一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法與流程

文檔序號：12412099閱讀：337來源：國知局

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，進一涉及基因重組與轉染方法的研究，同時涉及目的蛋白的表達及其功能驗證，具體涉及一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法。

背景技術：

細胞凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)，是一類存在于線粒體內外膜之間的保守的黃素蛋白，可誘導Caspase非依賴性細胞凋亡。人的AIF基因位于Xq25-26，其轉錄產(chǎn)生的mRNA的長度為2.4kb，編碼產(chǎn)生的蛋白質有三個不同長度的可變剪接體，它們的氨基酸數(shù)分別為613、609和326。除可誘導細胞凋亡外，AIF兼具氧化還原酶的活性。

當細胞受到特定的凋亡誘導信號的刺激后，線粒體膜上的通透性孔道(mitochondrial permeability transition pores，MPTP)打開，允許AIF從線粒體釋放到胞漿，并進入細胞核中，和另一個線粒體蛋白endonuclease G(Endo G)一起，引起核內DNA凝集并斷裂成50kb大小的片段

在介導細胞凋亡過程時，AIF有兩個方面的作用：一是可以作為細胞凋亡的起始因子，二是可以作為細胞凋亡的直接效應因子。在正常的情況下，AIF存在于線粒體中，可以清除細胞內的自由基從而阻止細胞凋亡；當細胞受到凋亡刺激后。AIF首先從線粒體出來，然后轉移至細胞質中，最后轉移到細胞核中發(fā)揮促進細胞凋亡的作用。

內皮唾液酸蛋白(TEM1/CD248)是Ⅰ型跨膜蛋白，由一個被糖基化修飾的80.9KDa的蛋白核心區(qū)組成，修飾后成熟的糖蛋白大約在175KDa。TEM1是近期發(fā)現(xiàn)的人類腫瘤標記物之一，其對腫瘤的細胞生長血管生成浸潤及轉移有重要作用。

TEM1外部分由五個球狀結構域(N端的C型凝集素結構域，壽司樣結構域，和三個表皮生長因子(EGF)樣重復)和一個粘蛋白樣區(qū)組成，其中核心蛋白大量唾液酸化與血栓調節(jié)蛋白相似。對于成體組織，TEM1的表達分布是這樣的：子宮>腎小球>輸卵管血管>心和肺>其他組織；另外，在內皮祖細胞中TEM1表達量相對很少。然而，在以下腫瘤中TEM1都有高表達，如肉瘤，腦腫瘤，乳腺癌，皮膚癌、結腸癌，且實驗表明在卵巢癌中，TEM1表達與腫瘤的浸潤、預后密切相關。因此，TEM1在正常組織不表達或者低表達，而在腫瘤血管組織高表達的特點，預示了TEM1作為腫瘤診斷和治療的靶標分子的潛力。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術的技術缺陷，提供一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，以解決現(xiàn)有技術中天然結構的細胞凋亡誘導因子AIF對腫瘤細胞的攻擊缺乏靶向作用。

本發(fā)明要解決的另一技術問題是現(xiàn)有技術中缺乏一種AIF與抗體偶聯(lián)的靶向抗腫瘤藥物。

本發(fā)明要解決的再一技術問題是在獲得了整合有AIF-單鏈抗體復合物的表達基因的重組質粒的情況下，現(xiàn)有技術中對此類質粒的表達方法操作繁瑣、蛋白表達水平較低。

為實現(xiàn)以上技術目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：

1)取序列如SEQ ID No.1所示的T18-AIF表達基因、序列如SEQ ID No.2所示的AIF表達基因，分別通過酶切方式與Abvec-Igk質粒連接，分別得到重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif；

2)分別取步驟1)所得重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coli Top10中進行質粒擴增；

3)分別收集步驟2)擴增后的重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，分別通過電轉法導入處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株中，即分別得到載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009和Abvec-Igk-Aif-VNP20009；所述電轉法的操作條件是：電壓1.8kv、電阻200Ω、電容25uF的條件電轉4.7ms；

4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合，或者取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80～1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4～16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40～56h，而后破碎細胞收集上清。

作為優(yōu)選，所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。

作為優(yōu)選，所述AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。

作為優(yōu)選，步驟1)所述酶切方式是經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，對酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質粒中。

作為優(yōu)選，步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3～7ml LB液體培養(yǎng)基中，35～39℃振蕩培養(yǎng)10～14h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80～1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值不小于0.4；

