本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2在制備治療修復(fù)受損視神經(jīng)藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病和損傷后，神經(jīng)再生是非常困難的，如何進(jìn)行有效治療一直是臨床治療所困擾的重大難題。視神經(jīng)為CNS的一部分。視神經(jīng)損傷后，軸突再生困難的主要原因包括視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)大量死亡、RGCs內(nèi)在再生能力低下、引導(dǎo)軸突再生的細(xì)胞缺乏、抑制再生的微環(huán)境、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的不足等。視神經(jīng)損傷后RGCs的內(nèi)在再生能力低下，是視神經(jīng)損傷后再生失敗導(dǎo)致視神經(jīng)萎縮和失明的關(guān)鍵因素。目前，雖然臨床上針對(duì)受損視神經(jīng)的治療開展了大量工作，但其實(shí)際療效不佳，很難讓患者恢復(fù)視力。

近期關(guān)于提高RGCs內(nèi)在再生能力的研究成果層出不窮：Benowitz研究組通過針刺傷晶狀體，玻璃體腔內(nèi)注射晶體蛋白，激活RGCs的內(nèi)在再生潛力，使軸突的再生通過視神經(jīng)壓榨傷部位到達(dá)遠(yuǎn)段神經(jīng)，但數(shù)量和生長(zhǎng)潛能有限(參見文獻(xiàn)[1]de Lima S,Koriyama Y,Kurimoto T,et al.Fulllength axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.Proc Nat Acad Sci U S A,2012；109(23):9149-54)。O‘Donovan等通過激活RAF-MEK通路的B-Raf，特別是聯(lián)合敲除PTEN，同時(shí)有效地促進(jìn)了大鼠視神經(jīng)損傷后的再生(參見文獻(xiàn)[2]O'Donovan KJ,Ma K,Guo H,et al.B-RAF kinase drives developmental axon growth and promotes axon regeneration in the injured mature CNS.J Exp Med,2014；211(5):801-14)。Yungher等小鼠玻璃體注射PTEN-shRNA、CNTF的腺相關(guān)病毒2及cAMP類似物，再生軸突遠(yuǎn)達(dá)視交叉和視交叉上核并形成突觸(參見文獻(xiàn)[3]Yungher BJ,Luo X,Salgueiro Y,Blackmore MG,et al.Viral vector-based improvement of optic nerve regeneration:characterization of individual axons’growth patterns and synaptogenesis in a visual target.Gene Therapy,2015；22:811-821)。Nawabi等向PTEN敲除小鼠玻璃體注射DCLKs的腺相關(guān)病毒2，軸突再生遠(yuǎn)達(dá)視交叉(參見文獻(xiàn)[4]Nawabi H,Belin S,Cartoni R,et al.Doublecortin-like kinases promote neuronal survival and induce growth cone reformation via distinct mechanisms.Neuron,2015；88:704-719.)。由上可見，尋找調(diào)節(jié)再生的靶分子和基因，并將增強(qiáng)RGCs內(nèi)在再生能力和影響再生的因素相結(jié)合，促進(jìn)視神經(jīng)再生，具有光明的臨床前景。

莫洛尼小鼠白血病病毒前病毒整合位點(diǎn)(provirus integration site for Moloney murine leukemia virus,Pim-1)為原癌基因，表達(dá)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于鈣-鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)激酶。它表達(dá)的激酶廣泛存在于各組織細(xì)胞中，如胸腺、骨髓、結(jié)腸、睪丸、前列腺、心血管、大腦皮質(zhì)、海馬和視網(wǎng)膜等，Pim-1是許多細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子(包括IL-2，GCSF，EGFR，HGF等)信號(hào)通路(包括JAK-STAT，AKT，MAPK，NF-kB等)的共同下游效應(yīng)分子,并磷酸化特異性底物，參與細(xì)胞增殖、分化、存活等(參考文獻(xiàn)[5]Mondello P,Cuzzocrea S,Mian M.Pim kinases in hematological malignancies:where are we now and where are we going？J Hemat Oncol,2014；7:95)。

