本發(fā)明涉及一種用雙酶串聯(lián)制備β-丙氨酸的方法，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β-丙氨酸在醫(yī)藥食品化工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，尤其是可以作為具有高附加值的醫(yī)藥中間體。目前在工業(yè)生產(chǎn)中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法，或β-氨基丙腈水解法，這些方法多需要在高溫、高壓、強酸或強堿的條件下，而且產(chǎn)物純化繁瑣，存在環(huán)境污染問題，因此使用生物催化法替代化學合成法制備β-丙氨酸是發(fā)展趨勢。

而目，前生物合成法主要有兩種，一種是優(yōu)化代謝途徑，在培養(yǎng)微生物過程中合成β-丙氨酸，此法雖然較簡便，但是由于微生物代謝過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，對產(chǎn)物的分離純化帶來較大困難，增加了后期純化成本；另一種方法是生物酶法合成β-丙氨酸，即通過表達L-天冬氨酸α-脫羧酶，以L-天冬氨酸作為底物，合成β-丙氨酸，雖然此法分離純化簡便，但是底物價格相對較高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種以富馬酸為底物，以雙酶串聯(lián)體系合成β-丙氨酸的方法。

所述雙酶是天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脫羧酶。

所述天冬氨酸酶的制備方法，是大腸肝菌來源的編碼天冬氨酸酶的基因aspA，通過NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pET 28a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pET 28a-aspA；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET28a-aspA；以該重組菌生產(chǎn)得到天冬氨酸酶。

所述L-天冬氨酸α-脫羧酶的制備方法，是將谷氨酸棒桿菌來源的編碼L-天冬氨酸α-脫羧酶的基因panD通過NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的表達載體pET 24a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pET 24a-panD；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET24a-panD；以該重組菌生產(chǎn)得到L-天冬氨酸α-脫羧酶。

所述天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脫羧酶的制備方法，還包括收集培養(yǎng)得到的重組菌的菌體，進行破碎、分離純化目標蛋白質(zhì)，獲得電泳純的酶。

所述雙酶串聯(lián)體系中，底物富馬酸的濃度為50～100mmol/L；兩種酶按照質(zhì)量比天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脫羧酶為1：80～100的比例添加至反應(yīng)體系中；其中，天冬氨酸酶的用量為10～15μg/mL。

所述雙酶串聯(lián)體系中，底物富馬酸的濃度為50mmol/L；兩種酶按照質(zhì)量比天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脫羧酶為1：80的比例添加至反應(yīng)體系中；其中，天冬氨酸酶的用量為10μg/mL。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述雙酶串聯(lián)體系還中含有1mmol/L的MgCl₂，以及50mmol/L pH 7.0的NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖液。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所用天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脫羧酶的純酶的比酶活分別為168mmol/g·min、156mmol/g·h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物富馬酸是配制50-500mmol/L富馬酸母液，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.0，然后作為反應(yīng)底物。

在本發(fā)明的一種實施方式中，將底物和酶混合好后，置于30～37℃、100-200rpm的條件下，反應(yīng)6-24h。

本發(fā)明首次實現(xiàn)了雙酶串聯(lián)反應(yīng)，可在較短時間內(nèi)將底物富馬酸完全轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，β-丙氨酸的產(chǎn)率>95％，中間產(chǎn)物L-天冬氨酸無殘余。本發(fā)明方法采用的底物價格相對低廉，而且，中間產(chǎn)物L-天冬氨酸無殘余，可見本發(fā)明能顯著降低目前生物合成β-丙氨酸的成本。

附圖說明

圖1不同的天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脫羧酶的加酶量的雙酶偶聯(lián)反應(yīng)進程，A：天冬氨酸酶與L-天冬氨酸α-脫羧酶的加酶質(zhì)量比為1:40；B：天冬氨酸酶與L-天冬氨酸α-脫羧酶的加酶質(zhì)量比為1:60；C：天冬氨酸酶與L-天冬氨酸α-脫羧酶的加酶質(zhì)量比為1:80。