D)冰浴15～25min后，離心取沉淀用1/8～1/12體積預冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80～1/120體積預冷的、8～12％(mL/mL)的甘油中。

作為優(yōu)選，HEK293-T細胞的加入量為8000～12000個/孔；HEK293-T細胞與載體菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380～420μL。

作為優(yōu)選，所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。

在以上技術方案中，所述Abvec-Igk質粒明確限定為：NCBI GenBank中編號為FJ475056的質粒，該質粒的基因序列如SEQ ID No.3所示。因此本發(fā)明中所述Abvec-Igk質粒不具有其他指向作用或概況作用。

在以上技術方案中，所述T18是一種特異性識別TEM1的單鏈抗體，該抗體的名稱(即T18)屬于自創(chuàng)詞匯。所述T18-Aif表達基因是指整合有Aif表達基因的重組單鏈抗體T18的表達基因。作為一種自創(chuàng)詞匯，T18-Aif表達基因的技術特征是由序列如SEQ ID No.1所示的DNA表征的；在知曉該具體序列的情況下，T18-Aif表達基因可以通過本領域中常規(guī)的DNA合成方法獲得，當然也可以利用以上優(yōu)選技術方案中所披露的PCR方法獲得。

本發(fā)明提供了一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，該技術方案依托于一種特異性識別TEM1蛋白的單鏈抗體，結合減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009的腫瘤內特異性聚集及胞內侵襲的特性，攜帶細胞凋亡誘導因子Aif達到特異性殺傷腫瘤的效果。具體來看，本發(fā)明首先構建了Abvec-Igk-Aif、Abvec-Igk-T18-Aif重組質粒，經(jīng)擴增后通過電擊轉化的方式導入鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，利用減毒鼠傷寒沙門氏菌胞內侵襲的特性，以HEK293-T細胞為宿主實現(xiàn)蛋白的表達，最后利用含青霉素、鏈霉素的血清培養(yǎng)基殺死細胞內外的減毒鼠傷寒沙門氏菌，使重組質粒釋放至真核細胞中，經(jīng)細胞破碎后即得到含有目的蛋白的上清液，該上清液即屬于本發(fā)明所述藥物的一種存在形式，當然也可以通過常規(guī)的分離方式加以純化后，進行其他劑型的制備。

本發(fā)明中，結合實驗室前期篩選的單鏈抗體T18作為生物導航，可結合人類TEM1抗原，親和力強，特異性高。通過T18與人源化毒素Aif的融合表達，實現(xiàn)腫瘤細胞凋亡的最終目的。

同時，本發(fā)明以減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009作為治療載體，綜合應用了減毒鼠傷寒沙門氏菌胞內侵襲的特性和特異性聚集在實體瘤中的性質，進一步擴大了本發(fā)明中腫瘤殺傷的特異性。

此外，本發(fā)明的技術優(yōu)勢還體現(xiàn)在以下方面：

1、與當下流行的ADC藥物相比，本研究所用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除了具備抗體本身的靶向作用，其宿主菌VNP20009可特異性定植于腫瘤，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009具有兩個靶向腫瘤的彈頭，其特異性靶向腫瘤的作用較當下流行的ADC更為準確；

2、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009屬于活菌，只需按照常規(guī)細菌培養(yǎng)方法即可獲得大量的菌體用于腫瘤治療；而當下流行的ADC藥物需要昂貴的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、繁瑣的抗體表達和純化步驟、需要潔凈度極高的GMP車間以及后期難度高的毒素偶聯(lián)技術。因此，本發(fā)明使用的Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009除具有比ADC藥物更高的療效外，起生產(chǎn)成本可能僅為ADC藥物的千分之一甚至萬分之一。

3、Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009攜帶的抗體為全人源化抗體，毒素也為全人源化毒素，因此Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009表達的毒蛋白為全人源化蛋白，與人體無任何排斥性，安全性高且半衰期長。

附圖說明

圖1是本發(fā)明具體實施方式中T18-Aif、Aif對腫瘤細胞殺傷效果評價圖。

具體實施方式

以下將對本發(fā)明的具體實施方式進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節(jié)，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。

以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑；所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值；以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。

實施例1

根據(jù)人源化毒素Aif合成基因片段，通過PCR方法將實驗室可特異識別腫瘤標志物TEM1的單鏈抗體片段T18擴增。之后將Aif和T18一同或者單獨構建入Abvec-Igk載體，獲得重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif和Abvec-Igk-Aif。