Pim-1能參與血管形成(參見文獻(xiàn)[6]Zippo A,De Robertis A,Bardelli M,et al.Identification of Flk-1target genes in vasculogenesis:Pim-1is required for endothelial and mural cell differentiation in vitro.Blood,2004；103:4536-4544；參見文獻(xiàn)[7]Walpen T,Peier M,Haas E,et al.Loss of pim1imposes a hyperadhesive phenotype on endothelial cells.Cell Physiol Biochem,2012,30(4):1083-96)、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)增殖和存活(參見文獻(xiàn)[8]Willert M,Augstein A,Poitz D M,et al.Transcriptional regulation of Pim-1kinase in vascular smooth muscle cells and its role for proliferation.Basic Res Cardiol,2010,105(2):267-77；參見文獻(xiàn)[9]Meloche J,Paulin R,Courboulin A,et al.RAGE-dependent activation of the oncoprotein Pim1plays a critical role in systemic vascular remodeling processes.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31(9):2114-24；參見文獻(xiàn)[10]Chen J,Yin H,Jiang Y,et al.Induction of microRNA-1by myocardin in smooth muscle cells inhibits cell proliferation.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2011,31:368-375；參見文獻(xiàn)[11]Paulin R,Courboulin A,Meloche J,et al.Signal transducers and activators of transcription-3/pim1axis plays a critical role in the pathogenesis of human pulmonary arterial hypertension.Circulation,2011,123(11):1205-15；參見文獻(xiàn)[12]Paulin R,Meloche J,Jacob MH,et al.Dehydroepiandrosterone inhibits the Src/STAT3constitutive activation in pulmonary arterial hypertension.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301:H1798-H1809)及心臟祖細(xì)胞(CPCs)增殖存活并延緩其衰老(參見文獻(xiàn)[13]Hu S,Yan G,Xu H,et al.Hypoxic preconditioning increases survival of cardiac progenitor cells via the Pim-1kinase-mediated anti-apoptotic effect.Cir J,2014,78(3):724-731；參見文獻(xiàn)[14]Samse K,Emathinger J,Hariharan N,et al.Functional effect of Pim1depends upon intracellular localization in human cardiac progenitor cells.J Biol Chem,2015,290(22):13935-47；參見文獻(xiàn)[15]Cottage CT,Bailey B,Fischer KM,et al.Cardiac progenitor cell cycling stimulated by pim-1kinase.Circ Res,2010,106(5):891-901)、促進(jìn)CPCs分化(參見文獻(xiàn)[16]Iwakura T,MohritT,Hamatani T,et al.STAT3/Pim-1signaling pathway plays a crucial role in endothelial differentiation of cardiac resident Sca-1⁺ cells both in vitro and in vivo.J Mol Cell Cardiol,2011,51(2):207-14；參見文獻(xiàn)[17]Tufan H,Zhang XH,Haghshenas N,et al.Cardiac progenitor cells engineered with Pim-1(CPCeP)develop cardiac phenotypic electrophysiological properties as they are co-cultured with neonatal myocytes.J Mol Cell Cardiol,2012,53(5):695-706)、保護(hù)受損心肌(參見文獻(xiàn)[18]Muraski JA,Rota M,Misao Y,et al.Pim-1regulates cardiomyocyte survival downstream of Akt.Nat Med,2007,13(12):1467-75；[19]Stumpner J,Smul TM,Redel A,et al.Desflurane-induced and ischaemic postconditioning against myocardial infarction are mediated by Pim-1kinase.Acta Anaesthesiol Scand,2012,56(7):904-13；[20]Din S,Mason M,Volkers M,et al.Pim-1preserves mitochondrial morphology by inhibiting dynamin-related protein 1translocation.Proc Natl Acad Sci,2013,110(15):5969-74)。

神經(jīng)系統(tǒng)中，Pim-1存在于胚胎小鼠枕葉視覺皮質(zhì)、嗅皮質(zhì)、紋狀體和視網(wǎng)膜及胚胎斑馬魚視網(wǎng)膜中,并能促進(jìn)上述神經(jīng)結(jié)構(gòu)的發(fā)育(參見文獻(xiàn)[21]Eichmann A,Yuan L,Breant C,et al.Developmental expression of pim kinases suggests functions also outside of the hematopoietic system.Oncogene,2000,19(9):1215-24；[22]Yin J,Shine L,Raycroft F,et al.Inhibition of the Pim1oncogene results in diminished visual function.PLoS One,2012,7(12):e52177)。大鼠梨狀葉皮質(zhì)、海馬結(jié)構(gòu)、紋狀體、背側(cè)丘腦表達(dá)Pim-1 mRNA及蛋白，癲癇發(fā)作、長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)分別能誘導(dǎo)上述區(qū)域Pim-1 mRNA高表達(dá)(參考文獻(xiàn)[23]Feldman JD,Vician L,Crispino M,et al.KID-1,a protein kinase induced by depolarization in brain.J Biol Chem,1998,273(26):16535-43；[24]Konietzko U,Kauselmann G,Scafidi J,et al.Pim kinase expression is induced by LTP stimulation and required for the consolidation of enduring LTP.Embo J,1999,18(12):3359-69；[25]Feldman JD,Vician L,Crispino M,et al.Seizure activity induces PIM-1expression in brain.J Neurosci Res,1998,53(4):502-9),大鼠神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞中,PC12細(xì)胞接受KCl和腺苷酸環(huán)化酶激活劑毛喉素(Fk)誘導(dǎo)處理后，Pim-1蛋白在1h后上升，2-4h達(dá)到高峰，6h后恢復(fù)正常水平(參考文獻(xiàn)[26]Liu W,Feldmann JD,Machado HB,et al.Expression of depolarization-induced immediate early gene proteins in PC12cells.J Neurosci Res,2003,72(6):670-8),體外研究表明，Pim-1促進(jìn)了PC12細(xì)胞兒茶酚胺類如多巴胺、去甲腎上腺素和IL-6的釋放(參考文獻(xiàn)[27]Glazova M,Aho TL,Palmetshofer A,et al.Pim-1kinase enhances NFATc activity and neuroendocrine functions in PC12cells.Brain Res Mol Brain Res,2005,138(2):116-23)。綜上提示Pim-1參與了神經(jīng)元的去極化和可塑性調(diào)節(jié)及遞質(zhì)的釋放。在體外培養(yǎng)的小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中，Pim-1介導(dǎo)了小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元DNA損傷后經(jīng)由NF-kB和Cdc25A引起的死亡(參見文獻(xiàn)[28]Zhang Y,Parsanejad M,Huang E,et al.Pim-1kinase as activator of the cell cycle pathway in neuronal death induced by DNA damage.J Neurochem,2010,112(2):497-510)，大鼠急性腦缺血后早期(12-72h)及新生大鼠腦缺氧性缺血中，腦內(nèi)Pim-1 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，參與了大鼠腦缺血后粒細(xì)胞集落刺激因子的抗神經(jīng)元凋亡和促神經(jīng)元存活的過程(參見文獻(xiàn)[29]Solaroglu I,Tsubokawa T,Cahill J,et al.Anti-apoptotic effect of granulocyte-colony stimulating factor after focal cerebral ischemia in the rat.Neuroscience,2006,143(4):965-74；[30]Yata K,Matchett GA,Tsubokawa T,et al.Granulocyte-colony stimulating factor inhibits apoptotic neuron loss after neonatal hypoxia-ischemia in rats.Brain Res,2007,1145:227-38)。這些提示Pim-1參與了受損神經(jīng)元的存活和凋亡。

