本發(fā)明屬于生物工程及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及一株過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
：嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus，La.)是第三代乳制品發(fā)酵劑，在食品和醫(yī)藥工業(yè)上常用作發(fā)酵劑及益生菌制品。其廣泛存在于人及一些動(dòng)物的腸道中，具有耐酸和耐膽酸鹽能力，能順利通過(guò)腸胃環(huán)境定植于動(dòng)物腸道形成優(yōu)勢(shì)種群，當(dāng)其達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，能夠起到很好的保健作用。主要包括以下幾個(gè)方面：增強(qiáng)機(jī)體免疫力、緩解乳糖不耐癥、延緩機(jī)體衰老、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。冷凍干燥法是制備乳酸菌發(fā)酵劑的主要技術(shù)之一。采用冷凍干燥法制備的發(fā)酵劑具有單位含菌量高、接種量小、運(yùn)輸方便、保存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于長(zhǎng)期保存，是目前應(yīng)用最廣泛的菌種保藏方法。尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）是糖代謝中一種重要的酶，它能催化反應(yīng)UTP+葡萄糖-1-磷酸?UDPG（尿苷二磷酸葡萄糖）+PPi。UDPG是重要的核苷酸糖之一，是主要活化糖的形式，參與蔗糖、纖維素、胼胝質(zhì)等的合成。而UDPG的主要來(lái)源是通過(guò)UGPase的催化下生成的，因此UGPase催化的這一反應(yīng)將關(guān)系到下游的二糖或多糖的代謝。UGPase可能與乳酸菌抗凍干脅迫有關(guān)。目前，通過(guò)優(yōu)化凍干保護(hù)劑配方來(lái)提高凍干存活率的報(bào)道已經(jīng)很多，而從嗜酸乳桿菌的遺傳及生理學(xué)角度對(duì)其凍干存活率的影響的報(bào)道甚是少見。因此，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)改造菌株來(lái)提高嗜酸乳桿菌凍干存活率具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能顯著提高凍干存活率的過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625），所述基因來(lái)自于嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）的基因。其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。上述過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：（1）重組表達(dá)載體pMG-LBA0625的構(gòu)建以嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；將表達(dá)載體pMG36e用限制性內(nèi)切酶HindⅢ單酶切，并去磷酸化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入到表達(dá)載體pMG36e組成型啟動(dòng)子P32下游多克隆位點(diǎn)，在50℃反應(yīng)15min，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMG-LBA0625；（2）重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建將pMG-LBA0625過(guò)表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒小量提取試劑盒提取濃縮后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入至嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356中，37℃復(fù)蘇2h后，涂布紅霉素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)36h，篩選轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR進(jìn)行驗(yàn)證，從而獲得過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1。所述的PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游擴(kuò)增引物：TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT；LBA0625下游擴(kuò)增引物：GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC。所述的PCR擴(kuò)增程序如下：（1）94℃4min；（2）98℃10sec，60℃5sec，72℃1min；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；（3）72℃5min；PCR反應(yīng)體系如下表所示：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture4μL，20mM正向引物1μL，20mM反向引物1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5μL，用蒸餾水補(bǔ)足至50μL。所述的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和所述的表達(dá)載體pMG36e摩爾比為2∶1。