本發(fā)明涉及一株異常威克漢姆酵母菌及其在滇橄欖果酒發(fā)酵中的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國(guó)是世界上最大的水果生產(chǎn)國(guó)，但水果深加工業(yè)卻一直很薄弱。果酒是以水果為原料經(jīng)過(guò)發(fā)酵而成的低度飲料酒，富含糖、有機(jī)酸、酯類及多種維生素。果汁中的主要成分是糖類，酵母菌則是以糖類物質(zhì)作為基質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，生成酒精和一定量的香味物質(zhì)。所以酵母品種是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風(fēng)味，決定果酒品質(zhì)的優(yōu)劣。

滇橄欖 (Phyllanthus emblical L)是大戟科葉下珠屬(Phyllanthus)落葉喬木的果實(shí)，又名余甘子、庵摩樂(lè)果、油甘子、圓橄欖，是一種獨(dú)特的生長(zhǎng)于中國(guó)亞熱帶、熱帶的部分地區(qū)，特別是干熱河谷地區(qū)落葉喬木或灌木的資源植物，在國(guó)內(nèi)其分布及數(shù)量在云南、福建、四川等地為多，在云南廣布于海拔900～l400m的元江、怒江、瀾滄江、南盤(pán)江、金沙江等流域，屬少見(jiàn)的喬木類型，系全屬750種植物中唯一具有核果、染色體為四培體的植物。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為滇橄欖味甘、酸、澀，性涼，具有清熱生津、清咽利嗓、止咳化痰、保肝解毒、健胃消食等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)其具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、消炎等作用。

滇橄欖先后已經(jīng)開(kāi)發(fā)出治療性藥品及系列飲料和果脯。但滇橄欖果酒作為一種保健酒的開(kāi)發(fā)尚屬起步階段，因滇橄欖含有大量的單寧、鞣酸，苦澀味很重，現(xiàn)有的產(chǎn)品消費(fèi)者很難接受。徐國(guó)雄等人研究的滇橄欖酒生產(chǎn)工藝中，通過(guò)加入0.4%的NaOH和0.1～0.2克每升的亞硫酸鈉進(jìn)行脫澀處理，發(fā)酵后除澀效果不是很明顯。

張煜行等人研究出了一種異常威克漢姆酵母HJY-006在白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，該菌株既能有一定的酒精產(chǎn)量，又能很好地滿足白酒對(duì)酯香的要求。王松等人研究出了一種能分解果膠的異常威克漢姆酵母，可使釀造的果酒更清澈有光澤，感官品質(zhì)得到提升。但關(guān)于異常威克漢姆酵母在增香除澀方面鮮有報(bào)道。本發(fā)明以滇橄欖為原料，以發(fā)酵后果酒中單寧含量和口感品質(zhì)作為指標(biāo)，篩選出了一株異常威克漢姆酵母菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明從采集至云南保山的一種滇橄欖果實(shí)表面上，采用微生物分離純化的方法，獲得了一株異常威克漢姆酵母菌（Wickerhamomyces anomalus）G1，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2016年9月20日，保藏編號(hào)為CGMCC No.13050，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

本菌株分離所用的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為：酵母粉10.0g、蛋白胨 20.0g、葡糖糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL。

本發(fā)明中所述的異常威克漢姆酵母菌Wickerhamomyces anomalus G1具有以下微生物學(xué)特征：

1、形態(tài)學(xué)特征：細(xì)胞個(gè)體呈圓形，生長(zhǎng)方式為出芽生殖；菌落呈乳白色，球形凸起，表面濕潤(rùn)、有光澤，不透明，奶油狀；

2、生理生化特征：本發(fā)明中Wickerhamomyces anomalus G1與相似度最高菌株異常威克漢姆酵母 SX1的生理生化特征比較結(jié)果見(jiàn)表1，使用杭州微生物試劑有限公司的酵母樣真菌生化鑒定管所得出；通過(guò)挑取單菌落穿刺至培養(yǎng)基中部，在28℃培養(yǎng)24h左右，通過(guò)培養(yǎng)基顏色的變化判斷是陰性還是陽(yáng)性，注：“+”表示陽(yáng)性；“-”表示陰性。結(jié)果表明Wickerhamomyces anomalus G1在碳源上能利用甘油、淀粉和檸檬酸，而異常威克漢姆酵母 SX1不能利用。

