本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種生物法制備苯乙酸的方法。
背景技術(shù)：
：苯乙酸是一種重要的有機(jī)化合物，由于其具有羧基、亞甲基氫和苯環(huán)的典型反應(yīng)，可以生成多種中間體，因此在醫(yī)藥、香料、農(nóng)藥等行業(yè)應(yīng)用廣泛，尤其是在青霉素工業(yè)鹽的生產(chǎn)上具有巨大的需求量。目前，苯乙酸的合成路線多達(dá)數(shù)十種，其中常見的有：氰化鈉法、苯乙烯法、苯乙酮法以及芐基鹵化物羰化法。國(guó)內(nèi)苯乙酸的生產(chǎn)主要采用氰化鈉法，該方法主要分為兩步，首先由氯芐和氰化鈉合成苯乙腈，隨后通過酸堿水解法將苯乙腈轉(zhuǎn)化為苯乙酸。然而，在苯乙腈水解生產(chǎn)為苯乙酸的過程中，由于需要強(qiáng)酸強(qiáng)堿的參與以及持續(xù)保持高溫的過程，能耗較高。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主要目的在于提供一種生物法制備苯乙酸的方法，該方法的反應(yīng)條件溫和、能耗低并且原料苯乙腈的轉(zhuǎn)化率較高。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的解決方案是：一種生物法制備苯乙酸的方法，其包括如下步驟：將苯乙腈分批次加入轉(zhuǎn)化液中，在轉(zhuǎn)化pH為6.0‐9.0和轉(zhuǎn)化溫度為20‐40℃的條件下反應(yīng)5‐20個(gè)批次，待上一批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70％‐100％后終止反應(yīng)，得到苯乙酸；其中，苯乙腈所分批次的數(shù)目可以為7‐15，優(yōu)選為8‐12。下一批次的苯乙腈的添加時(shí)間為：待上一批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到80％‐95％后加入下一批次，優(yōu)選為85％‐90％。轉(zhuǎn)化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌。該轉(zhuǎn)化液的制備方法包括如下步驟：(1)、將E.coli工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離心以得到靜息細(xì)胞；(2)、收集靜息細(xì)胞，并將其懸浮在pH為6.0‐9.0的緩沖液中，得到轉(zhuǎn)化液。每批次所加入的苯乙腈的量可以相等，為0.1‐20mL/g靜息細(xì)胞，也可以為0.3‐10mL/g靜息細(xì)胞，還可以為0.5‐1mL/g靜息細(xì)胞。在步驟(1)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分及含量如下：酵母膏16‐60gL‐1、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步驟(2)中的轉(zhuǎn)化液中，靜息細(xì)胞的濃度大于10gL‐1，優(yōu)選為10‐100gL‐1，更優(yōu)選為10‐50gL‐1，最優(yōu)選為10‐20gL‐1。步驟(2)中的緩沖液為NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液、KH2PO4/K2HPO4緩沖液中和Tris‐HCl緩沖液的任意一種。步驟(2)中還添加了苯乙腈的助溶劑，助溶劑為體積分?jǐn)?shù)為1％‐25％的甲醇、乙醇、異丙醇和正己烷中的任意一種或幾種；步驟(2)中的緩沖液的濃度可以為20‐200mM。助溶劑的體積分?jǐn)?shù)可以為5％‐10％。轉(zhuǎn)化pH可以為7‐9，優(yōu)選為7‐8.5，更優(yōu)選為7.95‐8.10。轉(zhuǎn)化溫度可以為25‐37℃，優(yōu)選為30℃。由于采用上述方案，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用生物法來制備苯乙酸，其先將苯乙腈分為若干體積相等的批次，每隔一定時(shí)間將一批次苯乙腈加入轉(zhuǎn)化液中(每批次所加入的苯乙腈的量也相等)，然后在pH為6.0‐9.0和溫度為20‐40℃的條件下反應(yīng)，待上一批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到一定程度后再加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到一定程度后終止反應(yīng)，得到苯乙酸。由上述可知，本發(fā)明的方法以苯乙腈為起始原料，利用高密度發(fā)酵獲得的靜息細(xì)胞(用于分泌MG腈水解酶)為生物催化劑，并采用具有較高水解活性的MG腈水解酶和苯乙腈的分批次加入工藝相結(jié)合來生產(chǎn)苯乙酸，不僅工藝路線簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和以及沒有污染，而且能夠通過不斷控制苯乙腈的加入量來實(shí)現(xiàn)苯乙酸的高濃度積累，使單批次反應(yīng)苯乙酸積累濃度高達(dá)1M，苯乙腈的轉(zhuǎn)化率大于99％，從而具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。另外，本發(fā)明的方法成本低廉，能耗也較低?？傊鄬?duì)于現(xiàn)有技術(shù)而言，由MG腈水解酶介導(dǎo)的苯乙腈水解為苯乙酸的過程反應(yīng)所需條件溫和，能夠有效地降低能耗，對(duì)環(huán)境友好，成為苯乙酸生產(chǎn)的一條有效取代途徑。