結(jié)合上述Pim-1的相關(guān)作用，特別是其與視覺發(fā)育的密切關(guān)系和視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜基因表達(dá)變化(見實(shí)施例2)，提示Pim-1可能是影響RGC內(nèi)在再生能力的關(guān)鍵分子，故假設(shè)相比于調(diào)節(jié)上述通路如JAK-STAT，AKT，MAPK中的單一分子表達(dá)，調(diào)節(jié)以Pim-1為靶的基因表達(dá)，可能起到“以一抵十”的效果，可更有效地增強(qiáng)受損RGC內(nèi)在再生能力。

目前Pim-1的研究多集中在腫瘤、心肌保護(hù)和再生方面，在神經(jīng)系統(tǒng)中的研究尚少，尚未見Pim-1基因與修復(fù)受損視神經(jīng)的相關(guān)研究，也未見有文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建一種攜帶Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2載體來(lái)治療受損視神經(jīng)及其他 神經(jīng)損傷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2，其構(gòu)建方法，及其在制備治療修復(fù)受損視神經(jīng)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明在SD大鼠球后2mm處采用臨時(shí)腦動(dòng)脈瘤夾夾傷5s，以制作大鼠視神經(jīng)壓榨傷模型。

本發(fā)明在大鼠視網(wǎng)膜的基因芯片及Real-time PCR的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)在正常新生大鼠視網(wǎng)膜中，Pim-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常成年大鼠，約為1.93倍；視神經(jīng)損傷后3天，視網(wǎng)膜內(nèi)的Pim-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，為正常成年鼠的1.53倍，到14天降至正常水平以下。Western Blot結(jié)果顯示，正常新生大鼠視網(wǎng)膜中，Pim-1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常成年大鼠，約為正常成年大鼠的3.24倍；而成年大鼠視神經(jīng)損傷后3天，視網(wǎng)膜內(nèi)的Pim-1蛋白表達(dá)上調(diào)，約為正常成年大鼠的1.98倍，到7天就降至正常水平以下，21天仍較正常水平低。免疫組化結(jié)果表明，視神經(jīng)損傷后的1d和3d，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層Pim-1的表達(dá)明顯增加，之后逐漸下調(diào)。結(jié)合上述Pim-1的相關(guān)作用，特別是其與視覺發(fā)育的密切關(guān)系和及其基因在視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜表達(dá)的變化，以及新生鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的內(nèi)在生長(zhǎng)能力強(qiáng)，提示在視神經(jīng)損傷后早期行Pim-1重組腺相關(guān)病毒2過表達(dá)治療可能會(huì)促進(jìn)受損視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的存活和視神經(jīng)的再生。

本發(fā)明的技術(shù)方案，主要是構(gòu)建Pim-1的重組腺相關(guān)病毒2載體，并在成年SD大鼠視神經(jīng)壓榨傷模型中，玻璃體腔注射Pim-1的重組腺相關(guān)病毒2載體轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜，體內(nèi)觀察并探討靶向Pim-1基因治療修復(fù)受損視神經(jīng)的作用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供一種攜帶Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2載體，所述的腺相關(guān)病毒2載體是攜帶如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因的DNA序列。

所述的腺相關(guān)病毒2載體選用AAV三質(zhì)粒系統(tǒng)，由AAV載體pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG、包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper組成；目的基因Pim-1由CAGMINI啟動(dòng)子啟動(dòng)；Pim-1基因插入載體MCS多克隆酶切位點(diǎn)，Pim-1的C端帶3×Flag標(biāo)簽蛋白。

本發(fā)明的第二方面，提供上述的攜帶Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2載體 的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

1.Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2載體的克隆構(gòu)建

根據(jù)Pim-1基因(GenBank ID:NM017034)設(shè)計(jì)并合成如下PCR引物：

Pim-1上游引物：5’-CATGGTCCTG CTGGAGTTCG TG-3’

(SEQ ID NO:2)；

Pim-1下游引物：5’-CATAGCGTAA AAGGAGCAAC A-3’

(SEQ ID NO:3)；

使用PCR方法從含有如SEQ ID NO:1所示的Pim-1基因cDNA克隆模板進(jìn)行Pim-1目的基因擴(kuò)增；將pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG載體及Pim-1基因PCR產(chǎn)物均使用Nhel酶切載體，酶切完全后進(jìn)行酶切產(chǎn)物的純化，將酶切后的腺相關(guān)病毒載體和Pim-1基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，通過連接反應(yīng)將上述酶切片段準(zhǔn)確連接到pAOV表達(dá)載體的NheI位點(diǎn)上，獲得pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG表達(dá)載體，得到連接產(chǎn)物后，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，對(duì)生長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行Pim-1基因腺相關(guān)病毒2質(zhì)粒的克隆鑒定，電泳結(jié)果陽(yáng)性的為陽(yáng)性克隆，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體；再對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的克隆進(jìn)行生物測(cè)序和分析比對(duì)，序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的GenBank ID:NM_017034序列相一致，比對(duì)正確，說明質(zhì)粒構(gòu)建成功；將構(gòu)建好的帶有熒光蛋白eGFP表達(dá)質(zhì)粒通過超純?nèi)?nèi)毒素試劑盒抽提，通過轉(zhuǎn)染試劑lipo2000轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24小時(shí)后通過熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞被轉(zhuǎn)染為綠色熒光，即為Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2載體轉(zhuǎn)染表達(dá)成功。

