本發(fā)明涉及基因診斷遺傳性疾病領(lǐng)域，具體的說是一種白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

白內(nèi)障是由于先天性或后天性因素導(dǎo)致的晶狀體混濁，其中先天性白內(nèi)障在世界范圍內(nèi)的患病率為0.0l％~0.06％，我國約為0.05％。預(yù)防先天性白內(nèi)障引起的視力損害是世界衛(wèi)生組織（WHO）國際項目“2020年消滅可避免失明”的一個重要組成部分。

先天性白內(nèi)障表現(xiàn)明顯的臨床異質(zhì)性，按臨床表型可分全白內(nèi)障、膜性白內(nèi)障、核性白內(nèi)障、繞核性白內(nèi)障、前極白內(nèi)障、后極白內(nèi)障、縫狀白內(nèi)障、點狀白內(nèi)障、盤狀白內(nèi)障，珊瑚型等，其發(fā)病機制復(fù)雜，涉及遺傳、代謝性疾病、宮內(nèi)感染及自發(fā)性等因素，其中約有30％-50％與遺傳有關(guān)，統(tǒng)稱為遺傳性白內(nèi)障。遺傳性白內(nèi)障的遺傳方式包括常染色體顯性、常染色體隱性和性染色體連鎖遺傳等，其中以常染色體顯性遺傳為主。據(jù)統(tǒng)計我國家族性白內(nèi)障患者中，常染色體顯性遺傳的白內(nèi)障占家族性白內(nèi)障總數(shù)的73%。

晶狀體的發(fā)育是一個非常復(fù)雜的過程，涉及許多基因，這些基因任何一個發(fā)生突變后都可能導(dǎo)致晶狀體混濁，也就是我們所說的白內(nèi)障。通過研究遺傳性白內(nèi)障去認識在細胞層次發(fā)揮不同功能的基因(蛋白質(zhì))，是人類認識該類基因乃至其基因家族最為有效的途徑。所以從科學(xué)理論研究來說，遺傳性白內(nèi)障對于闡明人類基因功能是一個很好的遺傳性模式疾病。

為了尋找引起白內(nèi)障的致病基因，常采用的分子遺傳學(xué)研究方法包括功能克隆(如候選基因篩選和蛋白質(zhì)分析)、位置克隆、定位候選基因克隆(如基于家系的連鎖分析和等位基因共享分析)等。迄今為止，已明確30個基因與單純遺傳性白內(nèi)障相關(guān)，統(tǒng)稱為遺傳性白內(nèi)障致病基因，其大致可歸為四大類：晶體蛋白基因(CRYAA、CRYAB、CRYBAI/A3、CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3、CRYGB、CRYGC、CRYGD、CRYGS)、細胞骨架或膜蛋白基因(GJA3、GJA8、MIP、LIM2、BFSP1、BFSP2、EPHA2、TMEM114、CHMP4B、VIM)、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因(HSF4、PITX3)和其他相關(guān)基因(GCNT2、FOXE3、WFS1、UNC45B、TDRD7、FYCO1)等。

遺傳性先天性白內(nèi)障具有高度的遺傳異質(zhì)性和臨床異質(zhì)性，即不同的基因突變可導(dǎo)致相同表型的白內(nèi)障，不同表型的白內(nèi)障可由相同的基因突變造成。由于遺傳性白內(nèi)障致病基因眾多，且基因型與表型之間不存在一定的相關(guān)性，使其臨床基因檢測頗具挑戰(zhàn)性。

隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，特別是外顯子組測序及全基因組測序等，為遺傳性疾病致病基因突變的篩查和發(fā)現(xiàn)提供了快捷的手段，但費用相對昂貴。因此，該類技術(shù)常常應(yīng)用于排除已知致病基因之后，以降低實驗的成本風(fēng)險，否則性價比太高。目標序列捕獲測序技術(shù)可實現(xiàn)高通量眾多已知致病基因突變篩查，具有快捷、高效等優(yōu)勢，但費用較高。從科學(xué)嚴謹性來說，以上新技術(shù)篩查到可疑致病基因突變最后仍需金標DNA測序Sanger法進一步驗證。因此，在精準醫(yī)學(xué)時代，建立快速、經(jīng)濟又高效的遺傳性白內(nèi)障致病基因檢測體系不僅有助于盡快排查白內(nèi)障家系的已知致病基因，發(fā)現(xiàn)新的突變位點，同時又可為發(fā)現(xiàn)新的致病基因提供可靠的家系材料及其后繼研究方法決策的制定。在臨床應(yīng)用上，可開發(fā)成相應(yīng)的白內(nèi)障基因診斷試劑盒，為有白內(nèi)障家族史者提供科學(xué)的遺傳咨詢與產(chǎn)前基因診斷。