表1 Wickerhamomyces anomalus G1與異常威克漢姆酵母 SX1的生理生化特征比較

；

3、菌株的18SrDNA的鑒定：

提取菌株的總DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物擴(kuò)增目的片段，對(duì)片段進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序。對(duì)酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST進(jìn)行18SrDNA的相似性比對(duì)，結(jié)果顯示與Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，達(dá)到99%，鑒定它是異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus） ，命名為Wickerhamomyces anomalus .G1。

本發(fā)明應(yīng)用異常威克漢姆酵母G1和市售葡萄酒高活性干酵母RV171用于滇橄欖果酒釀造，分別對(duì)釀造后果酒的品質(zhì)指標(biāo)及單寧殘留含量測(cè)定，綜合分析得出異常威克漢姆酵母G1對(duì)滇橄欖果酒具有增香除澀等功效。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及應(yīng)用前景：

將本發(fā)明異常威克漢姆酵母G1與市售葡萄酒高活性干酵母RV171在酵母產(chǎn)酒精能力、降解單寧能力及感官評(píng)定進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明酵母菌的發(fā)酵能力強(qiáng)、發(fā)酵所得滇橄欖果酒品質(zhì)優(yōu)，回甘明顯，能增香除澀，具有典型的滇橄欖果香和風(fēng)味；利用異常威克漢姆酵母G1釀造的滇橄欖果酒，品質(zhì)良好，具有良好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1 異常威克漢姆酵母G1發(fā)酵滇橄欖酒的氣質(zhì)圖譜；

圖2市售葡萄酒高活性干酵母RV171發(fā)酵滇橄欖酒的氣質(zhì)圖譜。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均為常規(guī)方法，使用的試劑如無(wú)特殊說(shuō)明為常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法制得的試劑。

實(shí)施例1：異常威克漢姆酵母菌株G1的分離篩選

1、樣品為從云南保山采集得到的成熟滇橄欖果實(shí)，取10顆帶有果香味的滇橄欖裝入錐型瓶中，用200mL無(wú)菌水震蕩清洗果實(shí)表面，從中取10mL濁水在2000r/min下離心5min，吸取0.1mL上清液涂布均勻于裝有固體YPD培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，28℃下恒溫培養(yǎng)2d；

2、從中挑取直徑約為2mm的乳白色凸起單菌落，在無(wú)菌操作臺(tái)上，挑取選定的20個(gè)單菌落劃線接種于YPD固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)2d。待長(zhǎng)出后從中挑取6個(gè)乳白色，球形凸起，表面濕潤(rùn)、有光澤，不透明，奶油狀菌落接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，28℃下?lián)u床培養(yǎng)24h。

3、分別吸取10ml菌液加入到250ml滇橄欖汁中，并加入50g紅糖，在22℃室溫下厭氧發(fā)酵8d。通過(guò)測(cè)量這6株菌發(fā)酵滇橄欖酒的品質(zhì)指標(biāo)及感官分析，篩選出增香除澀最明顯的那株菌。

4、提取該菌株的總DNA，用酵母菌18SrDNA通用引物擴(kuò)增目的片段，對(duì)片段進(jìn)行回收、克隆、測(cè)序，序列如SEQ ID NO：1所示，對(duì)酵母菌18SrDNA基因片段序列使用NCBI的BLAST進(jìn)行18SrDNA的相似性比對(duì)， 結(jié)果顯示與Wickerhamomyces anomalus SX1的相似度最高，達(dá)到99%，鑒定它是異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），命名為Wickerhamomyces anomalus.G1。