2.Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2包裝

腺相關(guān)病毒包裝系統(tǒng)采用三質(zhì)粒系統(tǒng)，將包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper，與Pim-1基因的重組腺相關(guān)病毒2表達(dá)質(zhì)粒pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-Pim-1-3FLAG通過轉(zhuǎn)染試劑lipo2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前，AAV-293細(xì)胞融合度需達(dá)到80％以上，轉(zhuǎn)染72h后，將細(xì)胞離心收集，然后將細(xì)胞裂解，4℃53,000rmp高速離心30h后，收集富含重組腺相關(guān)病毒2顆粒的細(xì)胞上清液，對(duì)其濃縮后得到高滴度的重組腺相關(guān)病毒2的濃縮液，分裝后，-80℃保存，最后使用定量PCR測(cè)定病毒滴度。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)對(duì)腺相關(guān)病毒滴度的要求不同，生產(chǎn)過程中根據(jù)需求可得到不同滴度的腺相關(guān)病毒顆粒，用于相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

本發(fā)明的第三方面，提供上述的攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2載體在制備治療修復(fù)受損視神經(jīng)藥物中的應(yīng)用。

用本發(fā)明構(gòu)建的攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2載體治療受損視神經(jīng)。首先采用Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2載體轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜，再應(yīng)用臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾制備視神經(jīng)不完全損傷模型，觀察Pim-1基因過表達(dá)后對(duì)受損視神經(jīng)修復(fù)的作用及機(jī)制。

攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2載體在制備治療修復(fù)受損視神經(jīng)藥物中的應(yīng)用，Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2可轉(zhuǎn)染RGCs，臨床上，具體可采用玻璃體腔注射該藥物轉(zhuǎn)染RGCs以進(jìn)行視神經(jīng)損傷后的基因治療。

腺相關(guān)病毒載體AAV是一種無(wú)被膜的單鏈線狀缺損型DNA病毒，AAV的DNA能以dsDNA的形式低頻整合入宿主的染色體中，AAV載體具有潛伏狀態(tài)穩(wěn)定、宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、免疫反應(yīng)弱等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是目前最安全的用于在體實(shí)驗(yàn)的病毒載體，尤其適用于眼組織實(shí)驗(yàn)?，F(xiàn)在已經(jīng)有100多種AAV分型，設(shè)計(jì)成重組病毒載體的有12種，其中AAV2型血清型腺相關(guān)病毒因在眼組織中具備較強(qiáng)的轉(zhuǎn)染性和特異性，成為治療視神經(jīng)損傷最常用的血清性載體。本課題組前期以攜帶Neuritin基因的腺相關(guān)病毒2載體治療受損視神經(jīng)，在RGCs的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)70％，并取得良好的治療效果。

本發(fā)明基于Pim-1在胸腺、骨髓、結(jié)腸、睪丸、前列腺、心血管、大腦皮質(zhì)、海馬和視網(wǎng)膜等組織中的獨(dú)特作用，用攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2(AAV2)載體，靶向Pim-1基因過表達(dá)增強(qiáng)RGCs內(nèi)在再生能力，修復(fù)受損視神經(jīng)，觀察其對(duì)RGCs的存活及凋亡、視神經(jīng)軸突再生和視覺功能恢復(fù)等的作用。

視神經(jīng)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的一部分，因而常作為研究CNS損傷和再生的理想部位。故研究視神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生，將為臨床治療視神經(jīng)損傷提供新的有力手段和理論基礎(chǔ)，對(duì)CNS疾病和損傷的治療也有著重要意義。

附圖說明

圖1是大鼠視神經(jīng)不完全損傷模型的制備

A為成年雄性SD大鼠視神經(jīng)眼球后2mm處，用臨時(shí)迷你腦動(dòng)脈瘤夾夾傷5秒以制作壓榨傷模型。B為RITC標(biāo)記的損傷2周的視神經(jīng)，左側(cè)箭頭所指處為損傷區(qū)，其軸突聚成團(tuán)塊，右側(cè)方框所指為遠(yuǎn)側(cè)端，放大后C圖可見有 視神經(jīng)軸突通過，提示為不完全損傷模型，標(biāo)尺＝100μm。

圖2是腺相關(guān)病毒AAV2-Pim-1-eGFP轉(zhuǎn)染大鼠RGCs

大鼠玻璃體腔注射AAV2-Pim-1-eGFP后4周，行視網(wǎng)膜鋪片。其中A顯示視網(wǎng)膜大部分細(xì)胞和神經(jīng)纖維轉(zhuǎn)染上重組腺相關(guān)病毒2，表達(dá)綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率達(dá)50％。B顯示AAV2-Pim-1-eGFP成功轉(zhuǎn)染RGCs且轉(zhuǎn)染率達(dá)71％。C顯示AAV2-Pim-1-eGFP幾乎不轉(zhuǎn)染星型膠質(zhì)細(xì)胞。D顯示AAV2-Pim-1-eGFP轉(zhuǎn)染一部分無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞。A，B，C標(biāo)尺＝50μm；D標(biāo)尺＝15μm。