目前，就我們所知，遺傳性白內(nèi)障致病基因的研究主要限于科研，尚未見臨床上有遺傳性白內(nèi)障致病基因檢測產(chǎn)品；而檢索到與白內(nèi)障致病基因篩查有關(guān)的專利則僅針對單個遺傳性白內(nèi)障致病基因突變檢測方法或試劑盒，未見有針對多個遺傳性白內(nèi)障致病基因突變檢測試劑盒的發(fā)明專利申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速、經(jīng)濟又高效的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒及其檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的理論依據(jù)是遺傳性白內(nèi)障存在高頻致病基因或突變熱點區(qū)域，具體獲得白內(nèi)障致病基因高頻突變譜的操作步驟如下：首先，檢索自1997年發(fā)現(xiàn)第一個人類遺傳性白內(nèi)障致病基因CRYBB2以來至2014年7月國內(nèi)外報道與遺傳性白內(nèi)障致病基因及其突變的相關(guān)文獻211篇，統(tǒng)計299個家系或先證者，涉及30個相關(guān)致病基因，分布于16條染色體(chr.1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 21, 22)，鑒定221個單一突變(Uni-mutation)，分布于72個外顯子，占基因總外顯子數(shù)的34.6%(72/205)；隨后，分析致病基因的發(fā)生頻譜，結(jié)果顯示90.97%的病例數(shù)與16個致病基因的突變有關(guān)，其發(fā)生頻譜由高到低依次為GJA8 和CRYGD (11.04%)，GJA3和 CRYAA(10.03%)，CRYBB2(7.69%)，CRYBA1(6.35%)，MIP(5.02%)， EPHA2, CRYGC, CRYAB和HSF4(4.01%), FYCO1(3.34%), CRYBB1(3.01%), BFSP2(2.68%)， GCNT2和PITX3 (2.34%)；其中FYCO1和GCNT2僅涉及常染色體隱性遺傳；最后，進一步分析致病基因各外顯子發(fā)生突變頻率，結(jié)果顯示57.19%的突變位于8個基因的11個外顯子上，65.22%的突變位于12個基因的15個外顯子上，70.23%的突變位于13個基因的18個外顯子上，80.27%的突變位于18個基因的26個外顯子上。統(tǒng)計分析結(jié)果直觀圖見附圖1，且本發(fā)明將此18個基因的26個外顯子定義為白內(nèi)障致病基因高頻突變外顯子。

本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒，該基因檢測試劑盒主要檢測上述定義的白內(nèi)障致病基因高頻突變外顯子的蛋白編碼區(qū)及其剪切位點連接區(qū)，即白內(nèi)障致病基因高頻突變區(qū)域，就可以檢出80%的遺傳性白內(nèi)障家系的致病基因突變。

本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒，該基因檢測試劑盒包括27對PCR引物，是根據(jù)上述白內(nèi)障致病基因高頻或熱點突變區(qū)域的DNA序列，采用Primer和Generunner等生物學(xué)軟件設(shè)計和人工合成；27對PCR引物的具體信息見表1。

表1. 本發(fā)明提供的26對引物信息及其PCR條件

本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒組成部件如下表2：

表2白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒組成

本發(fā)明提供的試劑盒用于白內(nèi)障致病基因檢測方法，該方法主要包括三部分內(nèi)容：

1）應(yīng)用本發(fā)明的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒進行PCR擴增目標基因的DNA片段；2）PCR產(chǎn)物的DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)變異位點；

3）鑒定目標基因變異位點是否為致病性突變位點。

所述試劑盒的白內(nèi)障致病基因檢測方法，具體操作步驟如下：

1）按下表3配制PCR反應(yīng)液（50μl），混勻置于PCR儀上；

表3 PCR反應(yīng)體系（100μl）組成

2）按下列條件進行PCR擴增反應(yīng)：

94℃/4min 預(yù)變性；94℃/30sec, 57℃-61℃(退火溫度依據(jù)不同PCR引物而異，具體參考附表1)/30sec,72℃/1min，30個循環(huán)； 72℃/4min；4℃保存。