本菌株分離所用的培養(yǎng)基為YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分為：酵母粉10.0g、蛋白胨 20.0g、葡糖糖20.0g、瓊脂20.0g、蒸餾水1000mL。

實(shí)施例2：異常威克漢姆酵母菌株G1用于滇橄欖果酒釀造，其步驟為：

1、原料處理：選用云南保山成熟的滇橄欖果實(shí)為原料，清洗→晾干→粉碎打成汁→過(guò)濾→得到滇橄欖汁。

2、主發(fā)酵：在已滅菌的6瓶500mL容量瓶中各添加滇橄欖汁250mL，分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組3瓶。將異常威克漢姆酵母G1與市售葡萄酒高活性干酵母RV171擴(kuò)培后分別按6%（2×10⁸cfu/mL）體積比添加到不同組中，同時(shí)加入50g紅糖，將這兩組發(fā)酵瓶放置在22～25℃室溫下密封發(fā)酵8d（前3d進(jìn)行有氧發(fā)酵，后5d進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵），即得滇橄欖果酒發(fā)酵原液。

3、澄清保藏：分別按10:1的比例加入1%（g/mL）濃度的明膠溶液，即在250mL的滇橄欖果酒發(fā)酵原液中加入25mL的1%明膠溶液，攪拌30min后靜置2h，過(guò)濾取上清液；將澄清的上清液放置在65℃水浴鍋中消毒15min，待冷卻后裝瓶密封保存在干燥陰涼處。

實(shí)施例3：異常威克漢姆酵母菌株G1發(fā)酵滇橄欖果酒品質(zhì)的指標(biāo)測(cè)定

指標(biāo)測(cè)定方法：糖度測(cè)定：糖度計(jì)；pH的測(cè)定：pH酸度計(jì)；酒精體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定：蒸餾法和酒精計(jì)。

指標(biāo)測(cè)定結(jié)果：用異常威克漢姆酵母G1所釀造的果酒，其pH為3.19，糖度為10.0%，酒精體積分?jǐn)?shù)為14.5%，三項(xiàng)指標(biāo)顯示該發(fā)酵液已達(dá)到GB 15038-2006果酒國(guó)標(biāo)要求。與干酵母RV171相比，菌株G1產(chǎn)酒精能力更強(qiáng)，降酸更明顯。

表2 滇橄欖果酒品質(zhì)的指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

。

實(shí)施例4：異常威克漢姆酵母菌株G1發(fā)酵滇橄欖果酒的感官評(píng)定

將兩組滇橄欖果酒發(fā)酵原液請(qǐng)10位評(píng)委品嘗，參照GB 15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法中的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)打分（表3），得出異常威克漢姆酵母菌株G1發(fā)酵的滇橄欖果酒口感要優(yōu)于市售葡萄酒高活性干酵母RV171。用異常威克漢姆酵母G1所釀造的果酒顏色為棕黃色，酒體具有純正和諧的滇橄欖果香，口味清爽細(xì)膩，酒體豐滿，回甘明顯，具有滇橄欖獨(dú)特的典型性，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 滇橄欖果酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

；

表4 ：兩組菌株發(fā)酵滇橄欖果酒后的感官評(píng)分

。

實(shí)施例5：異常威克漢姆酵母菌株G1單寧降解能力的測(cè)定：

取這兩組發(fā)酵原液各10mL在2000r/min下離心10min，取上清液保存?zhèn)溆?；同理取等體積的新鮮滇橄欖汁作為空白組；參照單寧含量試劑盒說(shuō)明書(shū)用分光光度計(jì)分別測(cè)量這三組的單寧含量；分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至760nm，蒸餾水調(diào)零；

結(jié)果表5得出本發(fā)明異常威克漢姆酵母菌G1發(fā)酵的滇橄欖酒中單寧含量為37.89μg/mL，比市售葡萄酒高活性干酵母RV171發(fā)酵的滇橄欖酒和新鮮滇橄欖汁中的單寧含量都要低，說(shuō)明酵母菌G1降解單寧的效果好。