所述的電轉(zhuǎn)化具體步驟如下：（1）嗜酸乳桿菌感受態(tài)的制備將一環(huán)嗜酸乳桿菌ATCC4356接種至20mLM17培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)得到種子液；將5mL種子液接入100mL含0.5wt%葡萄糖和0.5wt%甘氨酸的M17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD≈0.8；于3000rpm，離心10min，收集菌體，無(wú)菌水洗3次之后，用20mL預(yù)冷的A液洗滌細(xì)胞2次，于3000rpm，離心10min，收集菌體，即得到感受態(tài)嗜酸乳桿菌細(xì)胞；然后用預(yù)冷的0.5mLA液重懸，80μL分裝備用，再直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，或-80℃保存感受態(tài)細(xì)胞；其中所述的A液為含有10wt%甘油和10wt%蔗糖的超純水溶液；（2）嗜酸乳桿菌的電轉(zhuǎn)將感受態(tài)嗜酸乳桿菌細(xì)胞和1～5μg過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMG-LBA0625轉(zhuǎn)移到冰冷的0.1cm間隙的電極杯中，以1.5kv，25μF，200Ω，5.1ms脈沖轉(zhuǎn)化；然后迅速往電極杯中加入1mL預(yù)冷MRS培養(yǎng)基，于37℃復(fù)蘇2h，即感受態(tài)嗜酸乳桿菌導(dǎo)入過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMG-LBA0625。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明首次公開了一株能顯著提高凍干存活率的過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）基因及其重組嗜酸乳桿菌PLY127-1的構(gòu)建方法。通過(guò)克隆嗜酸乳桿菌ATCC4356（lactobacillusacidophilusATCC4356）的UGPase基因（LBA0625）片段連接到pMG36e表達(dá)載體上，利用電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到嗜酸乳桿菌中，通過(guò)紅霉素抗性篩選并鑒定獲得帶有目的基因的重組菌，即過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1。該重組嗜酸乳桿菌比PLY127-0菌株的酶活提高了41.11%，并在以水、10%蔗糖、10%葡萄糖等保護(hù)劑為冷凍干燥保護(hù)劑時(shí)，其凍干存活率比空載嗜酸乳桿菌PLY127-0菌株分別提高了15.94%、19.97%、26.75%，其首次構(gòu)建了一株能顯著提高凍干存活率的過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1，為制備高活性發(fā)酵劑和微生態(tài)制劑奠定研究基礎(chǔ)和技術(shù)支持。附圖說(shuō)明圖1為過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；Lane1、2為目的基因LBA0625PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物；圖2為表達(dá)載體pMG36e經(jīng)HindⅢ單酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果；Lane1、2為pMG36e經(jīng)HindⅢ單酶切并去磷酸化的驗(yàn)證結(jié)果圖；圖3為pMG-LBA0625重組質(zhì)粒圖譜；圖4為重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與空載嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-0的酶活測(cè)定結(jié)果圖；圖5為用無(wú)菌水做凍干保護(hù)劑獲得的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率；圖6為用10wt%蔗糖溶液做凍干保護(hù)劑獲得的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率；圖7為用10wt%葡萄糖溶液做凍干保護(hù)劑獲得的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1重組表達(dá)載體pMG-LBA0625的構(gòu)建1、設(shè)計(jì)PCR引物用于擴(kuò)增過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因片段，PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游擴(kuò)增引物：TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT；LBA0625下游擴(kuò)增引物：GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC。2、以嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356（該嗜酸乳桿菌已保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為1.1878）基因組DNA為模板，進(jìn)行如下PCR程序：（1）94℃4min；（2）98℃10sec；（3）60℃5sec；（4）72℃1min；（5）72℃5min；其中步驟（2）-（4）重復(fù)30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)體系如下表所示：表2試劑用量/μL5×PrimeSTARBuffer10dNTPMixture420mM正向引物120mM反向引物1模板DNA2PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5ddH2O31.5Total50圖1為目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，其中Lane1、2為基因LBA0625PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物，由產(chǎn)物條帶位置可以看出產(chǎn)物分子量大小大致正確。3、將表達(dá)載體pMG36e用限制性內(nèi)切酶HindⅢ單酶切，并去磷酸化，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物插入到表達(dá)載體pMG36e組成型啟動(dòng)子P32下游多克隆位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體以2∶1的摩爾比用無(wú)縫克隆試劑盒在50℃反應(yīng)15min，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMG-LBA0625；圖2為表達(dá)載體pMG36e經(jīng)HindⅢ單酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果，由圖2可知載體酶切完全，并且條帶位置正確。