將-80℃保存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009劃線接種于無抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單個菌落于5ml LB中，37℃振蕩培養(yǎng)12h；按1：100比例接種于100ml LB中振蕩培養(yǎng)至細菌OD＝0.4左右；冰浴20min后，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀用1/10體積預冷的無菌去離子水洗滌兩次，4℃3000rpm離心10min；菌體沉淀再次用1/100體積預冷的10％甘油洗滌菌體，4℃3000rpm離心10min；將菌體沉淀重懸于1/100體積預冷的10％甘油中，制成VNP20009感受態(tài)分裝后-80℃留存?zhèn)溆谩?/p>

將已獲得的重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif電轉進入減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009中，采用0.1cm電轉杯，條件設置為：1.8kv 200Ω25uF，電轉4.7ms；通過氨芐青霉素抗性篩選出陽性克隆，獲得重組減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009，命名為Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009。

將HEK293T細胞與Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009、Abvec-Igk-Aif-VNP20009按1:50～200比例混合培養(yǎng)后，待細胞破碎后獲取細胞混合液上清，即含有T18-Aif、Aif蛋白的上清。

將TEM1陰性細胞和陽性細胞按照10000/孔，接種于24孔板(采用不含青霉素和鏈霉素的培養(yǎng)基)，將T18-Aif、Aif蛋白的上清與原培養(yǎng)液上清按1:1與分別加入24孔板中，總體積400μL，培養(yǎng)1-4天，觀察T18-Aif、Aif對TEM1對陰陽性細胞的殺傷效果。如圖1所示，T18-Aif對TEM1陽性細胞殺傷明顯，對TEM1陰性細胞無殺傷效果；Aif蛋白對TEM1陰陽性細胞均無殺傷效果。

實施例2

一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：

2)分別取步驟1)所得重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coli Top10中進行質粒擴增；

4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:80的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)4h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)40h，而后破碎細胞收集上清。

在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：

所述T18-AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。

所述AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。

步驟1)所述酶切方式是經(jīng)Age I和Bsiw I雙酶切，對酶切產(chǎn)物純化后，采用T4連接酶連接到Abvec-Igk質粒中。

步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于3ml LB液體培養(yǎng)基中，35℃振蕩培養(yǎng)10h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:80的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.4；

D)冰浴15min后，離心取沉淀用1/8體積預冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/80體積預冷的、8％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/80體積預冷的、8％(mL/mL)的甘油中。

HEK293-T細胞的加入量為8000個/孔；HEK293-T細胞與載體菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為380μL。

所述針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素是青霉素和鏈霉素。

實施例3

一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：

2)分別取步驟1)所得重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coli Top10中進行質粒擴增；

4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)16h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)56h，而后破碎細胞收集上清。

在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件：

所述AIF表達基因是以pCDNA3.3C-T18-Aif為模板，以序列如SEQ ID No.4、SEQ ID No.6所示的DNA片段為引物，經(jīng)PCR擴增得到的。

步驟3)所述處于感受態(tài)的鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株，是通過以下方法制備的：

A)取凍存的減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009株劃線接種于LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)至形成單菌落；

B)挑取單菌落接種于7ml LB液體培養(yǎng)基中，39℃振蕩培養(yǎng)14h；

C)取步驟B)培養(yǎng)所得的菌液，按1:120的體積比接種于LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值為0.7；

D)冰浴25min后，離心取沉淀用1/12體積預冷的無菌去離子水洗滌，而后離心取沉淀用1/120體積預冷的、12％(mL/mL)濃度的甘油洗滌菌體，再離心沉淀重懸于1/120體積預冷的、12％(mL/mL)的甘油中。

HEK293-T細胞的加入量為12000個/孔；HEK293-T細胞與載體菌株在細胞培養(yǎng)板中混合后每孔中液體總體積為420μL。

實施例4

一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法，包括以下步驟：

2)分別取步驟1)所得重組質粒Abvec-Igk-T18-Aif、Abvec-Igk-Aif，在宿主細胞E.coli Top10中進行質粒擴增；

4)取HEK293-T細胞與載體菌株Abvec-Igk-T18-Aif-VNP20009以二者的細胞量為1:120的比例在細胞培養(yǎng)板中混合；混合后培養(yǎng)10h，而后將細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基更換為含有針對鼠傷寒沙門氏菌的抗生素的細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，而后破碎細胞收集上清。

