本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體地說，涉及一種我國北方荒漠化地區(qū)防風固沙樹種沙地柏(Sabina vulgaris.)有關氮營養(yǎng)及堿脅迫感應基因CML9(Q6-1)。本發(fā)明選用內蒙古蒙草抗旱股份有限公司苗木基地的樹種沙地柏為實驗材料，運用Illumina Solexa轉錄組高通量測序的方法，獲得該樹種的氮營養(yǎng)及堿脅迫感應基因，對候選氮營養(yǎng)及堿脅迫感應的基因CML9(Q6-1)進行生物信息學分析，同時對其進行不同元素的表型分析，更直觀的了解基因的生理學功能。

背景技術：

沙地柏(Sabina vulgaris.)，又名叉子圓柏、新疆圓柏，主要分布于內蒙古、陜西、新疆、寧夏、甘肅、青海等地。主要培育基地有江蘇、浙江、安徽、湖南等地。沙地柏能忍受風蝕沙埋，長期適應干旱的沙漠環(huán)境，是干旱、半干旱地區(qū)防風固沙和水土保持的優(yōu)良樹種。喜光，喜涼爽干燥的氣候，耐寒、耐旱、耐瘠薄，對土壤要求不嚴，不耐澇，在肥沃通透土壤成長較快。適應性強，扦插宜活，栽培管理簡單，這種生命力堅強的常綠植物在北方綠化和造林中具有舉足重輕的作用，所以研究沙地柏，對于野生植物抗旱相關基因的開發(fā)和利用具有重要意義。目前對于沙地柏的研究主要集中在生理和生態(tài)特性方面，在關于其抗旱基因的克隆及利用方面均無報道。

我國植物分子育種能力同發(fā)達國家差距巨大，擁有自主知識產權的抗逆基因是世界植物分子育種領域競爭的焦點。對于植物抗逆基因的開發(fā)及利用，目前的研究主要集中于模式植物擬南芥或水稻、小麥等作物中，缺乏對野生植物體內豐富的抗逆基因的挖掘。本發(fā)明正是利用Illumina公司的高通量測序技術，對我國北方荒漠化地區(qū)防風固沙首選樹種沙地柏進行轉錄組測序，獲得了一種經自然環(huán)境長期篩選出的抗旱相關基因CML11。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是的利用分子克隆技術，對有關鈣營養(yǎng)及干旱信號感應基因CML11進行克隆，最終得到用于基因表達的表達載體，從而使該基因導入到擬南芥野生植物中并在野生植物體內表達，再通過表型分析進一步驗證該基因的功能。

本發(fā)明的實施方案是選用內蒙古蒙草抗旱有限公司苗木基地的沙地柏為實驗材料，采用Illumina Solexa轉錄組高通量測序的方法，對其轉錄組序列鑒定分析，確定Ca2+結合蛋白種類和數量，從而獲得沙地柏有關鈣營養(yǎng)及干旱信號感應基因CML11的核苷酸序列，通過分子克隆技術獲得該基因，并將其導入到擬南芥中，最終獲得轉基因植株，通過對轉基因植株進行表型分析了解基因的生物學功能。

本發(fā)明的一個目的在于提供新的沙地柏抗旱相關基因，定名為CML11，其序列為SEQ No.1的序列。

本發(fā)明涉及一種在沙地柏根內表達量較高的基因，名稱為CML11，其核苷酸序列如序列表中SEQ NO.1或SEQ NO.2所示，其編碼的194個氨基酸序列，如序列表中SEQ NO.3所示。

具體地說，本發(fā)明提供了含有下述序列之一的分離的多核苷酸：

(1)序列表中的SEQ NO.1或SEQ NO.2

(2)與序列表中的SEQ NO.1或SEQ NO.2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列；

