本發(fā)明涉及一種生物
技術(shù)領(lǐng)域:
的PCR檢測(cè)方法,具體是一種能同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù):
:現(xiàn)有的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》GB14922.2-2011中對(duì)病原體的檢測(cè)方法——以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清型分析和特殊鑒定實(shí)驗(yàn)為主。在臨床實(shí)踐中,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌是人畜共患病的條件致病菌,且易混合感染。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如分離培養(yǎng)、免疫學(xué)試驗(yàn)等費(fèi)時(shí)費(fèi)力,不適于臨床快速診斷,也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)狀。傳統(tǒng)方法存在過(guò)程繁瑣,費(fèi)時(shí),檢出率低和漏檢等缺陷。為了滿足大樣本的多種病原體的快速檢測(cè),急需一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確率高的多重PCR檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)多種病原體的三重PCR檢測(cè)方法,其步驟簡(jiǎn)單,檢測(cè)快速,準(zhǔn)確性高,易于標(biāo)準(zhǔn)化,克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的。隨著PCR的核酸檢定技術(shù)成功在臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用,建立多重PCR新技術(shù)檢測(cè)成為可能。多重PCR(multiplexPolymeraseChainReaction)是在普通PCR的基礎(chǔ)上加以改進(jìn),一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物,針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增出多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。其可在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種病原體的特異性引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可用于同時(shí)檢測(cè)多種病原體或不同型病原體?;诖耍景l(fā)明本著一次性檢測(cè)就可以檢出樣品中三種病原體的目標(biāo),首先從已發(fā)表的文獻(xiàn)中篩選出具有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的保守性序列的基因及細(xì)菌通用的基因,作為PCR檢測(cè)的靶點(diǎn),分別合成擴(kuò)增對(duì)應(yīng)保守序列的特異性引物,將4對(duì)引物同時(shí)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中,通過(guò)各項(xiàng)優(yōu)化,建立直接從樣本中一次性檢測(cè)三種病原體的三重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明還通過(guò)檢測(cè)糞便改進(jìn)取材,進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)利用該三重PCR方法快速檢測(cè)實(shí)際樣品的目的。具體的,本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:一種同時(shí)檢測(cè)多種病原體的三重PCR檢測(cè)方法,包括以下步驟:(1)篩選出具有金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的保守性序列的基因和細(xì)菌通用的基因,作為PCR檢測(cè)的靶點(diǎn),分別合成擴(kuò)增對(duì)應(yīng)保守序列的特異性引物;(2)將4對(duì)引物同時(shí)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中,擴(kuò)增出目的基因片段;(3)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;其中,擴(kuò)增金黃色葡萄球菌上游引物的序列如表1a所示,下游引物的序列如表1b所示;擴(kuò)增綠膿桿菌上游引物的序列如表1c所示,下游引物的序列如表1d所示;擴(kuò)增肺炎克雷伯桿菌上游引物的序列如表1e所示,下游引物的序列如表1f所示;擴(kuò)增細(xì)菌通用上游引物的序列如表1g所示,下游引物的序列如表1h所示。具體見(jiàn)表1:表1引物序列及PCR產(chǎn)物名稱(chēng)引物序列(5’–3’)產(chǎn)物大小金黃色葡萄球菌aCACCTGAAACAAAGCATCCTAA153bpbTATACGCTAAGCCACGTCCAT綠膿桿菌cATGATCGTACAAATTGGTCGG600bpdGTCATGAAACCGCCAGTC肺炎克雷伯桿菌eTGGCCCGCGCCAGGGTTCGAAA368bpfGATGTCGTCATCGTTGATGCCCAG通用引物gAGAGTTTGATCCTGGCTCAG520bphGCGGCTGCTGCACG本發(fā)明中,步驟(1),由于對(duì)引物的退火溫度,片段長(zhǎng)度等要求,最終選定金黃色葡萄球菌的nuc基因、綠膿桿菌的LasI基因、肺炎克雷伯桿菌的PhoE基因,細(xì)菌通用的16SrRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物。本發(fā)明中,步驟(2),PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,引物6.5μl,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl、0.25μl,DNA各1μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足;反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;進(jìn)入94℃30s,60℃30s,72℃30s的循環(huán),共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。