圖2雙酶偶聯(lián)反應(yīng)催化體系示意圖。

具體實施方式

富馬酸含量的測定：反應(yīng)液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾后用HPLC檢測，色譜柱為Prevail Organic Acid(OA)有機酸分析柱(5μm，4.6×250mm)。流動相為20％甲醇溶液(磷酸調(diào)pH至2.2)，流速為0.6mL/min，檢測波長為220nm，柱溫為40℃，檢測時間為15min，進樣量為10μL。所測得衍生產(chǎn)物的含量等同于衍生前物質(zhì)的含量。

L-天冬氨酸及β-丙氨酸含量的測定：反應(yīng)液用苯基異硫酸酯(PITC)衍生，具體步驟為：取500μL反應(yīng)液于1.5mL離心管，加入250μL 0.1mol/L PITC乙腈溶液和250μL 1mol/L三乙胺乙腈溶液，充分混勻，避光室溫放置0.5h，加入700μL正己烷溶液，渦旋振蕩器振蕩1min，靜置30-60min，吸取下層溶液，經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，進樣量為10μL。衍生產(chǎn)物用HPLC測定：色譜柱為La Chrom C18(5μm，4.6×250mm)；流動相A溶液為80％(V/V)已腈水溶液，B溶液為97:3(V/V，pH 6.5)的0.1mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；采用梯度洗脫：0-20min，B溶液由95％下降到65％；20-30min，B液由65％上升到95％；30-35min，B溶液梯度不變。檢測波長為254nm，柱溫為40℃。

重組蛋白的純化及鑒定：將重組菌體溶于結(jié)合緩沖溶液(50mmol/L Na₂HPO₄、50mmol/L NaH₂PO₄、500mmol/L NaCl、20mmol/L imidazole)，超聲破碎，離心，上清用0.22μm濾膜過濾。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡5mL的His Trap HF柱，取20mL的破碎上清上樣，用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白，分別用8倍柱體積的150、300和500mmol/L咪唑的緩沖液洗脫蛋白，收集樣品并用SDS-PAGE分析鑒定。

實施例1重組大腸桿菌BL21/pET24a-panD的構(gòu)建

根據(jù)GenBank所提供的谷氨酸棒桿菌來源的L-天冬氨酸α-脫羧酶的基因序列(EC4.1.1.11)設(shè)計引物，分別在上游引入NdeⅠ酶切位點和保護堿基，下游引入HindⅢ酶切位點和保護堿基，并在C端引入His標簽。

提取谷氨酸棒桿菌基因組，將pCR擴增到的panD基因產(chǎn)物用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pET 24a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pET 24a-panD。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET24a-panD。

實施例2重組大腸桿菌BL21/pET28a-aspA的構(gòu)建

根據(jù)GenBank所提供的大腸肝菌來源的天冬氨酸酶的基因序列(EC4.3.1.1)設(shè)計引物，分別在上游引入BamHⅠ酶切位點和保護堿基，下游引入HindⅢ酶切位點和保護堿基，并在C端引入His標簽。

提取谷氨酸棒桿菌基因組，將pCR擴增到的panD基因產(chǎn)物用NdeⅠ和HindⅢ雙酶切后連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體pET 28a(+)上，獲得重組質(zhì)粒pET 28a-aspA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，篩選獲得重組大腸桿菌BL21/pET28a-aspA。

實施例3天冬氨酸酶的表達

將重組大腸桿菌BL21/pET28a-aspA接種于4mL卡那霉素濃度為100μg/mL的TB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1％的接種量接種于含卡那霉素濃度為100μg/mL的TB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度0.2mmol/L，24℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16-20h，收集菌體超聲破碎，通過SDS-PAGE分析鑒定天冬氨酸酶重組蛋白表達水平。通過PAGE膠顯示，該重組酶在大腸桿菌體內(nèi)的表達量約為40％，同時通過高效液相色譜測得粗酶液中酶的比酶活為69mmol/g·min。