附圖說明圖1為本發(fā)明的靜息細(xì)胞催化水解苯乙腈制備苯乙酸反應(yīng)進(jìn)程曲線圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開了一種生物法制備苯乙酸的方法，該方法包括如下步驟：(1)、將用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，離心以得到靜息細(xì)胞；(2)、收集步驟(1)所得的靜息細(xì)胞，將該靜息細(xì)胞懸浮于pH為6.0‐9.0的緩沖液中，得到轉(zhuǎn)化液，故該轉(zhuǎn)化液含有用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌；(3)、將苯乙腈分批次加入轉(zhuǎn)化液中，在pH為6.0‐9.0和溫度為20‐40℃的條件下反應(yīng)5‐20個(gè)批次，待上一批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70％‐100％后加入下一批次，待最后批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70％‐100％后終止反應(yīng)，得到苯乙酸。其中，在步驟(1)中，MG腈水解酶是由BCJ2315腈水解酶突變而來的，BCJ2315腈水解酶來自BurkholderiacenocepaciaJ2315。用于分泌MG腈水解酶的E.coli工程菌詳見Wang等人在AppliedandEnvironmentMicrobiology,2015,81:24公開的非專利文獻(xiàn)《ProteinEngineeringofaNitrilasefromBurkholderiacenocepaciaJ2315forEfficientandEnantioselectiveProductionof(R)‐ο‐ChloromandelicAcid》的記載。步驟(1)中的發(fā)酵培養(yǎng)基含有以下組分并且每種組分的含量(如表1所示)如下：酵母膏16‐60g/L、蛋白胨12‐80gL‐1、甘油1‐500mlL‐1、K2HPO424.75gL‐1、KH2PO43.47gL‐1、MgSO41gL‐1。在步驟(1)中，還可以根據(jù)實(shí)際情況添加發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基(如表2所示)。在步驟(2)所得的轉(zhuǎn)化液中，靜息細(xì)胞的濃度應(yīng)大于10gL‐1，優(yōu)選為10‐100gL‐1，更優(yōu)選為10‐50gL‐1，最優(yōu)選為10‐20gL‐1。催化反應(yīng)所需的MG腈水解酶是通過靜息細(xì)胞分泌的，所以靜息細(xì)胞的濃度影響的是MG腈水解酶的濃度。而MG腈水解酶的濃度越高則相對(duì)的催化效率越高，即單位時(shí)間內(nèi)苯乙腈的轉(zhuǎn)化量越高。步驟(2)中的緩沖液為NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液、KH2PO4/K2HPO4緩沖液中、Tris‐HCl緩沖液或其他任何常用pH緩沖液中的任意一種。步驟(2)中除了添加緩沖液外，還可以添加苯乙腈的助溶劑，助溶劑為體積分?jǐn)?shù)為1％‐25％的甲醇、乙醇、異丙醇和正己烷中的任意一種或幾種。該緩沖液的濃度可以為20‐200mM，助溶劑的添加量可以為5％‐10％(v/v)。在步驟(3)中，每批次的苯乙腈的反應(yīng)條件均相同，均在轉(zhuǎn)化pH為6.0‐9.0和轉(zhuǎn)化溫度為20‐40℃的條件下反應(yīng)。當(dāng)前一個(gè)批次的反應(yīng)結(jié)束后，要重新檢測(cè)pH值和溫度并判斷其是否在上述范圍內(nèi)，若不在，則需要將反應(yīng)條件重新調(diào)整為初始反應(yīng)條件，即pH為6.0‐9.0中的任意一個(gè)數(shù)值和溫度為20‐40℃中的任意一個(gè)數(shù)值。例如，對(duì)轉(zhuǎn)化時(shí)pH的調(diào)節(jié)可以采用氨水、NaOH溶液或者Na2CO3溶液進(jìn)行。其中，氨水的濃度可以為1M到純氨水，優(yōu)選為2‐10M，更優(yōu)選為4‐8M，最優(yōu)選為6M。轉(zhuǎn)化時(shí)pH和溫度直接對(duì)MG腈水解酶的活力即MG腈水解酶的催化效率產(chǎn)生影響。酶的活力在不同的轉(zhuǎn)化溫度或者不同的轉(zhuǎn)化pH條件下是不同的。本發(fā)明選擇的轉(zhuǎn)化溫度與轉(zhuǎn)化pH適于酶的最佳催化效率的發(fā)揮。在步驟(3)中，苯乙腈所分成的批次的數(shù)目還可以為7‐15，優(yōu)選為8‐12。在步驟(3)中，每批次的苯乙腈的加入需要在前一批次苯乙腈反應(yīng)達(dá)到一定程度之后。例如，前一批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70％‐100％后加入下一批次，優(yōu)選為80％‐95％，更優(yōu)選為85％‐90％。在步驟(3)中，每批次所加入的苯乙腈的量相等，為0.1‐20mL/g靜息細(xì)胞，優(yōu)選為0.3‐10mL/g靜息細(xì)胞，更優(yōu)選為0.5‐1mL/g靜息細(xì)胞。在整個(gè)反應(yīng)過程中，MG腈水解酶的催化效率由于受到苯乙腈毒性的影響，是逐漸降低的，從而導(dǎo)致每批次苯乙腈的轉(zhuǎn)化效率是逐漸降低的，因此，上一批次的苯乙腈必須在達(dá)到一定的轉(zhuǎn)化率后再加入下一批次的苯乙腈，這樣能夠促使反應(yīng)朝著終產(chǎn)物苯乙酸的方向移動(dòng)。