上述涉及的多核苷酸還包括取代、缺失和插入突變體以及等位變體、剪接變體、片段、衍生物等。

本領域技術人員可以理解的是，上述的分離的多核苷酸也包括那些與SEQ NO.1或SEQ NO.2所示序列具有較高同源性的序列，例如同源性大于95％，或90％，甚至85％的序列；還包括那些在嚴謹條件下可與SEQ NO.1或SEQ NO.2所示序列雜交的序列；或者可與SEQ NO.1或SEQ NO.2的序列互補的序列。

本發(fā)明同時提供了將本發(fā)明的新基因CML11應用于植物抗旱基因工程的技術方案。

本發(fā)明從沙地柏中成功地分離獲得了一種經自然環(huán)境長期篩選出的抗相關基因CML11，這給利用基因工程技術培育抗旱植物提供了新的方向，對干旱脅迫下的分子育種工作具有重要意義。具體來說，本發(fā)明的具體實施方案之一是將CML11基因應用于植物基因工程以提高植物在干旱脅迫下的生存能力。

以上概括的描述了本發(fā)明，可通過參照本文提供的某些具體實施例進一步理解本發(fā)明，這些實施例僅是為了說明而不是限制本發(fā)明。

附圖說明

圖1：實驗總流程圖。

圖2：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在CK、0μM Ca²⁺、1μM ABA這三個濃度培養(yǎng)基上的葉子的表型圖(A)和鮮重圖(B)，從圖中可以更清晰的看到轉基因植物的葉片在0μM Ca²⁺、1μM ABA上的敏感表型。

圖3：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在0μM NO₃^-、0μM PO₄^3-、pH 7.0、100mM NaCl這四個濃度梯度培養(yǎng)基上的葉子的表型圖(A)和鮮重圖(B)，從圖3中可以看到轉基因植株的葉片與野生型Col-0植株沒有差異。

圖4：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在0μM Ca²⁺、1μM ABA、這二個濃度培養(yǎng)基上整株苗的表型圖，從圖4表型圖中可以看出轉基因植物在低鈣條件下與野生型Col-0相比有著明顯的葉黃而小、根短的敏感表型，同時在1μM ABA培養(yǎng)環(huán)境下也表現出葉小、根短的敏感表型。

圖5：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在：0μM Ca²⁺、1μM ABA、這二個濃度培養(yǎng)基上植株的根長圖，從圖5根長圖中可以看出轉基因植物在低鈣條件下與野生型Col-0相比有著明顯根短的敏感表型，同時在1μM ABA培養(yǎng)環(huán)境下也表現出根短的敏感表型。

圖6：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在100mM NaCl、0μM NO₃^-、0μM pO₄^3-、pH 7.0這四個濃度培養(yǎng)基上整株苗的表型圖，從圖6中可以看到在低氮、低磷、100mMNaCl及堿性生長環(huán)境下轉基因植物與野生型植物都沒有明顯的區(qū)別。

圖7：抗旱基因CML11四種T₃代植株分別在100mM NaCl、0μM NO₃^-、0μM PO₄^3-、pH 7.0這四個濃度培養(yǎng)基上植株的根長，從圖6中可以看到在低氮、低磷、100mM NaCl及堿性生長環(huán)境下轉基因植物與野生型植物都沒有明顯的區(qū)別。

圖8：表型分析中培養(yǎng)皿的種植方式。

具體實施方式

實施例1、沙地柏樣品采集

為了最大限度的增加其體內和抗逆性相關的RNA的豐富度，選擇在天氣相對寒冷的12月(2013年)進行沙地柏根的取樣，樣品在收集后迅速保存于液氮中備用。

實施例2、表達載體的構建

1、由于沙地柏植物的RNA較難提取，所以我們前期的目的基因是由南京金斯瑞公司合成的，后續(xù)表達載體的構建是用公司合成好的基因來完成的。合成基因所用的克隆載體是pUC57-Simple，抗性是Amp。