3）PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定：取9ulPCR產(chǎn)物，加入1ul的10×上樣緩沖液，于1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外成像系統(tǒng)下檢測PCR產(chǎn)物的特異性及其大小是否與預(yù)期相符。

4）PCR產(chǎn)物的DNA測序分析，發(fā)現(xiàn)變異位點：PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、純化后采用ABI3730XL 自動DNA測序儀進行DNA測序，測序結(jié)果與正常DNA序列Blast比對分析，篩查變異位點。

5）鑒定致病性突變位點：如果變異位點為已知致病基因突變位點，即確定其為致病性突變；如果變異位點為新變異位點，則通過SNP排除、疾病表型與變異位點共分離、蛋白序列同源性比較、以及應(yīng)用一些生物學(xué)蛋白變異功能預(yù)測軟件分析，包括PolyPhen2 (Polymorphism Phenotyping v2)和SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)對編碼區(qū)新發(fā)的錯義突變進行功能預(yù)測，以及HSF (Human Splicing Finder) 對于內(nèi)含子上剪接點的改變進行預(yù)測。

除本發(fā)明提供的基因檢測試劑盒外，根據(jù)本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因高頻突變區(qū)域，應(yīng)用現(xiàn)有的生物學(xué)技術(shù)，如DNA芯片技術(shù)和目標序列捕獲二代測序技術(shù)，可簡單開發(fā)相關(guān)的白內(nèi)障致病基因檢測試劑和方法。因此本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因高頻突變區(qū)域亦適合上述技術(shù)，但不限于上述技術(shù)。

本發(fā)明還提供了16個白內(nèi)障致病基因新突變位點，見表5和附圖2。 根據(jù)本發(fā)明提供的新突變位點，應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，如基于PCR擴增技術(shù)的DNA測序、限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP) 分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測（SSCP）、等位基因特異PCR、實時定量PCR以及高分辨率熔解曲線 (HRM) 分析等，可簡易針對本發(fā)明提供的新突變位點信息開發(fā)相應(yīng)的快捷檢測試劑和方法。因此本發(fā)明提供的16個白內(nèi)障致病基因高新突變亦適合上述技術(shù)，但不限于上述技術(shù)。

為說明本發(fā)明所具有的優(yōu)點和有益效果，先列舉一些相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)情況：Hansen L等對28個丹麥白內(nèi)障家系采用PCR擴增17個白內(nèi)障致病基因的所有外顯子，DNA測序結(jié)果顯示其檢出率為71% (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009，50, 3291-3303)；Sun W等在25個中國人白內(nèi)障家系采用PCR擴增12個白內(nèi)障致病基因的所有外顯子，DNA測序結(jié)果顯示其檢出率為40% (Mol Vis. 2011，17, 2197-2206)；Ponnam SP等在40個印度白內(nèi)障家系采用SSCP（single strand conformation polymorphism）技術(shù)篩查10個白內(nèi)障致病基因的所有外顯子，其檢出率僅10%(Mol Vis. 19, 1141-1148 2013)；Sun W等采用外顯子組測序技術(shù)篩查18個中國人白內(nèi)障家系，其檢出率67.6%（PLoS One. 2014，9, e100455)；Ma AS等采用目標序列捕獲二代測序技術(shù)在46個先天性白內(nèi)障家系中篩查32個白內(nèi)障致病基因，其檢出率70%（Hum Mutat. 2016，37, 371-384)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所具有的優(yōu)點和有益效果是：

由于本發(fā)明基于白內(nèi)障致病基因突變熱點區(qū)域建立白內(nèi)障致病基因檢測體系，僅通過篩查18個白內(nèi)障致病基因的26個外顯子，就可檢測80%的遺傳性白內(nèi)障家系的致病基因突變。故本發(fā)明在不降低檢出率的基礎(chǔ)上可明顯降低白內(nèi)障致病基因檢測的工作量和成本等，具有快速、經(jīng)濟和高效等優(yōu)勢。