隨著苯乙腈加入批次數(shù)目的增加，每批次苯乙腈的加入量可以適當(dāng)降低，或者每批次苯乙腈的反應(yīng)時(shí)間可以適當(dāng)增加。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，通過采用適當(dāng)延長(zhǎng)每批次的反應(yīng)時(shí)間的方式，已經(jīng)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率。作為本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，靜息細(xì)胞催化水解苯乙腈制備苯乙酸反應(yīng)進(jìn)程曲線圖如圖1所示。圖1的縱坐標(biāo)表示濃度，橫坐標(biāo)表示時(shí)間，■圖例代表苯乙腈的濃度變化，●圖例代表苯乙酸的濃度積累。由圖1可知，苯乙酸生成量能夠達(dá)到1M，由于反應(yīng)過程中向轉(zhuǎn)化液中添加苯乙腈以及氨水造成的反應(yīng)液體積的膨脹，實(shí)際檢測(cè)濃度會(huì)低于1M。由此可知，本發(fā)明的制備苯乙酸的方法反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，單批次濃度積累高，生產(chǎn)安全簡(jiǎn)便，無任何副產(chǎn)品，不污染環(huán)境。本發(fā)明的測(cè)定MG腈水解酶活性的方法和下列實(shí)施例中酶活力的單位特定義如下：在pH8.0的50mM的NaH2PO4/Na2HPO4緩沖體系中，以100mM的苯乙腈為底物，20mg/ml(濕重)的靜息細(xì)胞濃度下，30℃下震蕩30min，2M鹽酸終止反應(yīng)，HPLC方法檢測(cè)苯乙腈轉(zhuǎn)化情況。若苯乙腈轉(zhuǎn)化完全，則認(rèn)為該批次細(xì)胞酶活力合格，可用于進(jìn)行后續(xù)苯乙酸的制備。以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例本實(shí)施例公開了一種生物法制備苯乙酸的方法，其包括如下步驟：(1)、取出在‐80℃下保藏的E.coli工程菌，在LB瓊脂平板上進(jìn)行接種，之后于37℃培養(yǎng)過夜；(2)、挑取LB瓊脂平板上的單克隆菌落，并將其接種于LB液體培養(yǎng)基中，之后于37℃培養(yǎng)過夜；(3)、從過夜培養(yǎng)后的LB液體培養(yǎng)基中取適量菌液，接種于LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)8h，之后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(如表1所示，最終pH值為7)中，于37℃培養(yǎng)至OD600為20，然后加入適量IPTG，降溫至30℃繼續(xù)培養(yǎng)16h，離心收集菌體(取沉淀物)，用pH為8.0的NaH2PO4/Na2HPO4緩沖液洗滌兩次，得到靜息細(xì)胞；在37℃培養(yǎng)的過程中可以視情況添加發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基。發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基是為了提高靜息細(xì)胞的發(fā)酵濃度，而不斷的向發(fā)酵培養(yǎng)基中補(bǔ)加的營(yíng)養(yǎng)成分。理論上當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基當(dāng)中的碳源消耗至較低水平時(shí)即開始添加，實(shí)際操作過程中則通過觀察發(fā)酵液的pH變化情況，當(dāng)pH開始升高(一般反應(yīng)3‐4h)時(shí)則開始添加發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基(如表2所示)。(4)、取20g靜息細(xì)胞加入到1L100mMpH為8.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中，然后加入100mL乙醇，攪拌均勻，使靜息細(xì)胞懸浮在pH為6.0‐9.0的Na2HPO4/NaH2PO4緩沖液中，得到轉(zhuǎn)化液；(5)、將苯乙腈分為5個(gè)批次，先將第一批次加入轉(zhuǎn)化液中，加入量為11.5ml/L，在pH為7.95‐8.10和溫度為30℃的條件下反應(yīng)，待該批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％后加入下一批次，并視情況重新調(diào)節(jié)pH為7.95‐8.10和溫度為30℃，以此類推，直至加入第五批次，待第五批次的苯乙腈的轉(zhuǎn)化率達(dá)到100％后終止反應(yīng)，得到苯乙酸。表1發(fā)酵培養(yǎng)基的組分含量表組分含量酵母膏16‐60gL‐1蛋白胨12‐80gL‐1甘油1‐500mlL‐1K2HPO424.75gL‐1KH2PO43.47gL‐1MgSO41gL‐1表2發(fā)酵補(bǔ)料培養(yǎng)基的組分含量表組分含量酵母膏60gL‐1蛋白胨80gL‐1甘油500ml上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員能理解和使用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3