本發(fā)明涉及植物病毒學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)熒光定量PCR檢測的專用引物和方法。

背景技術(shù)：

櫻桃是一種具有較高經(jīng)濟價值的水果，近年來隨著種植面積的不斷擴大，病毒病已成為限制其產(chǎn)量和質(zhì)量提高的重要因素。櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)是一種能侵染櫻桃、李子、杏等李屬果樹的潛隱性病毒，為乙型線形病毒科(Betaflexiviridae)發(fā)形病毒屬(Capillovirus)成員。CVA最早于1995年在德國南部的櫻桃樣品中被發(fā)現(xiàn)，在我國則最早于2007年在江蘇省的杏樹樣品和云南省的櫻桃樣品中被相繼發(fā)現(xiàn)。CVA侵染寄主植物能導(dǎo)致寄主果實產(chǎn)量和品質(zhì)的降低，但是作為一種潛隱性病毒，其侵染寄主植物后沒有明顯的癥狀表現(xiàn)，給該病毒的早期診斷帶來較大的困難。與此同時，CVA常與櫻桃小果病毒(Little cherry virus,LChV)伴隨發(fā)生，關(guān)于其病毒與病毒、病毒與植物互作機制的基礎(chǔ)研究也逐漸受到重視。因此，有必要建立一種高效、靈敏的對CVA進(jìn)行定量檢測的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種對櫻桃病毒A(Cherry virus A,CVA)進(jìn)行熒光定量PCR檢測的方法及其專用引物，該檢測方法可實現(xiàn)對供試果樹樣本材料中CVA基因組拷貝數(shù)的絕對定量。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物，包括上游引物和下游引物，上游引物CVA-4F：5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’；

下游引物CVA-4B：5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’。

本發(fā)明還提出了一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的方法，包括以下步驟：

第一步，提取CVA毒源材料的總RNA，用隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以CVA-4F和CVA-4B為引物進(jìn)行PCR擴增，大小為205bp的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收，連接克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選并挑取含陽性克隆的大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒得到陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；

第二步，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別梯度稀釋至不同濃度，以CVA-4F和CVA-4B為引物進(jìn)行熒光定量PCR擴增，以Ct值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

第三步，提取待測樣品的總RNA，以CVA-4B為引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以該cDNA為模板，按照與步驟(2)中完全相同的條件進(jìn)行熒光定量PCR擴增，所得Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式得到待測樣品中CVA基因組RNA的含量。

優(yōu)選的，在第一步中，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備，其PCR反應(yīng)體系為：2×Ex Taq Mix 12.5μL，10μM CVA-4F和CVA-4B引物各1.0μL，模板2.0μL，雙蒸水補足至25μL。

優(yōu)選的，在第一步中，陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備，其PCR反應(yīng)程序為：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 20s，共35個循環(huán)；72℃ 10min。

優(yōu)選的，在第二步中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時根據(jù)公式：拷貝數(shù)(copy/μL)＝(濃度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL共5個濃度。

優(yōu)選的，在第二步中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應(yīng)體系為：2×SYBR Green qPCR Mix 10.0μL，10μM CVA-4F和CVA-4B各1.4μL，模板1.0μL，雙蒸水補足至20μL。

優(yōu)選的，在第二步中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測待測樣品時的熒光定量PCR反應(yīng)程序為：95℃ 2min；95℃ 5s，58℃ 10s，共39個循環(huán)；由65℃至95℃，以每10s升溫0.5℃讀取熒光值得到溶解曲線。

本發(fā)明構(gòu)建了對CVA進(jìn)行定量檢測的實時熒光PCR體系，該方法特異性強、靈敏度高，可對大量樣品進(jìn)行高通量的標(biāo)準(zhǔn)化操作。該方法應(yīng)用于生產(chǎn)實際，可實現(xiàn)對果樹苗木中CVA帶毒情況的快速檢測，對果樹病毒病的防控，進(jìn)而提高產(chǎn)品產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要作用。同時，該方法也可用于科研工作，對探索CVA與其它果樹病毒的互作機制、致病機理等學(xué)術(shù)問題具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，下面對實施例中所需要使用的附圖作如下說明：

圖1為本發(fā)明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴增獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2為本發(fā)明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴增的擴增曲線。

