本發(fā)明涉及一種多重PCR檢測(cè)方法，尤其是一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

單核細(xì)胞增多性李斯桿菌病為人畜共患病，可引起皮膚感染、胃腸道紊亂，敗血癥。單核細(xì)胞增多性李斯桿菌主要是通過(guò)腸道感染，從腸道進(jìn)入后第一侵害的靶器官是肝。在肝中單核細(xì)胞增多性李斯桿菌能大量繁殖，直到機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)后才停止。單核細(xì)胞增多性李斯桿菌與結(jié)核菌、弓形蟲(chóng)蟲(chóng)體類(lèi)似可以降低動(dòng)物母體的細(xì)胞免疫的機(jī)能，從而使動(dòng)物孕期母體出現(xiàn)免疫缺陷而導(dǎo)致懷孕動(dòng)物或人出現(xiàn)早產(chǎn)流產(chǎn)現(xiàn)象、損害神經(jīng)系統(tǒng)(腦炎、腦膜炎)。感染單增性李氏桿菌動(dòng)物的死亡率高達(dá)7％以上。

金黃色葡萄球菌同樣為人畜共患病，不僅為患病動(dòng)物攜帶該菌，在健康動(dòng)物的體內(nèi)也可分離到具有致病毒素的菌株。金黃色葡萄球菌可導(dǎo)致動(dòng)物組織部位化膿，也能引起動(dòng)物產(chǎn)生肺炎等疾病。由于該細(xì)菌感染的動(dòng)物在產(chǎn)生敗血癥后還會(huì)繼發(fā)性的引起腦膜炎，尤其多見(jiàn)于合并左心內(nèi)膜炎的患者，通過(guò)細(xì)菌栓子經(jīng)血流侵襲腦膜。

腸球菌可引起人和動(dòng)物感染，且屎腸球菌的感染率呈逐年上升趨勢(shì)。腸球菌本身具有較強(qiáng)的耐藥性，不易治愈，此病原菌已受到獸醫(yī)臨床工作者的重視。且單核細(xì)胞增多性李斯桿菌，金黃色葡萄球菌與屎腸球菌均可引起動(dòng)物腦炎。

在內(nèi)蒙古中部地區(qū)一些羊場(chǎng)發(fā)生的以腦炎癥狀為主的感染病例中，分離得到腦源性金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯桿菌與屎腸球菌臨床分離株。臨床中單核細(xì)胞增多性李斯桿菌引起的動(dòng)物腦炎病例較為常見(jiàn)，但由金黃色葡萄球菌、屎腸球菌引起動(dòng)物腦炎病例較為少見(jiàn)。到目前為止，獸醫(yī)臨床對(duì)該病的診斷主要依靠病原的分離、鑒定，但是由于病原種類(lèi)較為復(fù)雜，特別是李斯桿菌屬的細(xì)菌種類(lèi)較多，鑒定存在步驟繁瑣、時(shí)間長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并且對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌的分菌、試驗(yàn)具有較高的風(fēng)險(xiǎn)性，因此，建立快速、特異的PCR診斷方法對(duì)于該病的早期確診和治療具有重要的臨床價(jià)值。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)這三種菌建立的多重PCR檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌Hyl基因與金黃色葡萄球菌NUC基因、屎腸球菌ddl基因序列設(shè)計(jì)其特異性引物，建立鑒別檢測(cè)的多重PCR方法，為開(kāi)展由金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、屎腸球菌單一或混合感染性腦炎的快速鑒別診斷提供新的方法。

本發(fā)明根據(jù)三種菌株的特異性基因設(shè)計(jì)引物，能夠在多重或單一感染的病料中同時(shí)檢測(cè)到這三種或鑒別其中單一病原，從而為本地區(qū)提供了一種可以快速診斷由此三種病原菌多重或單一感染的多重PCR檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在上述問(wèn)題，提供一種耗時(shí)短、效率高、靈敏度高，可直接應(yīng)用于同時(shí)檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明根據(jù)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，分別設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物，在確定引物最佳濃度等反應(yīng)體系的條件下，進(jìn)一步確定了多重PCR擴(kuò)增程序，由此建立了能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌鑒定、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌同時(shí)檢測(cè)或單一鑒別的多重PCR方法。

本發(fā)明提供用于同時(shí)檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR引物，引物針擴(kuò)增的基因分別為單增性李斯桿菌Hyl基因、屎腸球菌ddl基因、金黃色葡萄球菌NUC基因，其特征如下：

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種可同時(shí)檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行：

a.制備被檢測(cè)物的DNA模板并置于反應(yīng)管中；

b.將單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌引物放入a步驟的反應(yīng)管中進(jìn)行多重PCR反應(yīng)；

所述單核細(xì)胞增多性李斯桿菌的引物序列為：

hylA-1:5’-CATATATCTCAAGTGTGGCA-3’

hylA-2:5’-GCAATGGGAACTCCTGGTGT-3’

所述金黃色葡萄球菌的引物序列為：

NUC-1:5’-GCATCACAAACAGATAACGGCG-3’

NUC-2:5’-TAACCGTATCACCATCAATCGC-3’