2、目的載體的連接和構建的完成

本發(fā)明中用到的表達載體是pOREE3，其抗性為Kan。

目的載體的連接是將合成好的的基因片段和目的載體同時經過5’：BamH I 3′：Kpn I的酶切，經過DNA膠回收，DNA連接酶連接，然后轉化大腸桿菌，經過菌落PCR和提取質粒，酶切驗證的方法，最終獲得連接到的載體基因的質粒。

雙酶切反應體系：

a、目的片段與表達載體的連接：

原則：按照目的片段和表達載體摩爾比是3∶1或1∶3的比例進行連接

T4DNA連接酶(1μl)+buffer(2μl)+17μl(目的片段+表達載體)

16℃過夜連接

b、轉化：取大腸桿菌感受態(tài)于冰上解凍，將連有目的片段和表達載體的產物再次轉化到大腸桿菌感受態(tài)里，混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，立即置于冰上2分鐘；加入500μl無抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床上200rpm或37℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)60分鐘后，將菌液涂布與含有相應抗生素(Kan 50mg/ml)的固體LB平板上；37℃倒置培養(yǎng)過夜后觀察其結果。

c、挑取菌板上的單菌落加入到含有Kan(50mg/ml)抗生素的5ml LB培養(yǎng)液里，37℃搖床過夜培養(yǎng)。

d、質粒提?。哼x用TRAN的質粒提取試劑盒提取質粒

1)、取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細菌沉淀，不應留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，顏色由半透亮變?yōu)橥噶了{色，指示完全裂解(不宜超過5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000x g離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH＞7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000xg離心1分鐘，洗脫出的DNA于-20℃保存

e、酶切驗證：繼續(xù)選用前面所用的限制性內切酶5’：BamH I 3′：Kpn I對陽性克隆質粒進行驗證。

雙酶切反應體系

37℃恒溫培養(yǎng)箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取帶型正確的進行保菌(40％黃蓋甘油)

3、農桿菌轉化：電轉化法轉化農桿菌

1)、取農桿菌感受態(tài)，置于冰上融化，加入質粒約5μl，混勻后冰上放置30分鐘。

2)、同時準備干凈干燥的電轉杯，冰上預冷；

3)、將電轉杯表面擦干，把加有質粒的農桿菌全部加入電轉杯中后放入電轉儀，電激轉化；

4)、電轉杯加入1ml無抗生素的LB培養(yǎng)液，反復吹吸，吸入2ml離心管中，28℃搖床200rpm或28℃恒溫培養(yǎng)箱恢復培養(yǎng)1.5小時后；

5)、取500μl菌液涂布于含有抗生素(Rif 50mg/ml和Kan 50mg/ml)的固體LB培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1-2天直至單克隆出現；

6)、選取陽性農桿菌單菌落進行搖菌，28℃搖床，250rpm，培養(yǎng)1-2天

4、農桿菌質粒提?。哼x用TRAN的質粒提取試劑盒提取質粒

1)、取2ml過夜培養(yǎng)的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細菌沉淀，不應留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，顏色由半透亮變?yōu)橥噶了{色，指示完全裂解(不宜超過5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000x g離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH＞7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000x g離心1分鐘，洗脫出的DNA于-20℃保存

5、酶切驗證：選用限制性內切酶5’：BamH I 3′：Kpn I對所提取的質粒進行驗證，雙酶切反應體系

28℃恒溫培養(yǎng)箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析結果，選擇條帶正確的農桿菌保存甘油菌(40％藍蓋)用于轉化植物。

實施例3、轉基因植物的獲取

本實施例采用花絮侵染法來獲取轉基因植株代號CML11

1、挑取已正確保菌的農桿菌進行活化(活化目的是確保菌的活力)，將活化好的菌加入到含有抗生素(Rif50mg/ml和Kan 50mg/ml)的5ml LB培養(yǎng)液中，28℃搖床過夜培養(yǎng)，將搖好的菌液放入到離心機內，5000x g，10min，棄去上清液，加入1ml的侵染液(5％蔗糖，0.02％silwet77懸浮液溶于水)，用膠頭滴管輕輕吹吸使菌懸浮。