圖3是轉(zhuǎn)染后Pim-1在視網(wǎng)膜中的過表達(dá)

A代表Pim-1 mRNA在正常和視神經(jīng)損傷后各組視網(wǎng)膜中的表達(dá)。玻璃體分別注射生理鹽水、AAV2-GFP(空載體)和AAV2-Pim-1后4周(取材為正常)，進(jìn)行視神經(jīng)壓榨傷模型的制作，2周后(取材為損傷)，用Real-time PCR檢測(cè)Pim-1 mRNA在假手術(shù)組、空載體組、治療組及假手術(shù)組、單純損傷組、空載體組、治療組中的表達(dá)(n＝6，*P<0.05)。B代表Pim-1蛋白在正常和視神經(jīng)損傷后各組視網(wǎng)膜中的表達(dá)。玻璃體分別注射生理鹽水、AAV2-GFP和AAV2-Pim-1后4周，進(jìn)行視神經(jīng)壓榨傷模型的制作，2周后用Western blot檢測(cè)Pim-1蛋白在正常和視神經(jīng)損傷后各組視網(wǎng)膜中的表達(dá)(n＝6，***P<0.001，**P<0.01)。

圖4是Pim-1重組腺相關(guān)病毒2對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞的存活作用

其中A采用HE染色，觀察假手術(shù)組、單純損傷組、空載體組和治療組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞的存活情況；B為定量結(jié)果(n＝6，**P<0.01)；標(biāo)尺＝100μm。

圖5是Pim-1重組腺相關(guān)病毒2對(duì)RGCs的存活作用

其中A采用免疫組化(gamma synuclein特異性標(biāo)記RGCs)，觀察假手術(shù)組、單純損傷組、空載體組和治療組RGCs的存活情況；B為各組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層RGCs計(jì)數(shù)的定量結(jié)果(n＝6，**P<0.01)；標(biāo)尺＝100μm。其中C采用FITC-CTB標(biāo)記RGCs，各組視網(wǎng)膜鋪片，觀察從視網(wǎng)膜中央到外周不同位置FITC-CTB標(biāo)記RGCs的存活情況；D：各組視網(wǎng)膜上RGCs的計(jì)數(shù)(n＝6，**P<0.01)；標(biāo)尺＝20μm。

圖6是Pim-1重組腺相關(guān)病毒2對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞凋亡的影響

其中A采用各組眼球石蠟切片的TUNEL染色，觀察視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞的凋亡情況，細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡的細(xì)胞(箭頭所示)；B為各組視網(wǎng)膜節(jié) 細(xì)胞層細(xì)胞凋亡的計(jì)數(shù)(n＝6，*P<0.05)；標(biāo)尺＝100μm。

圖7是Pim-1重組腺相關(guān)病毒2表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建圖。

圖8是Ⅱ型腺相關(guān)病毒eGFP和Pim-1重組腺相關(guān)病毒2表達(dá)質(zhì)粒載體的線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說明。

實(shí)施例1：

1.目的基因片段的獲得

從GenBank中查詢Pim-1基因的序列，用VectorNTI軟件設(shè)計(jì)引物，以Pim-1基因CDS區(qū)的cDNA克隆為模板，采用PCR擴(kuò)增Pim-1基因片段。

PCR擴(kuò)增目的基因：使用高保真的PrimeSTAR酶擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系和條件如下：

表1：以Pim-1基因cDNA克隆為模板的擴(kuò)增體系

2.Pim-1重組腺相關(guān)病毒2表達(dá)載體構(gòu)建

(1)腺相關(guān)病毒2表達(dá)載體及目的基因PCR產(chǎn)物的酶切

將pAOV-CAGMINI-EGFP-2A-MCS-3FLAG載體(購(gòu)自Addgene公司)，使用NheI進(jìn)行酶切，同時(shí)將PCR產(chǎn)物使用NheI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收載體及目的基因DNA。

表2：pAOV-CAGMINI-eGFP-2A-MCS-3FLAG載體以及Pim-1基因PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系

(2)連接反應(yīng)

將酶切后的腺相關(guān)病毒2載體和Pim-1基因的PCR產(chǎn)物按照表1中的反應(yīng)體系進(jìn)行連接反應(yīng)。

表3：同源重組反應(yīng)體系

將載體和目的基因的酶切產(chǎn)物混合，4℃連接12小時(shí)，連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化。

(3)酶切產(chǎn)物的連接液轉(zhuǎn)化

1)取一感受態(tài)細(xì)胞置于冰上，待溶解后加入10μl連接液，混勻后在在冰中放置30min。

2)置于42℃恒溫水浴鍋中熱敷90s。

3)快速將其轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3min。

4)加900μlLB培養(yǎng)液，放置37℃搖床上，1h。

5)取恰當(dāng)量的轉(zhuǎn)化菌液涂布于LB瓊脂平板上。

6)倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃，16h。

(4)Pim-1基因腺相關(guān)病毒2質(zhì)粒陽(yáng)性克隆鑒定

1)挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，從中取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。

2)PCR反應(yīng)體系：

表4：PCR反應(yīng)體系

將上述體系配置好后混勻進(jìn)行PCR，94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃，10min；4℃，∞。