以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大學

<120> 一種細菌和抗體結合雙靶向抑殺實體瘤藥物的制備方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttagggctga caccagaaca gaaacagaaa aaggccgcgt tatctgcttc agaaggagag 60

gaagttcctc aagacaaggc gccaagtcat gttcctttcc tgctaattgg tggaggcaca 120

gctgcttttg ctgcagccag atccatccgg gctcgggatc ctggggccag ggtactgatt 180

gtatctgaag atcctgagct gccgtacatg cgacctcctc tttcaaaaga actgtggttt 240

tcagatgacc caaatgtcac aaagacactg cgattcaaac agtggaatgg aaaagagaga 300

agcatatatt tccagccacc ttctttctat gtctctgctc aggacctgcc tcatattgag 360

aatggtggtg tggctgtcct cactgggaag aaggtagtac agctggatgt gagagacaac 420

atggtgaaac ttaatgatgg ctctcaaata acctatgaaa agtgcttgat tgcaacagga 480

ggtactccaa gaagtctgtc tgccattgat agggctggag cagaggtgaa gagtagaaca 540

acgcttttca gaaagattgg agactttaga agcttggaga agatttcacg ggaagtcaaa 600

tcaattacga ttatcggtgg gggcttcctt ggtagcgaac tggcctgtgc tcttggcaga 660

aaggctcgag ccttgggcac agaagtgatt caactcttcc ccgagaaagg aaatatggga 720

aagatcctcc ccgaatacct cagcaactgg accatggaaa aagtcagacg agagggggtt 780

aaggtgatgc ccaatgctat tgtgcaatcc gttggagtca gcagtggcaa gttacttatc 840

aagctgaaag acggcaggaa ggtagaaact gaccacatag tggcagctgt gggcctggag 900

cccaatgttg agttggccaa gactggtggc ctggaaatag actcagattt tggtggcttc 960

cgggtaaatg cagagctaca agcacgctct aacatctggg tggcaggaga tgctgcatgc 1020

ttctacgata taaagttggg aaggaggcgg gtagagcacc atgatcacgc tgttgtgagt 1080

ggaagattgg ctggagaaaa tatgactgga gctgctaagc cgtactggca tcagtcaatg 1140

ttctggagtg atttgggccc cgatgttggc tatgaagcta ttggtcttgt ggacagtagt 1200

ttgcccacag ttggtgtttt tgcaaaagca actgcacaag acaaccccaa atctgccaca 1260

gagcagtcag gaactggtat ccgatcagag agtgagacag agtccgaggc ctcagaaatt 1320

actattcctc ccagcacccc ggcagttcca caggctcccg tccaggggga ggactacggc 1380

aaaggtgtca tcttctacct cagggacaaa gtggtcgtgg ggattgtgct atggaacatc 1440

tttaaccgaa tgccaatagc aaggaagatc attaaggacg gtgagcagca tgaagatctc 1500

aatgaagtag ccaaactatt caacattcat gaagacgaat tcgcgggtaa tcgtgtgcgt 1560

cgctctgttg gtcttaaggg tggtggaggt ggttctggtg gtggaggttc tggtggtggt 1620

ggatctggcc agcttgtgct gactcagcca ccttccctct ctgcatctcc tggagcatca 1680

gccagtctca cctgcacctt acgcagtgac atcaatgttg gttcctacag gatatcctgg 1740

taccagcaga agccagggag tcctccccag tatctcctga gctacaaatc agactcagat 1800

aagcagaagg gctctggagt ccccagccgc ttctctggat ccaaagatgc ttcggccaat 1860

gcagggattt tactcatctc tgggctccag tctgaggatg aggctgacta ttattgtatg 1920

atttggcaca acagcgctgg ggtgttcggc gggggcacca agctgaccgt cctaggcggt 1980

ggttcctcta gatcttcctc ctctggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gcaggtgcag 2040

ctgcaggagt cgggaggaac cttggtacag cctggggggt ccctgagact ctcttgtgaa 2100

gcctctggat tcacctttag caactatgcc atgggctggg tccgccagac tccaggaaag 2160

gggctggagt ggctgtcggc tattcgtaaa agtggcacta ccacatacta cgcggactcc 2220

gtgaagggcc ggttcatcat ctccagagac aattccaaga acaccctgta tctgcaaatg 2280

aataggctga gagtcggcga cacggccact tattactgtg cgactcaccc catcgcgggc 2340

tactggggcc agggaagcct ggtcactgtc tcctcc 2376

<210> 2

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2