表5 兩組菌株發(fā)酵滇橄欖果酒后的單寧含量

。

實(shí)施例6：滇橄欖果酒中香味成分的GC-MS分析

取這兩組滇橄欖酒發(fā)酵原液各10mL，在2000r/min下離心10min，取上清液分別裝入到兩個(gè)50mL容量的分液漏斗中，再分別加入10mL石油醚，上下?lián)u勻后靜置萃取，將萃取出的上清液裝入到50mL規(guī)格的旋蒸瓶中，在35℃下抽真空慢慢旋蒸，直至旋蒸瓶中剩余1mL溶液，取出并用0.45μm濾膜過(guò)濾保存?zhèn)溆?；將濾液在GC-MS (Agilent GC7890B/MS5977A)氣-質(zhì)聯(lián)用儀上分析。

GC條件：色譜柱為HP-5（30m*0.32mm*0.25um），進(jìn)樣口溫度250℃，分流比40:1，進(jìn)樣量1μl，起始柱溫40℃，保持1min，以5℃/min升溫至130℃，保持5min，再以5℃/min升溫至220℃，保持5min，再以10℃/min升溫至280℃，保持1min。

MS條件：傳送線溫度：250℃，四級(jí)桿溫度：150℃，離子源電影70ev，全掃描模式，掃描范圍：50-550。

結(jié)果如表6、7，可知Wickerhamomyces anomalus G1發(fā)酵后的果酒中香味物質(zhì)成分更多，主要香味物質(zhì)苯乙醇、環(huán)辛四烯、鄰苯二甲酸二丁酯等成分含量更高；結(jié)果表明了異常威克漢姆酵母G1發(fā)酵的滇橄欖果酒擁有更豐富的果香和酒香圖（1、2）。

表6：異常威克漢姆酵母G1發(fā)酵滇橄欖酒的主要香氣成分分析結(jié)果

表7：市售葡萄酒高活性干酵母RV171發(fā)酵滇橄欖酒的主要香氣成分分析結(jié)果

。

序列表

<110> 昆明理工大學(xué)

<120> 一株異常威克漢姆酵母菌及其應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1040

<212> DNA

<213> Wickerhamomyces anomalus G1

<400> 1

tttcgaacca aagactttga tttctcgtaa ggtgccgagt gggtatataa aaaacaccac 60

ccgatcccta gtcggcatag tttatggtta agactacgac ggtatctgat catcttcgat 120

cccctaactt tcgttcttga ttaatgaaaa cgtccttggc aaatgctttc gcagtagtta 180

gtcttcaata aatccaagaa tttcacctct gacaattgaa tactgatgcc cccgaccgtc 240

cctattaatc attacgatgg tcctagaaac caacaaaata gaaccaaacg tcctattcta 300

ttattccatg ctaatatatt cgagcaaagg cctgctttga acactctaat tttttcaaag 360

taaaagtcct ggttcgcctg ccccgagaga caggttagcc agaaggaaag gctcggtcag 420

gaccagtaca cgcaaaaaag cggaccggct gaccaagccc aaagttcaac tacgagcttt 480

ttaactgcaa caactttaat atacgctatt ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc 540

agacttgccc tccaattgtt cctcgttaag gtatttacat tgtactcatt ccaattacaa 600

gacccaaatg ggccctgtat cgttatttat tgtcactacc tccctgaatt aggattgggt 660

aatttgcgcg cctgctgcct tccttggatg tggtagccgt ttctcaggct ccctctccgg 720

aatcgaaccc ttattccccg ttacccgttg aaaccatggt aggccactat cctaccatcg 780

aaagttgata gggcagaaat ttgaatgaac catcgccgac acgaagtcat gcgattcgaa 840

aagttattat gaatcatcaa agagctcaga agagcattga ttttttatct aataaataca 900

ccccttccaa acagtcgggg tttttagcat gtattagctc tagaattacc acggttatac 960

caagtagtaa aggtactatc aaataaacga taactgattt aatgagccat tcgcagtttc 1020

actgtataaa ttgctatact 1040