3)1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，根據(jù)電泳陽(yáng)性的結(jié)果挑選陽(yáng)性克隆，委托南京金斯瑞生物測(cè)序公司測(cè)序，基因大小939bp，如SEQ ID NO:1所示，測(cè)序結(jié)果表明Pim-1基因號(hào)1克隆為鑒定正確的陽(yáng)性克隆，可進(jìn)入腺相關(guān)病毒2包裝的實(shí)驗(yàn)流程。

(5)去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提

采用Axygen質(zhì)粒抽提試劑盒提取去內(nèi)毒素質(zhì)粒，具體抽提步驟如下：

1)過夜培養(yǎng)的5ml菌液用2ml做甘油菌保，剩余3ml分兩次于一個(gè)1.5ml離心管中12,000×g離心1分鐘，徹底去除上清；

2)加入250μl細(xì)菌懸浮液，振蕩器充分重懸細(xì)菌，接著加入250μl細(xì)菌裂解液，顛倒混勻4－6次；注意：不能劇烈混合，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA污染；

3)加入250μl細(xì)菌裂解液，五分鐘內(nèi)加入350μl中和液，輕輕顛倒混勻6－8次；12,000×g，離心10分鐘；

4)將上清轉(zhuǎn)移到小量純化柱中，小量純化柱插于廢液收集管中，12,000×g離心1分鐘；不要吸到沉淀，否則會(huì)出現(xiàn)基因組DNA和蛋白質(zhì)污染；棄收集管中的廢液，將小量純化柱插于收集管中，加700μl細(xì)菌裂解液到小量純化柱中，12,000×g離心1分鐘；重復(fù)該步驟一遍；棄收集管中的廢液，將小量純化 柱放入同一支收集管中，12,000×g離心1分鐘徹底去除細(xì)菌裂解液；

5)將小量純化柱放入新的干凈的1.5ml離心管中，加50μl 2.5mM Tris-HCl洗脫液，室溫放置1分鐘后，12,000×g離心1分鐘；離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒；

6)將抽提質(zhì)粒用EcorI和XhoI酶切鑒定，確定酶切后片段大小正確，測(cè)量質(zhì)粒濃度，用于腺相關(guān)病毒包裝。

3.Pim-1基因腺相關(guān)病2毒包裝

(1)腺相關(guān)病毒2載體系統(tǒng)質(zhì)?；拘畔?/p>

該病毒包裝系統(tǒng)為三質(zhì)粒系統(tǒng)，由AAV載體pAOV-CAGMINI-EGFP-2A-Pim-1-3FLAG、包裝質(zhì)粒pAAV-RC和輔助質(zhì)粒pHelper組成(所有質(zhì)粒均購(gòu)自Addgene公司)。目的基因Pim-1由CAGMINI啟動(dòng)子啟動(dòng)，具有神經(jīng)特異性的表達(dá)性質(zhì)。Pim-1基因插入到載體的MCS多克隆位點(diǎn)，基因的C端連接3×Flag。分別包裝含目的基因Pim-1的腺相關(guān)病毒2，以及不含目的基因Pim-1的對(duì)照腺相關(guān)病毒2(如圖8所示)。

(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染與病毒純化

1)將3×10⁶個(gè)AAV-293細(xì)胞接種于10cm²細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后用于轉(zhuǎn)染。

2)轉(zhuǎn)染前檢查傳代的AAV-293細(xì)胞，融合度達(dá)到70％-80％。

3)用PH＝7.5的TE緩沖液將質(zhì)粒的濃度調(diào)整到1mg/ml，根據(jù)包裝盤數(shù)計(jì)算所需的轉(zhuǎn)染體系和質(zhì)粒用量，吸取三種質(zhì)粒各10μl置于離心管中，加入1ml的0.3M CaCl₂，輕輕混合。

4)將混合后的DNA/CaCl₂/HBS溶液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)盤上，加入時(shí)同時(shí)輕輕晃動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)盤，使得溶液盡量均一的分布在培養(yǎng)基中，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。

5)轉(zhuǎn)染結(jié)束后，更換新鮮的培養(yǎng)基10ml，繼續(xù)培養(yǎng)66-72h。

6)將產(chǎn)毒的細(xì)胞連同培養(yǎng)基收集到15ml的離心管中，200g，3min，離心分離細(xì)胞和上清，將上清另外存放，細(xì)胞用1ml PBS重懸。

7)將細(xì)胞懸浮液在干冰乙醇浴和37℃水浴中反復(fù)轉(zhuǎn)移，凍融四次。每次凍融后稍加震蕩。

8)10000g離心去除細(xì)胞碎片，將離心上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新離心管中。

9)在上清中加入40％PEG8000直到終濃度8％，在冰上放置2h(每15min來(lái)回混勻一次)，2500g離心30min，去掉上清液，沉淀用PBS重懸后與細(xì)胞裂解上清合并。

10)3000g離心30min，將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管中(不要有細(xì)胞碎片)。