本發(fā)明中,步驟(3),PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠中,120V電泳30min。本發(fā)明中,實(shí)際檢測(cè)樣品前先選擇人工感染樣本驗(yàn)證體系檢測(cè)能力,再取待檢測(cè)樣本糞便,提取被檢病原體的DNA,作為模板,進(jìn)行三重PCR檢測(cè),全過(guò)程僅需要4h;并且通過(guò)檢測(cè)糞便改進(jìn)取材,進(jìn)一步達(dá)到利用該三重PCR方法快速無(wú)創(chuàng)檢測(cè)無(wú)創(chuàng)實(shí)際樣品的目的。而常規(guī)的檢測(cè)方法需要培養(yǎng)基接種,一般需24h長(zhǎng)出菌落,再生化接種,此過(guò)程時(shí)間較長(zhǎng),并且對(duì)檢測(cè)人員的技能要求高。本發(fā)明較常規(guī)方法縮短了檢測(cè)時(shí)間,能進(jìn)一步達(dá)到快速檢測(cè)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的目的。本發(fā)明取得如下有益效果:(1)由于反應(yīng)體系中加入由16SrRNA基因設(shè)計(jì)的細(xì)菌通用引物,作為內(nèi)質(zhì)控,在病原菌檢測(cè)中可以根據(jù)通用引物擴(kuò)增條帶的情況判定反應(yīng)體系是否完好及評(píng)估體系中加入的模板質(zhì)量。因此較常規(guī)的PCR和多重PCR檢測(cè)方法,本發(fā)明的三重PCR檢測(cè)方法具有快速、靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的特點(diǎn),同時(shí)降低了對(duì)檢測(cè)人員的要求、檢測(cè)平臺(tái)和檢測(cè)成本,提高了檢測(cè)效率。(2)該方法體系通過(guò)檢測(cè)糞便改進(jìn)取材,進(jìn)一步達(dá)到利用該三重PCR方法快速無(wú)創(chuàng)檢測(cè)實(shí)際樣品的目的。附圖說(shuō)明圖1是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用的三重PCR體系引物濃度的優(yōu)化結(jié)果;其中:M為100bpDNALadder;金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌上下游引物各為1μl,泳道1-4:細(xì)菌通用的上下游引物分別為1μl、0.5μl、0.25μl、0.0125μl。圖2是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用的三重PCR體系退火溫度的優(yōu)化結(jié)果;其中:M為100bpDNALadder;泳道1:56℃;泳道2:58℃;泳道3:60℃;泳道4:62℃。圖3是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用的三重PCR人工感染樣本的檢測(cè)結(jié)果;其中:M為100bpDNALadder;泳道1:三重PCR陽(yáng)性對(duì)照;泳道2:三重PCR陰性對(duì)照;泳道3、8:糞便陰性對(duì)照;泳道4、9:金黃色葡萄球菌;泳道5、10:綠膿桿菌;泳道6、11:肺炎克雷伯桿菌;泳道7、12:金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌。圖4是金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用的三重PCR樣本的檢測(cè)結(jié)果;其中:M為100bpDNALadder;泳道1:三重PCR陽(yáng)性對(duì)照;泳道2:三重PCR陰性對(duì)照;泳道3-12:樣本的糞便。具體實(shí)施方式本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施,給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程,但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR體系退火溫度的優(yōu)化(1)樣品前處理將標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌分別在相應(yīng)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中培養(yǎng),其中金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌培養(yǎng)和肺炎克雷伯桿菌培養(yǎng)24h,收集菌液或菌落提取相應(yīng)的DNA樣本。(2)細(xì)菌DNA提取本發(fā)明采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA,步驟如下:將上述3種病原體菌液或菌落溶于緩沖液GA,震蕩懸??;加入20μlProteinaseK溶液,混勻,加入220μl緩沖液GB,震蕩15s,70℃10min,加入220μl無(wú)水乙醇,充分震蕩混勻;將溶液和沉淀都加入一個(gè)吸附柱中,12000rpm離心30s,棄廢液;向吸附柱加500μl緩沖液GD,12000rpm離心30s,棄廢液;向吸附柱加600μl緩沖液PW,12000rpm離心30s,棄廢液;重復(fù)一次;收集沉淀,30μlTE溶解。(3)多重PCR反應(yīng)體系建立在PCR反應(yīng)體系中,尤其是多重PCR反應(yīng)體系中,引物濃度和退火溫度是關(guān)鍵的影響因素。本發(fā)明為了找到合適的三重PCR體系的引物濃度和退火溫度,進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):引物濃度的優(yōu)化:反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl,細(xì)菌通用的上下游引物分別為1μl、0.5μl、0.25μl、0.0125μl,DNA各1μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足,反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;進(jìn)入94℃30s,60℃30s,72℃30s的循環(huán),共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物10μl在2.5%瓊脂糖凝膠中,120V電泳30min。