圖3為pMG-LBA0625重組質(zhì)粒圖譜，是將PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體pMG36e中，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pMG-LBA0625。實(shí)施例2嗜酸乳桿菌基因工程菌PLY127-1、PLY127-0的構(gòu)建將實(shí)施例1制備得到的pMG-LBA0625過(guò)表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)質(zhì)粒小量提取試劑盒提取濃縮后電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入至嗜酸乳桿菌ATCC4356，37℃復(fù)蘇2h后，涂布紅霉素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)36h，篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證，從而獲得過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1。同時(shí)將未處理的表達(dá)載體pMG36e經(jīng)質(zhì)粒小量提取試劑盒提取及濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化導(dǎo)入至嗜酸乳桿菌ATCC4356，37℃復(fù)蘇2h后，涂布紅霉素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)36h，篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證，從而獲得空載嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-0。上述質(zhì)粒濃縮詳細(xì)步驟如下：向提取的pMG36e質(zhì)粒中（質(zhì)粒濃度為200μg/μL）中加入DNA溶液1/10倍體積乙酸鈉（3mol/L，pH=5.2）充分混勻，使其終濃度為0.3mol/L；加入DNA溶液2倍體積用冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，充分混勻置于-20℃條件下30min；離心（12,000×g，10min），小心移除上清液，吸走管壁上的液滴；加入1/2離心管容量的70wt%乙醇溶液，離心（12,000×g，2min）；將EP管開蓋，于室溫下使殘留液體揮發(fā)至干；加入適量ddH2O溶解DNA，濃縮后的質(zhì)粒濃度大約為1mg/mL。上述電轉(zhuǎn)化具體步驟如下：1、嗜酸乳桿菌感受態(tài)的制備：將一環(huán)嗜酸乳桿菌ATCC4356接種至20mLM17培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)得到種子液；將5mL種子液接入100mL含0.5wt%葡萄糖和0.5wt%甘氨酸的M17培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD≈0.8；于3000rpm，離心10min，收集菌體，無(wú)菌水洗3次之后，用20mL預(yù)冷的A液（含有10wt%甘油和10wt%蔗糖的超純水溶液）洗滌細(xì)胞2次，于3000rpm，離心10min，收集菌體，即得到感受態(tài)嗜酸乳桿菌細(xì)胞；然后用預(yù)冷的0.5mLA液重懸，80μL分裝備用，再直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，或-80℃保存感受態(tài)細(xì)胞。2、嗜酸乳桿菌的電轉(zhuǎn)將步驟1制備得到的感受態(tài)嗜酸乳桿菌細(xì)胞和1～5μg過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pMG-LBA0625轉(zhuǎn)移到冰冷的0.1cm間隙的電極杯中，以1.5kv，25μF，200Ω，5.1ms脈沖轉(zhuǎn)化；然后迅速往電極杯中加入1mL預(yù)冷MRS培養(yǎng)基，于37℃復(fù)蘇2h；將菌液涂布在抗性平板上，于37℃培養(yǎng)直到平板上出現(xiàn)菌落。實(shí)施例3嗜酸乳桿菌工程菌的酶活測(cè)定將實(shí)施例2制備的重組嗜酸乳桿菌PLY127-1接種于MRS肉湯培養(yǎng)基（配方為：以1000ml蒸餾水為基準(zhǔn)，酵母浸出液(BR)5g，牛肉浸膏(BR)10g，蛋白胨(BR)10g，吐溫-801g，硫酸錳0.05g，硫酸鎂0.5g，乙酸鈉5g，葡萄糖20g，檸檬酸三銨2g，磷酸二氫鉀2g，121°C滅菌15分鐘））中，于37℃靜止培養(yǎng)活化18h，制備種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液以2％(v/v)的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，于5000rpm離心15min后棄上清，菌體用生理鹽水洗3次后，超聲破碎提取蛋白，于10,000×g離心20min后，取其上清用UGPase試劑盒檢測(cè)酶活(如圖4所示)，同理測(cè)定空載嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-0的酶活(如圖4所示)。由圖4可知，LBA0625基因過(guò)表達(dá)重組基因工程菌的酶活為465.17U/L，比PLY127-0菌株酶活329.65U/L提高了41.11%。實(shí)施例4嗜酸乳桿菌工程菌凍干存活率的測(cè)定方法1、用無(wú)菌水做凍干保護(hù)劑，比較重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率將冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化18h，得種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以2％（v/v）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，得發(fā)酵液；將20mL發(fā)酵液離心收集沉淀，用生理鹽水洗3次后，再加入1mL無(wú)菌水，取100μL菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，剩下的放入-80℃冰箱過(guò)夜預(yù)凍；將預(yù)凍好的樣品冷凍干燥（-49℃，9Pa）24h，取出樣品，每管加900μL無(wú)菌水重懸菌體，取100μL進(jìn)行計(jì)數(shù)。