所述屎腸球菌的引物序列為：

ddl-1：5’-GGACCCAAGTGGACAGACAG-3’

ddl-2：5’-CTTCACCAGGCAAAGTCGTC-3’

所述多重PCR反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5min；

引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2濃度均為10μmol/μL；各引物的體積均為0.5μL、模板體積為1μL、去離子水為6μL、Premix Taq體積為10μL，總體積為20μL。

本發(fā)明與現(xiàn)有普通PCR檢測(cè)單核細(xì)胞增多性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌相比，方法簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、成本低廉，引物檢測(cè)靈敏度高，從而為本地區(qū)提供了一種可以快速診斷由此三種病原菌多重或單一感染的新診斷方法，對(duì)由這三種菌引起的疾病的監(jiān)測(cè)與預(yù)防提供了有效的工具，可有效減少經(jīng)濟(jì)損失。

附圖說(shuō)明

圖1：特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的多重PCR擴(kuò)增圖，其中各泳道如下，M:Marker；1:無(wú)模板陰性對(duì)照；2：大腸桿菌DNA；3：鏈球菌DNA；4：金黃色葡萄球菌DNA；5：無(wú)模板陰性對(duì)照；6：?jiǎn)卧隼钍蠗U菌DNA；7：綿羊李斯桿菌DNA；8：巴氏桿菌DNA；9：無(wú)模板陰性對(duì)照；10：屎腸球菌DNA；11：糞腸球菌DNA；12：芒地場(chǎng)球菌DNA；13：?jiǎn)卧隼钏箺U菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌混合DNA。

圖2：敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的PCR擴(kuò)增圖，其中各泳道如下，M:Marker；1:無(wú)模板陰性對(duì)照；2-8:金黃色葡萄球菌DNA濃度分別為116ng-116×10^-4ng；單增李斯桿菌DNA濃度分別為121ng-121×10^-5ng；屎腸球菌濃度分別為107ng-107×10^-5ng。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.多重PCR方法

1、試驗(yàn)菌株

臨床分離菌株：?jiǎn)魏思?xì)胞增多性李氏桿菌、綿羊李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、糞場(chǎng)球菌、芒地腸球菌、鏈球菌、巴氏桿菌、大腸桿菌，試驗(yàn)所用菌株均由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

2、主要儀器及試劑

Bio photometer微量核酸檢測(cè)儀購(gòu)自Effendorf公司。DL 600 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。PremixTaq購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

3、引物設(shè)計(jì)

根據(jù)金黃色葡萄球菌耐熱性透明質(zhì)酸酶NUC，設(shè)計(jì)其屬特異性引物NUC-1、NUC-2；根據(jù)單增性李氏桿菌透明質(zhì)酸酶HylA基因，設(shè)計(jì)其種特異性引物HylA-1、HylA-2。根據(jù)屎腸球菌ddl基因，設(shè)計(jì)特異性引物ddl-1與ddl-2。引物序列及預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)下表：

4、多重PCR擴(kuò)增參數(shù)

引物NUC-1、NUC-2、HylA-1、HylA-2、ddl-1、ddl-2濃度均為10μmol/μL，PCR反應(yīng)條件為：94℃5min，94℃30s，59℃45s，72℃1min，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5min，配置體系各試劑體積見(jiàn)下表。

5、多重PCR特異性試驗(yàn)

為驗(yàn)證多重PCR反應(yīng)的屬特異性和種特異性，選取金黃色葡萄球菌屬外革蘭氏陽(yáng)性球菌：鏈球菌和桿菌菌屬細(xì)菌巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、大腸桿菌分離株；屎腸球菌屬內(nèi)球菌：糞場(chǎng)球菌、芒地腸球菌臨床分離株，以菌株的基因組DNA為模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出，利用多重PCR方法對(duì)獸醫(yī)臨床中常見(jiàn)的病原菌，包括獸疫鏈球菌、巴氏桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、單增性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌進(jìn)行檢測(cè)，只可以檢測(cè)出金黃色葡萄球菌、單增性李斯桿菌、屎腸球菌，對(duì)獸疫鏈球菌、巴氏桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌均無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)。該多重PCR方法可特異性的擴(kuò)增出金黃色葡萄球菌、單增性李氏桿菌與屎腸球菌，且將上述三種模板混合后，可檢測(cè)出三條條帶，并與單個(gè)引物擴(kuò)增條帶大小相同。

6、多重PCR的敏感性試驗(yàn)

利用核酸微量檢測(cè)儀測(cè)得提取的金黃色葡萄球菌和單增李氏桿菌臨床分離株的DNA含量與A₂₆₀/A₂₈₀的比值。用去離子水分別對(duì)2種菌的DNA模板進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋(稀釋倍數(shù)為10)，分別以稀釋的不同濃度DNA作為模板，進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

由敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出多重PCR反應(yīng)中單增李斯桿菌，金黃色葡萄球菌和屎腸球菌DNA片段，其最低檢測(cè)量分別為1.07pg、11.6pg和1.21pg。由此可知，該方法適用于獸醫(yī)臨床對(duì)單增性李斯桿菌、金黃色葡萄球菌與屎腸球菌感染的診斷，具有特異性強(qiáng)，敏感性高的特點(diǎn)。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，凡熟悉本專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。