11)加入Benzonase核酸酶消化去除殘留的質(zhì)粒DNA，充分混合后在37℃孵育30min，用0.45μm過濾頭過濾，取出濾液。

12)向病毒濃縮液中添加固體CsCl(密度1.41g/ml)，振蕩溶解。

13)將樣品加入到超速離心管中，用預(yù)先配好的CsCl溶液將離心管剩余空間填滿。

14)175000g離心24h，形成密度梯度，按順序分布收集不同密度的樣品，收集AAV顆粒的組分，重復(fù)上述過程一次。

15)在Amicon-15超濾裝置中加入4ml離子水，將密度梯度離心得到的病毒液加入到超濾裝置中，加PBS至總體積為4ml。

16)1500g離心5-10min，每5min檢查一次剩余體積數(shù)，直到最終體積為200-250μl。

17)將濾除液收集到一起做消毒處理，濾膜放回到裝置中。

18)加1×PBS稀釋濃縮后的病毒使體積為4ml，重復(fù)上述過程3次，離心超濾管，使最終體積大約為0.5ml，取樣用于病毒滴度檢測(cè)。

19)病毒液分裝后，-80℃保存。

(3)腺相關(guān)病毒2滴度測(cè)定

使用定量PCR測(cè)定病毒滴度：

1)梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和待測(cè)樣品至原濃度10^-5，10^-6，10^-7，10^-8。

2)定量PCR的反應(yīng)體系

表5：定量PCR反應(yīng)體系

3)在每個(gè)反應(yīng)孔中加入反應(yīng)液15μl，然后加入5μl的模板。

4)上機(jī)，退火溫度設(shè)為60℃，按照標(biāo)準(zhǔn)操作得到Ct值并計(jì)算AAV樣品中的拷貝數(shù)。

實(shí)施例2：

1.大鼠視神經(jīng)壓榨傷模型的建立

每組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常規(guī)消毒后，按照每只大鼠10％水合氯醛(0.4ml/100mg)進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后備皮大鼠的左眼，置于顯微鏡下進(jìn)行手術(shù)。用顯微剪在角膜緣處剪開球結(jié)膜，然后用顯微鑷進(jìn)行鈍性剝離直至球后，操作過程中不要傷及血管和其他組織以免造成出血，充分暴露出視神經(jīng)，在球后2mm處采用臨時(shí)動(dòng)脈瘤夾夾傷5s(具體操作參照本發(fā)明人已發(fā)表文獻(xiàn)[31]Wang R,Xu J,Xie J,et al.Hyperbaric oxygen preconditioning promotes survival of retinal ganglion cells in a rat model of optic nerve crush.J Neurotrauma.2010(27):763-770.)模擬臨床造成視神經(jīng)不完全損傷(如圖1所示)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

(1)假手術(shù)組：暴露視神經(jīng)不損傷，玻璃體注射生理鹽水；

(2)單純損傷組：暴露視神經(jīng)并損傷，玻璃體注射生理鹽水；

(3)空載體組：損傷視神經(jīng)，玻璃體注射AAV2-GFP；

(4)治療組：損傷視神經(jīng)，玻璃體注射AAV2-Pim-1；

3.Pim-1重組腺相關(guān)病毒2轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜以及轉(zhuǎn)染后Pim-1的過表達(dá)

玻璃體腔注射AAV2-Pim-1 4周后，全身灌注取材，取出眼球后固定于4％多聚甲醛中1天，蔗糖梯度脫水后，行冰凍切片，然后分別與RGCs特異性標(biāo)記物gamma-synuclein、星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物GFAP的免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)AAV2-Pim-1轉(zhuǎn)染大部分的RGCs，效率約為70％以上；而幾乎不轉(zhuǎn)染星型膠質(zhì)細(xì)胞。玻璃體腔注射AAV2-Pim-1 4周后，全身灌注取材，取出眼球后固定于4％多聚甲醛中，4-6小時(shí)后行視網(wǎng)膜鋪片，DPAI染核后，熒光顯微鏡觀察，可見AAV2-Pim-1轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜上的大部分細(xì)胞和神經(jīng)纖維，呈綠色熒光；與無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞特異性標(biāo)記物HPC-1熒光共定位后，觀察到AAV2-Pim-1轉(zhuǎn)染一部分的無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞(如圖2所示)。

采用免疫組織化學(xué)、Real-time PCR以及Western blot的方法觀察Pim-1腺相關(guān)病毒2轉(zhuǎn)染大鼠視網(wǎng)膜后，Pim-1分子、Pim-1 mRNA和Pim-1蛋白在正 常及視神經(jīng)損傷后各組視網(wǎng)膜中的過表達(dá)情況(如圖3所示)。

4.Pim-1過表達(dá)對(duì)受損視神經(jīng)及其RGCs的保護(hù)作用

(1)Pim-1過表達(dá)對(duì)RGCs層細(xì)胞數(shù)的影響

HE染色：將各組的眼球取出經(jīng)流水過夜，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后行HE染色，從形態(tài)上觀察RGCs層細(xì)胞數(shù)量。定量結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后2周，Pim-1重組腺相關(guān)病毒2增加了RGCs層細(xì)胞的數(shù)量(如圖4所示)。

(2)Pim-1過表達(dá)對(duì)RGCs的存活作用

1)免疫組織化學(xué)：各組SD大鼠全身灌注后，取眼球常規(guī)石蠟包埋，一抗采用gamma synuclein兔多克隆抗體，另外不加一抗組作為陰性對(duì)照。DAB顯色觀察RGCs存活情況。視神經(jīng)損傷后2周，Pim-1重組腺相關(guān)病毒2對(duì)RGCs的存活有促進(jìn)作用(如圖5A、B所示)。

2)CTB標(biāo)記RGCs：各組大鼠取材前2天，玻璃體注射熒光素標(biāo)記的霍亂毒素B亞單位(CTB)，動(dòng)物存活2天后，全身灌注取材視網(wǎng)膜后行視網(wǎng)膜鋪片，以視乳頭為中心呈十字花瓣剪開視杯，剝離出視網(wǎng)膜，將視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層朝上，抗熒光衰減劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個(gè)象限取3個(gè)視野(20×10)拍照，分別在視網(wǎng)膜的中央、中間和外周，并采用Image-Pro Plus6.0圖像處理軟件對(duì)CTB標(biāo)記的RGCs進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。視神經(jīng)損傷后2周，Pim-1過表達(dá)后促進(jìn)了視網(wǎng)膜的RGCs的存活(如圖5C、D所示)。