凍干存活率=凍干前活菌數(shù)/凍干后活菌數(shù)。結(jié)果如圖5所示，用無(wú)菌水做凍干保護(hù)劑時(shí)，PLY127-1凍干存活率相比于PLY127-0提高了15.94%。2、用10wt%蔗糖溶液做凍干保護(hù)劑，比較重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率將冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化18h，得；將種子培養(yǎng)液以2％（v/v）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，得發(fā)酵液；將20mL發(fā)酵液離心收集沉淀，用生理鹽水洗3次后，再加入1mL10wt%蔗糖溶液，取100μL菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，剩下的放入-80℃冰箱過(guò)夜預(yù)凍；將預(yù)凍好的樣品冷凍干燥（-49℃，9Pa）24h，取出樣品，每管加900μL無(wú)菌水重懸菌體，取100μL進(jìn)行計(jì)數(shù)。凍干存活率=凍干前活菌數(shù)/凍干后活菌數(shù)。結(jié)果如圖6所示，用10%蔗糖做凍干保護(hù)劑時(shí)，PLY127-1凍干存活率相比于PLY127-0提高了19.97%。3、用10wt%葡萄糖溶液做凍干保護(hù)劑，比較重組嗜酸乳桿菌PLY127-1與重組空載菌PLY127-0的凍干存活率將冷藏于-40℃冰箱的嗜酸乳桿菌工程菌PLY127-1、PLY127-0分別接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中活化18h，得種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液以2％（v/v）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)18h，得發(fā)酵液；將20mL發(fā)酵液離心收集沉淀，用生理鹽水洗3次后，再加入1mL10%葡萄糖,取100μL菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，剩下的放入-80℃冰箱過(guò)夜預(yù)凍；將預(yù)凍好的樣品冷凍干燥（-49℃，9Pa）24h，取出樣品，每管加900μL無(wú)菌水重懸菌體，取100μL進(jìn)行計(jì)數(shù)。凍干存活率=凍干前活菌數(shù)/凍干后活菌數(shù)。結(jié)果如圖7所示，用10%葡萄糖做凍干保護(hù)劑時(shí)，PLY127-1凍干存活率相比于PLY127-0提高了26.75%。上述說(shuō)明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>寧波大學(xué)<120>過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組嗜酸乳桿菌的構(gòu)建方法<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>903<212>DNA<213>人工序列<220><223>過(guò)表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因<400>1ATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGCAGCTGGGTTAGGTACTAGATTCTTACCTGCAACTAAAGCTTTGCCAAAAGAAATGTTACCAATTGTTGATAAGCCAACAATTCAATTTATTGTTGAAGAAGCTAAAAAATCTGGAATTGAAGATATCCTGATTATTATTGGTAAAAATAAGCGCCCAATTGAAGACCATTTTGATGCAAATCCTGAACTAGAACAGGATTTGAAGGAAAAAGGGAAAGATGAACTTCTTGAATTAACTCAGGGAATTACTAATTTGGGTGTTAACTTATATTACACTAGACAACCTCATCCAGCAGGCCTTGGAGATGCAATTTATCGTGCCCGTAGTTTTGTTGGAGATGAACCTTTTGTAGTTATGCTTGGTGATGATTTGATGGACGACAAAGTTCCATTAACTAAGCAATTAATTGATCGATACAACAAGACTCATGCCTCAACTATTGCTGTTATGCCAGTACCACATGAAGAAGTATCAAAATATGGTGTTATCGAACCAGAAAATGAAATTTTACCTGGTTTAATTAACGTTAAGTCATTTGTCGAAAAACCAGATGTTGACAAGGCACCAAGTGACTATGCAATTATTGGCCGCTATTTGTTAATGCCTGAAATTTTTGAAATTTTAGCAAATCAAAAACCAGGTCGTGGTGGAGAAATCCAATTAACTGATGCCATTGATACAATGAATAAGACTCAACGTGTATTTGCCCATGTCTTTAAGGGTGAACGTCATGATGTTGGTAACAAAGAAGGATATCTTGAAACTTCAATTGAATATGGTTTAAAGCATCCAGAAATTAAAGATCAATTGCGTGAATATATTCAACGCTTAGGCAAAAAATTTGAAGCTGAAGATAAGCGAAAAAATAAATAA903<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>LBA0625上游擴(kuò)增引物<400>2TCGACCTGCAGGCATGCAATGCACCATCATCACCATCATATGAAAGTAAGAAAAGCTAT29<210>3<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>LBA0625下游擴(kuò)增引物<400>3GTTTTCAGACTTTGCAAGCTTTATTTATTTTTTCGCTTATC41當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3