2、選用三盒長勢良好且已開花的野生型Col-0植株，剪去植株上的已結豆莢和已完成授粉的花苞，用膠頭滴管吸取菌液滴在未開花的花苞上，并貼標簽標注，每隔2-3天侵染一次，直至所有植株都開花(注：每次侵染前一天給植物澆水)。

3、當植株成熟后及時收取T₁代種子，待種子干燥一周左右將其撒播在含有抗生素(草銨膦120mM)的抗性固體MQA CK培養(yǎng)皿上，先放置到4℃冰箱春化三天，再光照培養(yǎng)一周左右，進行陽性苗T₁代的篩選。

4、選取抗性培養(yǎng)皿上長勢良好的T₁代植株，移土培養(yǎng)并單株標號，待其成熟后及時單株收取T₂代種子，干燥一周后，繼續(xù)將其單管撒在抗性培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)數天后，選取符合活死比為3∶1的T₂代植株移土培養(yǎng)，種子成熟后及時單株收取T₃代種子，干燥一周后，將T₃代種子撒在含有草銨膦抗性的MQA CK培養(yǎng)基上，選取全活的純合植株進行表型分析。

實施例4、CML11在不同元素中的表型分析

本實例中用到的MQA培養(yǎng)基成分主要有

大量元素：1MKNO₃、1MMgSO₄、1MH₃PO₄、1MCaCl₂

微量元素：MS微量(0.5x)、

Fe²⁺鹽：MS Fe²⁺鹽(0.5x)

Mn²⁺鹽：MS Mn²⁺鹽(0.5x)以及0.5M MES緩沖液

碳源：1％蔗糖

a.具體的培養(yǎng)基方案如表1(100ml)

注：0μM PO₄^3-、0μM Ca²⁺、0μM NO₃^-、這幾個梯度加入1.0％的瓊脂糖1g；1mM Ca²⁺、1μM ABA、100mM NaCl、pH 7.0這幾個梯度加入1.2％的瓊脂1.2g；另ABA是在培養(yǎng)基滅完菌之后溫度降至手溫時再加0.5μl；KOH或BTP調pH為5.7(注：1mM Ca²⁺pH7.0的用KOH調到pH 7.0，1μM ABA是在高壓滅菌后，培養(yǎng)基溫度降到手可以碰觸的溫度時加入0.5μl)。

表1各種元素的培養(yǎng)基方案

b.種植方式如圖8所示

點播種子的過程是在無菌條件下進行的，點播種子之前先要用75％酒精對種子進行消毒(洗種子時間不宜超過30分鐘)，然后，再將種子在無菌條件下換用100％酒精沖洗一下，并將其連酒精一起晾干在無菌的濾紙上，待種子完全晾干后，用消過毒的鑷子將種子點播在培養(yǎng)基上。

每種梯度一個重復，待種完后用封口膜封口，先在4℃冰箱春化三天，再放置溫度為22℃，濕度為40％RH的培養(yǎng)室豎直光照培養(yǎng)十四天之后觀察CML11與野生型Col-0的表型，并對其進行根長和鮮重的數據采集和照片拍攝，可以看出CML11相對于野生型Col-0在0μM Ca²⁺有葉黃而小、根短的表型；在干旱激素1μM ABA表現為葉小、根短。同時，CML11相對于野生型Col在100mM NaCl、0μM NO₃^-、0μM PO₄^3-、pH 7.0這幾個濃度梯度上是沒有明顯區(qū)別的。具體情形如圖所示(附圖2、附圖3、附圖4、附圖5、附圖6、附圖7)。

c.培養(yǎng)皿的擺放

7個梯度為一組，分為四組。

以上實施例進一步說明了本發(fā)明的內容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范疇。