(3)Pim-1過表達(dá)對(duì)RGCs層細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)

各組視網(wǎng)膜石蠟切片后行TUNEL染色，細(xì)胞核呈棕黃色為凋亡的細(xì)胞，觀察Pim-1過表達(dá)后對(duì)RGCs層細(xì)胞的凋亡情況，定量結(jié)果顯示視神經(jīng)損傷后2周，Pim-1重組腺相關(guān)病毒2過表達(dá)減少了RGCs層細(xì)胞凋亡數(shù)，對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用(如圖6所示)。

(4)Pim-1重組腺相關(guān)病毒2對(duì)視神經(jīng)再生的作用

于大鼠玻璃體腔注射羅丹明(RITC)，2天后取材視神經(jīng)，觀察RGCs軸突再生的情況。視神經(jīng)置于4％PFA，4℃固定過夜，經(jīng)30％蔗糖脫水沉底。視神經(jīng)置于已經(jīng)用冷凍切片機(jī)切平的OCT膠上，后用OCT膠包埋，-20℃凍存。于-20℃冷凍切片機(jī)中縱向連續(xù)切片，厚度為9μm。37℃烤箱烤干，碳酸甘油封片后熒光顯微鏡下觀察RITC示蹤軸突的情況。

5.Pim-1過表達(dá)對(duì)視功能恢復(fù)的作用

1)瞳孔對(duì)光反射

各組動(dòng)物(假手術(shù)組、單純損傷組、空載體組、治療組，n＝6)，損傷后2周，麻醉后，于暗室適應(yīng)30min后，將未做手術(shù)側(cè)眼睛用錫箔紙避光，用一定的光線刺激手術(shù)側(cè)眼睛，采用體視顯微鏡拍照(實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[32]de Lima S,Koriyama Y,Kurimoto T,et al.Full-length axon regeneration in the adult mouse optic nerve and partial recovery of simple visual behaviors.Proc Natl Acad Sci U S A,2012(109):9149-54)。屏幕錄像專家軟件開始記錄左眼瞳孔從最大縮小至最小的時(shí)間，并檢測(cè)每組最小瞳孔的直徑和最大瞳孔的直徑比，每隔5min重復(fù)一次，至少重復(fù)5次。

2)閃光視覺誘發(fā)電位

各組動(dòng)物麻醉后，用直徑約為5mm鉆頭的電鉆在右側(cè)的大腦皮質(zhì)枕葉區(qū)先造成顱骨缺損，但不能損傷硬腦膜，隨后固定大鼠于腦立體定位儀上，刺激參數(shù)設(shè)置：波寬為5-10ms，幅度為10v，延時(shí)為32s，分別疊加30次，選出穩(wěn)定的波形，記錄視覺誘發(fā)電位P波的潛伏期和波幅，檢測(cè)其閃光視覺誘發(fā)電位。具體方法(參見文獻(xiàn)[33]Pangratz-Fuehrer S,Kaur K,Ousman SS,et al.Functional rescue of experimental ischemic optic neuropathy with alphaB-crystallin.Eye(Lond),2011(25):809-17)。

以上已對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請(qǐng)權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)

<120> 一種攜帶Pim-1基因的腺相關(guān)病毒2及其在修復(fù)受損視神經(jīng)中的應(yīng)用

<130> /

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgctcttgt ccaagatcaa ctccctggcc cacctgcgcg cagccccttg caacgacctg 60

cacgccaaca agctggcgcc gggcaaagag aaggagcccc tggagtcgca gtaccaggtg 120

ggcccgctgt tgggcagcgg tggcttcggc tcggtctact cgggcatccg cgtcgccgac 180

aacttgccgg tggccatcaa gcacgtggag aaggaccgga tttccgactg gggggaactg 240

cccaacggca cccgagtgcc catggaagtg gtcctgctga agaaggtgag ctcgggcttc 300

tcgggcgtca ttagacttct ggactggttc gagaggcccg atagtttcgt gctgatcctg 360

gagaggcccg aacccgtgca agacctcttc gacttcatca ccgagcgagg agccctccag 420

gaggagctgg cccggagctt cttctggcag gtgctggagg ccgtgcggca ttgccacaac 480

tgcggggttc tccaccgcga catcaaggac gagaacatct taatcgacct gaaccgcggc 540

gaactcaaac tcatcgactt cgggtcgggg gcgctgctca aggacacagt ctacacggac 600

tttgacggaa cccgagtgta cagtcctcca gagtggattc gctaccatcg ctaccacggc 660

aggtcggctg ctgtttggtc cctggggatc ctgctctatg acatggtctg cggagatatt 720

ccatttgagc acgacgaaga gatcgtcaag ggccaagtgt actttaggca aagggtctct 780

tcagaatgtc aacatcttat tagatggtgc ctgtccctga gaccatcgga ccggccctcc 840

tttgaagaaa tccagaacca tccgtggatg caggatgttc tcctgcccca ggccaccgcc 900

gagattcatc tgcacagcct gtcaccatca cccagcaaa 939

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catggtcctg ctggagttcg tg 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catagcgtaa aaggagcaac a 21