圖3為本發(fā)明實施例中以10⁸，10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板擴增的溶解曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例

1.引物合成

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物CVA-4F(5’-TCACATTATCAGAGAACCAGAG-3’)和CVA-4B(5’-GCAAAAGTTAATAATGACATGCC-3’)，用雙蒸水溶解至10μM備用。

2.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建

2.1.感染CVA的櫻桃枝條樣品采自遼寧省興城市。使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TIANGEN,DP140916)提取樣品總RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。

2.2.使用隨機引物反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega，具體步驟如下：

70℃水浴5min，冰置5min，加入下列成分：

37℃反應(yīng)1h，95℃滅活5min，得到的cDNA；

2.3.以cDNA為模板，以CVA-4F和CVA-4B為引物進(jìn)行PCR擴增，所使用的Ex Taq Mix購自康為世紀(jì)，反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃補充延伸10min。

2.4.PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠中145V恒壓電泳15min，凝膠在EB染液中染色5min后用紫外凝膠成像系統(tǒng)成像拍照；用潔凈刀片割下大小約為200bp的產(chǎn)物，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN,DP209)純化回收目標(biāo)產(chǎn)物，具體方法參照說明書；回收片段連接pGEM-T easy(Promega)克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(康為世紀(jì))，在含50μg/mL氨芐青霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆，具體方法參照相關(guān)說明書；經(jīng)PCR驗證陽性的單克隆菌落擴大培養(yǎng)后，使用質(zhì)粒小提試劑盒(TIANGEN,DP103)提取質(zhì)粒得到陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；測定質(zhì)粒濃度為262ng/μL。

2.5.為確保本方法的準(zhǔn)確性，重組陽性質(zhì)粒委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司，使用通用引物M13F/M13R對插入片段進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果如SEQ ID NO:1。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行在線BLAST分析(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結(jié)果表明插入片段確為CVA基因組片段，其與GenBank中已提交的CVA序列一致性為91.7％(KT310083)～95.1％(KU215411)：

TCACATTATCAGAGAACCAGAGAGCCGTGAAGAACACCATCAGGAATTACTACCTGAGGATAATGTTTGGGAATCTTGCGGTGATGGGAACAAGCGAGCAGACAGACTACCCAGGAGAGCATCTAGCGATTCCGAGACCAGTAATAGAGAATCAGGAGGCTCTGACTGCACATCTCCCAGCAGGCATGTCATTATTAACTTTTGC

3.標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

3.1.參照公式：拷貝數(shù)(copy/μL)＝(濃度(ng/μL)×10^-9×6.02×10²³)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，將262ng/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至10⁸copy/μL，其中質(zhì)粒堿基數(shù)為3220，即1μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品加741.2μL雙蒸水，再將10⁸copy/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次稀釋至10⁷，10⁶，10⁵，10⁴copy/μL。

3.2.分別以各濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，使用Quant One Step RT-qPCR Kit(SYBR Green)試劑盒(TIANGEN,FP303)進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系如下：

使用Bio-Rad iQ^TM5實時熒光定量PCR儀按如下反應(yīng)程序進(jìn)行：95℃ 2min；95℃ 5s,58℃ 10s,Read,39cycle；65℃ to 95℃,0.5℃/10s read。程序運行結(jié)束后由軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y＝-3.511×log(X)+42.507，R²＝0.995

4.待測植物材料的定量檢測

待測櫻桃枝條樣品采自遼寧省葫蘆島市興城市，按照上述方法提取樣品總RNA，隨機引物反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，CVA-4F和CVA-4B為引物，完全按照上述體系和程序進(jìn)行熒光定量PCR擴增，同時分別設(shè)置健康櫻桃樣品、無菌雙蒸水作為陰性對照，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。5份待測樣品Ct值為20.74～24.30，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，得到待測樣品CVA拷貝數(shù)為1.54×10⁵～1.59×10⁶copy/μL。陰性對照樣品均未出現(xiàn)擴增曲線和溶解峰。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換,凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測的專用引物和方法

<160> 2

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測上游引物

<400> 1

TCACATTATC AGAGAACCAG AG 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 櫻桃病毒A熒光定量PCR檢測下游引物

<400> 2

GCAAAAGTTA ATAATGACAT GCC 23