結(jié)果如圖1顯示3泳道較好。退火溫度的優(yōu)化:PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,引物6.5μl(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl、0.25μl),DNA各1μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足。反應(yīng)條件僅將退火溫度分別設(shè)置為56℃,58℃,60℃,62℃,其余不變。結(jié)果如圖2顯示3泳道較好。(4)結(jié)果PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,引物6.5μl,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl、0.25μl,DNA各1μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足,反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;進(jìn)入94℃30s,60℃30s,72℃30s的循環(huán),共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。實(shí)施例2金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR人工樣本的檢測(cè)(1)樣品前處理取待檢測(cè)動(dòng)物的樣本糞便。(2)細(xì)菌DNA提取同實(shí)施例1(3)多重PCR反應(yīng)體系建立PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,引物6.5μl,其中,金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl、0.25μl,DNA分別為陽(yáng)性對(duì)照3μl,陰性對(duì)照0μl,樣本糞便各3μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;進(jìn)入94℃30s,60℃30s,72℃30s的循環(huán),共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物10μl在2.5%瓊脂糖凝膠中,120V電泳30min。(4)結(jié)果金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示:1陽(yáng)性對(duì)照;2陰性對(duì)照;3、8糞便的陰性對(duì)照;4、9金黃色葡萄球菌;5、10綠膿桿菌;6、11肺炎克雷伯桿菌;7、12金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌。由結(jié)果看出,該三重PCR檢測(cè)體系可以分別檢出金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌。實(shí)施例3金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR樣本的檢測(cè)(1)樣品前處理取待檢測(cè)活體動(dòng)物的樣本糞便。(2)細(xì)菌DNA提取同實(shí)施例1(3)多重PCR反應(yīng)體系建立PCR反應(yīng)體系為50μl,包括:Mix25μl,引物6.5μl(金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、肺炎克雷伯桿菌和細(xì)菌通用上下游引物分別為1μl、1μl、1μl、0.25μl),DNA分別為陽(yáng)性對(duì)照3μl,陰性對(duì)照0μl,樣本糞便各3μl,其余無(wú)菌水補(bǔ)足至50μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min;進(jìn)入94℃30s,60℃30s,72℃30s的循環(huán),共30個(gè)循環(huán);72℃終延伸7min。PCR產(chǎn)物10μl在2.5%瓊脂糖凝膠中,120V電泳30min。(4)結(jié)果金黃色葡萄球菌、綠膿和肺炎克雷伯桿菌的三重PCR樣本的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示:1陽(yáng)性對(duì)照;2陰性對(duì)照;3-12樣本的糞便。陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照良好,10糞便為綠膿桿菌陽(yáng)性,其余樣本的檢測(cè)為陰性,與傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果一致。10號(hào)擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序驗(yàn)證為陽(yáng)性。SEQUENCELISTING<110>河北意和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司<120>一種含內(nèi)質(zhì)控能同時(shí)檢測(cè)多種病原體的三重PCR檢測(cè)方法<130>1<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>1cacctgaaacaaagcatcctaa22<210>2<211>21<212>DNA<213>金黃色葡萄球菌<400>2tatacgctaagccacgtccat21<210>3<211>21<212>DNA<213>綠膿桿菌<400>3atgatcgtacaaattggtcgg21<210>4<211>18<212>DNA<213>綠膿桿菌<400>4gtcatgaaaccgccagtc18<210>5<211>22<212>DNA<213>肺炎克雷伯桿菌<400>5tggcccgcgccagggttcgaaa22<210>6<211>24<212>DNA<213>肺炎克雷伯桿菌<400>6gatgtcgtcatcgttgatgcccag24<210>7<211>20<212>DNA<213>通用引物<400>7agagtttgatcctggctcag20<210>8<211>14<212>DNA<213>通用引物<400>8gcggctgctgcacg14當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3