本發(fā)明屬于植物病害防治領域，涉及一種檢測方法，具體涉及一種基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速檢測方法。

背景技術：

在包括中國、印度在內的東亞、中亞及南亞地區(qū)，桑樹作為一種重要的用于養(yǎng)蠶的經濟植物被廣泛栽種，人們主要利用其桑葉喂養(yǎng)家蠶，而在包括土耳其和希臘在內的大多數(shù)歐洲國家，人們栽種桑樹主要是用來生產桑椹。桑椹作為功能性食品的潛在來源，因具有眾多的生物活性及藥理作用而備受關注。研究表明其具有很好的抗氧化、消炎、保護神經、抗癌、降血糖及降血脂等眾多活性。隨著蠶桑產業(yè)的轉型及人們對桑椹眾多保健、藥理活性的認識，國內逐漸新興大量果桑及果葉兩用桑園。發(fā)展果桑不僅是土地增收的一個新興產業(yè)，也是蠶桑轉型和升級改造的一大途徑。果桑栽培面積逐年大幅度增加，僅重慶市的果葉兩用桑種植面積累計達數(shù)十萬畝。但其極易感染致命的菌核病(俗稱桑白果病，是肥大型菌核病、縮小性菌核病、小粒性菌核病的統(tǒng)稱)，嚴重時發(fā)病率高達90％以上，毀產絕收，如防治不及時，連年重復感染，使桑農蒙受嚴重經濟損失。該病成為了阻礙果桑產業(yè)化發(fā)展的瓶頸。

桑椹菌核病是果桑產業(yè)目前所面臨的最致命病害，其在我國長江中下游地區(qū)及韓國報道較多，其菌核可在土壤中存活數(shù)年，循環(huán)侵染桑椹，發(fā)病嚴重時甚至顆粒無收。

目前桑椹菌核病的檢測和診斷采用的是傳統(tǒng)方法，即根據(jù)桑椹發(fā)病癥狀進行經驗性粗略判斷，或者采集樣本進行病原菌的分離純化，然后根據(jù)柯赫氏法則進行確診。該方法具有以下缺點：

1、需等到表現(xiàn)出相關癥狀后才能發(fā)現(xiàn)染病。但此時已是“癌癥晚期”，幾乎無可救藥，即便噴藥防治，也純屬“亡羊補牢”，見效甚微。因為該病從病原菌浸染到桑果大量發(fā)病，歷程很短，病勢兇猛，一旦顯示癥狀，桑園中大部分病果已至感染后期，全是菌包不可食用，損失慘重。

2、耗時長、經驗性強。要確診，需要分離純化出病原菌，然后進行形態(tài)學觀察、常規(guī)分子鑒定、反接感染等手段進行確診，耗時長達數(shù)十天，甚至比桑果期都長。

因此，在前人研究的基礎之上開發(fā)出新型快速、精準的桑椹菌核病病原菌檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義，其不僅能實行早期預測預報，有更充分的時間采取防治措施，同時還能對新桑園及引進種苗等進行檢疫。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速檢測方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速檢測方法，包括以下步驟：

(1)以CTAB法提取的組織樣品DNA作為模板，采用通用引物ITS1/ITS4進行第一輪PCR擴增；

(2)以第一輪產物為模板進行第二輪PCR擴增，巢式引物采用肉阜狀杯盤菌的特異性引物，序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；

(3)根據(jù)步驟(2)的擴增條帶診斷桑椹小粒性菌核病。

優(yōu)選的，步驟(1)中的樣品為桑椹。

優(yōu)選的，步驟(1)中，第一輪PCR擴增的條件如下：95℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火50s，72℃延伸50s，32個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃，∞。

優(yōu)選的，步驟(1)中，通用引物ITS1/ITS4的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

優(yōu)選的，步驟(2)中，第二輪擴增條件類似第一輪，將退火溫度設置成56、58、60、62或64℃等不同梯度，以此找到每種引物最適條件。

進一步優(yōu)選的，第二輪擴增的退火溫度為56、58、60或62℃。

一對肉阜狀杯盤菌引物，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

上述的一對肉阜狀杯盤菌引物的篩選方法，是以桑實杯盤菌、核地杖菌、核盤菌及桑莖點霉為對照，將NCBI中的相應病菌ITS序列，以ClustalX 2進行多序列比對，ESPript 3.0進行差異分析，Primer 5.0進行引物的設計及評估而得。