實施例4 L-天冬氨酸α-脫羧酶酶的表達

將重組大腸桿菌BL21/pET24a-panD接種于4mL卡那霉素濃度為100μg/mL的TB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將上述過夜培養(yǎng)物按1％的接種量接種于含卡那霉素濃度為100μg/mL的TB培養(yǎng)基，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD₆₀₀至0.6-0.8，加入IPTG至終濃度0.8mmol/L，37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)16-20h，收集菌體超聲破碎，通過Tris-tricine SDS-PAGE方法分析鑒定L-天冬氨酸α-脫羧酶重組蛋白表達水平。通過PAGE膠顯示，該重組酶在大腸桿菌體內(nèi)的表達量約為30％，同時通過高效液相色譜測得粗酶液中酶比酶活為13.9mmol/g·h。

實施例5

將兩種重組大腸桿菌分別接種于種子培養(yǎng)基中，37℃，200rpm活化6-8h后，以1％的接種量分別轉(zhuǎn)接至1L TB表達陪養(yǎng)基中，待OD₆₀₀至0.6-0.8時，加入誘導(dǎo)劑IPTG，搖床培養(yǎng)16-18h得到發(fā)酵液，4000-6000rpm的轉(zhuǎn)速離心收菌。向收得的菌體中加入100mL緩沖液，超聲破碎，離心，用親和層析柱His Trap HF純化蛋白，天冬氨酸酶、L-天冬氨酸α-脫羧酶的純酶比酶活分別為168mmol/g·min和156mmol/g·h。

在含有底物濃度為50mmol/L富馬酸和足量氨(調(diào)pH至7.0)的10mL反應(yīng)液中，加入天冬氨酸酶：L-天冬氨酸α-脫羧酶的質(zhì)量濃度比例為1：80，其中天冬氨酸酶的質(zhì)量為10μg/mL，反應(yīng)體系中含有1mmol/L的MgCl₂，50mmol/L NaH₂PO₄/Na₂HPO₄緩沖液(pH 7.0)，37℃、200r/min下進行酶促反應(yīng)(振蕩反應(yīng))，每隔1-2h取樣，終止反應(yīng)時取適量反應(yīng)液于100℃煮沸10min，12000r/min離心10min，取上清，用0.22μm微孔有機濾膜過濾，利用HPLC檢測反應(yīng)液中各成分的含量，計算得到β-丙氨酸的濃度為49.5mmol/L，β丙氨酸產(chǎn)率為99％。

在上述雙酶偶聯(lián)催化體系中，固定富馬酸濃度為50mmol/L，天冬氨酸酶的添加濃度為10μg/mL，調(diào)整L-天冬氨酸α-脫羧酶的添加量，使天冬氨酸酶與L-天冬氨酸α-脫羧酶的加酶質(zhì)量比分別為1:40、1:60，進行雙酶偶聯(lián)反應(yīng)。

結(jié)果如圖1所示，在1:40和1:60(W/W)的反應(yīng)體系中，反應(yīng)8h，β-丙氨酸的產(chǎn)率只有82％和93％，且尚有部分中間產(chǎn)物未完全轉(zhuǎn)化，反應(yīng)至12h，1:40的反應(yīng)體系中仍有中間產(chǎn)物。而在1:80的反應(yīng)體系中，反應(yīng)8h，富馬酸可完全轉(zhuǎn)化為β-丙氨酸，β-丙氨酸的產(chǎn)率>95％，中間產(chǎn)物L-天冬氨酸無殘余。隨著L-天冬氨酸α-脫羧酶濃度的提高，β-丙氨酸的合成速度大大增加，且中間產(chǎn)物L-天冬氨酸的殘余量減少。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。