù)抑制濃度即IC50值，由此可以初步判斷藥物的抗腫瘤活性。
MTT實(shí)驗(yàn)具體過(guò)程包括：取處于對(duì)數(shù)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胃癌細(xì)胞BGC-823，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，吹打均勻后用DMEM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）配制成3×103cells/ mL細(xì)胞懸浮液，每孔加100 μL細(xì)胞懸浮液（約含3000個(gè)腫瘤細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組即空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組即溶劑對(duì)照組。先將實(shí)施例1-3制得的香豆素衍生物配制成DMSO儲(chǔ)備液，使用前用DMEM將藥物稀釋為7個(gè)不同濃度，終溶液中 DMSO的含量為1%。每個(gè)濃度設(shè)定6個(gè)平行孔，每孔加入200 μL不同濃度的藥物后置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：加藥孵育24小時(shí)后，棄去上層培養(yǎng)基，加入100 μL不含藥的新鮮培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后，每孔加入MTT的PBS溶液（5 mg·mL-1）10 μL，37℃孵育4小時(shí)，小心棄去上層溶液，向每孔中加入100 μL DMSO溶解甲瓚，于搖床中震蕩15分鐘使甲瓚完全溶解后，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處OD值。
通過(guò)MTT法探索了實(shí)施例1-3制得的化合物對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的殺傷效果。所得數(shù)據(jù)經(jīng)三次平行實(shí)驗(yàn)后由GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理得到，結(jié)果以Mean±SD來(lái)表示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，3種化合物都對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823表現(xiàn)出強(qiáng)的殺傷作用，其半數(shù)抑制濃度見(jiàn)表1。比較研究發(fā)現(xiàn)，鏈的長(zhǎng)短對(duì)化合物的活性沒(méi)有明顯的影響。研究表明，所述的系列香豆素衍生物都具有較強(qiáng)的抗癌活性。
表1 實(shí)施例1-3制得的香豆素衍生物對(duì)人胃癌細(xì)胞BGC-823的IC50值
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。