本發(fā)明的有益效果在于：

真菌基因組編碼核糖體的基因中，由18S、5.8S及28S rDNA組成一個轉錄單元，其中的間隔區(qū)為內轉錄間隔區(qū)域(Internal Transcribed Spacer，ITS)。ITS區(qū)域包括ITS1及ITS2兩個區(qū)域，其中ITS1位于18S和5.8S之間，ITS2位于5.8S和28S之間。由于ITS1和ITS2進化相對迅速，具有一定的種間特異性和種內保守性，已經成為真菌(尤其是絲狀真菌)分類鑒定的研究重點。本發(fā)明采用了巢式PCR，其具有快速、高特異性等特點，以ITS作為第一輪擴增引物，特異性巢式引物作為第二輪擴增引物進行桑椹菌核病病原快速檢測，方法可行，且具有較廣的退火溫度，能實行早期預測預報，有更充分的時間采取防治措施，同時還能對新桑園及引進種苗等進行檢疫。經驗證，本發(fā)明的檢測方法具有極佳的準確性及特異性，并大大提高了檢測靈敏度。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：

圖1為不同病原菌ITS序列比對結果；

圖2a和圖2b為不同退火溫度的巢式PCR結果，其中的6個泳道分別為M-marker，1-56℃，2-58℃，3-60℃，4-62℃，5-64℃；圖2a為sample1的結果，圖2b為sample2的結果；

圖3a和圖3b為快速檢測方法的應用結果。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。

材料與試劑

材料：采于重慶市北碚區(qū)西里蠶種場桑園及重慶市蠶業(yè)科學技術研究院桑園的病桑果，見表1。

表1.所用兩份材料

試劑：主要試劑如表2所示。

表2.主要試劑

相關試劑的配置：

1M Tris-HCl的配置：精確稱量121.1g Tris置于1L燒杯中。加入約800mL的去離子水，充分攪拌溶解。加入約42mL濃鹽酸調節(jié)pH到8.0。將溶液定容到1L。高溫高壓滅菌后，室溫保存。

0.5M EDTA(pH 8.0)的配置：在400mL水中加入90.05g二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2·2H2O)，攪拌溶解，用NaOH調pH至8.0(約10g NaOH顆粒)，定容至500mL，高壓滅菌。

4×CTAB：CTAB 4g，NaCl 16.364g，1M Tris-HCl 20mL(PH8.0)，0.5M EDTA 8mL。先用70mL ddH₂O溶解，定容至100mL并高壓滅菌。使用前加1mLβ-巰基乙醇。

儀器與設備：

試驗所用主要儀器設備如表3所示

表3.主要儀器設備

實施例1：

巢式引物的設計：

從NCBI(National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術信息中心，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/)上下載傳統(tǒng)三種(肥大性(桑實杯盤菌)、小粒性(肉阜狀杯盤菌)、縮小性(核地杖菌))桑椹菌核病病原菌ITS序列(核盤菌及桑莖點霉為對照)，以ClustalX 2進行多序列比對，ESPript 3.0進行差異分析，Primer 5.0進行引物的設計及評估，得到每種桑椹菌核病病原菌的特異性引物，其比對結果如圖1所示。

所下載相關序列如表4所示。

表4.桑椹菌核病病原菌的ITS序列登錄號

引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

桑椹菌核病快速檢測方法的建立：

以巢式PCR作為快速檢測桑椹菌核病病原菌的方法，以CTAB法(劉麗，張永軍，許長征，羅鋒，一種改良的CTAB法提取產多糖真菌DNA，中國生物工程雜志，2014，34(5)：75-79)提取的組織樣品DNA作為模板，采用通用引物ITS1/ITS4進行第一輪PCR擴增，引物序列(本文所列引物序列均默認為5′—3′方向)為：ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG，如SEQ ID NO.3所示)與ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC，如SEQ ID NO.4所示)(購自華大基因)，以第一輪產物為模板進行第二輪PCR擴增，巢式引物采用前述的相應特異性引物，擴增體系均采用25μL體系，具體用量如表5所示。

表5.PCR擴增體系具體用量

第一輪PCR擴增條件如表6所示。

表6.第一輪PCR擴增參數(shù)

第二輪擴增條件類似第一輪，將退火溫度設置成56、58、60、62或64℃等不同梯度，以此找到每種引物最適條件。

實施例2：

快速檢測方法的驗證

引物特異性的理論檢驗：

將實施例1中設計的引物帶入常見桑樹真菌病害ITS序列中進行比對，對其特異性進行初步檢驗。

引物特異性的實踐檢驗：

以兩份材料(詳見表1)對實施例1中建立的方法進行檢驗，對表1中的材料進行擴增。

將巢式PCR擴增后的產物通過膠回收試劑盒回收后鏈接至pMD 19-T載體，連接體系如表7所示。

表7.連接體系

充分混勻后，16℃連接4h。

連接產物轉化感受態(tài)大腸桿菌后于Amp(ampicillin，氨芐青霉素)抗性平板上進行篩選，挑斑擴增后，進行菌液PCR檢測，并將陽性克隆菌液送至華大基因測序。

快速檢測方法的初步應用：

2016年春季于重慶市北碚區(qū)不同地區(qū)桑園桑椹菌核病高發(fā)田塊采集未表現(xiàn)病癥且未成熟的桑椹，共計被分作14份，具體情況見表8，采用上述方法進行檢測。

表8.所采集的未成熟桑椹

實施例3：

實施例2的實驗結果與分析：

不同菌核病病原菌ITS序列比對結果：

利用ClustalX 2進行比對后發(fā)現(xiàn)，同一病原菌不同菌株ITS序列無差別，故最終選取桑實杯盤菌、肉阜狀杯盤菌、核地杖菌、核盤菌和桑莖點霉五組進行比對分析，其結果如圖1所示，利用Primer 5.0結合圖1所設計的引物如表9所示。

表9.所設計出的巢式引物序列

菌核病快速檢測方法的建立：

利用表9中的引物對表1中的兩種材料進行梯度PCR測定，引物SW-XL2F/1R(肉阜狀杯盤菌)的預期片段大小為366bp，測定結果如圖2a和圖2b所示，從圖2a和圖2b中可以看出溫度對三對引物影響不大，除了64℃時擴增效果不太好以外，56～62℃均可。但圖2a和圖2b中依稀可見700bp附近有一微弱雜帶，其可能為桑樹ITS序列；500bp左右有一微弱雜帶，可能是所用模板(第一輪擴增產物)濃度過高引起的。且擴增產物濃度略高，存在一些拖尾現(xiàn)象。總體而言，該方法具有一定可行性，且具有較廣的退火溫度。

桑椹菌核病快速檢測方法的驗證結果見表10。

表10.引物特異性的理論驗證

特異性引物的理論驗證如表10所示，從表10中可看出，所設計的引物只能在特定病原菌內檢測到，其他桑樹真菌病害無相同片段，理論上具有一定的特異性。

通過測序表明，擴增產物同預期片段完全吻合(如SEQ ID NO.5所示)，表明該方法具有準確性及特異性。

SW-XL2F/SW-XL1R 366bp

CAGGCCAATCTCATCACACACTATTTTTTATCGTCTGAGCACTATATAACATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGTAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTGGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATATAGCCATCAAGAGGCGTAGCCTGGGAACAGGGTATAGCCAGCTTGGTATTGAGCCGTGTCAGCGATGGCAGGCTCTAAAATCAGTGGCGGCGCCGTTGGGTCCTGAACGTAGTAACCTCTCGTTACGGGCCTCGACGGCTTCCGCCTATCAATTCTACG，如SEQ ID NO.5所示。

快速檢測方法的應用結果：

利用本發(fā)明建立的快速檢測方法對14份未表現(xiàn)癥狀且未成熟桑椹進行檢測，結果如圖3a和圖3b所示，第一輪ITS1/ITS4引物擴增后，僅a1-a4這4份樣本擴增出了病原真菌ITS序列(大小500bp左右)，還有c1、c2等8份樣品中擴增出了一條500～1000bp范圍內條帶，其可能為桑樹ITS序列。雖然第一輪的ITS1/ITS4引物在14份樣本中僅擴增出4份，但第二輪巢式引物擴增后，絕大部分樣本均能擴增出相應條帶，表明此方法能大大提高檢測的靈敏度，能檢出常規(guī)單次PCR所不能檢出的更低限度，同時產物經回收克隆測序后與預期片段完全一致，表明了此方法具有很好的特異性，亦說明北碚地區(qū)主要桑園感染桑椹菌核病情況較為嚴重。

最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大學

<120> 基于巢式PCR的桑椹小粒性菌核病病原菌早期快速檢測方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肉阜狀杯盤菌SW-XL2F

<400> 1

caggccaatc tcatcacaca ct 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肉阜狀杯盤菌SW-XL1R

<400> 2

cgtagaattg ataggcggaa gc 22

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITS1

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ITS4

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 5

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SW-XL2F/ SW-XL1R

<400> 5

caggccaatc tcatcacaca ctatttttta tcgtctgagc actatataac attaaaactt 60

tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa 120

tgtgaattgc agtagtgaat catcgaatct ttgaacgcac attgcgccct tgggtattcc 180

gaagggcatg cctgttcgag cgtcatatag ccatcaagag gcgtagcctg ggaacagggt 240

atagccagct tggtattgag ccgtgtcagc gatggcaggc tctaaaatca gtggcggcgc 300

cgttgggtcc tgaacgtagt aacctctcgt tacgggcctc gacggcttcc gcctatcaat 360

tctacg 366