在基礎(chǔ)研究方面，用本發(fā)明提供的白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒及其檢測方法可實現(xiàn)快速排查白內(nèi)障家系的已知致病基因，發(fā)現(xiàn)新的突變位點，擴充白內(nèi)障致病基因突變譜，又可為篩查新的白內(nèi)障致病基因提供可靠而寶貴的遺傳資源；在臨床應(yīng)用上，用本發(fā)明提供的試劑盒及其方法體系進行白內(nèi)障致病基因檢測，可為白內(nèi)障家族史提供科學(xué)的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

附圖說明

圖1 白內(nèi)障致病基因高頻突變區(qū)域的選擇：黑色點表示該研究選擇熱點突變區(qū)域，包括了18個基因上的26個外顯子，這些區(qū)域覆蓋了文獻報道的80.27%白內(nèi)障家系致病基因突變；點的大小與該外顯子突變的頻率有關(guān)，突變頻率越高，點的直徑越大。；可期望36.11%（26/72）的外顯子區(qū)域可以覆蓋約80%以上的突變。

圖2：白內(nèi)障致病基因新突變位點的DNA測序圖。

具體實施方式

實施例1：白內(nèi)障致病基因高頻突變譜

為了獲得白內(nèi)障致病基因高頻突變譜，即致病基因及其外顯子突變熱點區(qū)域，我們檢索PubMed收錄人類單純遺傳性白內(nèi)障致病基因及其突變的相關(guān)文獻210篇(自1997年發(fā)現(xiàn)第一個人類遺傳性白內(nèi)障致病基因CRYBB2以來至2014年7月)，共報道了299個家系或先證者，涉及30個相關(guān)致病基因，分布于16條染色體(chr.1, 2, 3, 4, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17, 19, 20, 21, 22)，鑒定了221個單一突變(Uni-mutation)，分布于72個外顯子，占基因總外顯子數(shù)的34.6%(72/208)。以家系或先證者為單位，統(tǒng)計30個白內(nèi)障致病基因上的所有突變；然后，按照外顯子突變進行匯總頻率統(tǒng)計，由高到底進行排序，繪制白內(nèi)障致病基因高頻突變譜，結(jié)果詳見附圖1；最后，本發(fā)明選擇分布于18個基因的26個外顯子作為突變熱點區(qū)域（詳見表1），進行后繼的白內(nèi)障致病基因檢測分析。

實施例2：白內(nèi)障致病基因檢測方法

根據(jù)實施例1選擇的白內(nèi)障致病基因突變熱點區(qū)域，采用Primer、Generunner等生物學(xué)軟件設(shè)計和合成相應(yīng)的PCR引物；以先證者gDNA為模板，PCR擴增相應(yīng)蛋白編碼區(qū)和剪切接合區(qū)的DNA片段，PCR引物和PCR條件見表1。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI 3730XL 全自動測序儀(Automated Sequencer PE Biosystems, Foster City, CA)進行DNA直接測序。

通過DNA序列比對，分析篩查致病基因變異位點。如果變異位點為已知突變位點，即確定其為致病性突變；如果變異位點為新的，則通過SNP排除、疾病表型與變異位點共分離、蛋白序列同源性比較、以及應(yīng)用一些生物學(xué)蛋白變異功能預(yù)測軟件分析，包括PolyPhen2 (Polymorphism Phenotyping v2)和SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant)對編碼區(qū)新發(fā)的錯義突變進行功能預(yù)測，以及HSF (Human Splicing Finder) 對于內(nèi)含子上剪接點的改變進行預(yù)測。

對于篩查到的新發(fā)突變，在突變基因的上下游分別選擇2-3個含高信息STR微衛(wèi)星標記，PCR擴增微衛(wèi)星位點DNA區(qū)域，擴增產(chǎn)物在ABI3730自動測序儀上用毛細管凝膠電泳進行分離，DNA片段大小用GeneMarker2.4.0軟件進行分析，用Cyrillic 2.1 軟件畫家系圖，并構(gòu)建單體型，進一步確證新致病基因突變位點。

實施例3：遺傳性白內(nèi)障家系或散發(fā)病例血樣標本收集及基因組DNA的分離、純化

為驗證是否存在白內(nèi)障致病基因高頻突變譜和發(fā)現(xiàn)新的致病基因突變，本發(fā)明收集了43個白內(nèi)障先證者（31個來自常染色體顯性遺傳家系，8個來自無家族史家系和4個散發(fā)病例）及其234個家系成員的血樣標本；另外，收集112份正常人血樣標本作為對照。按Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Beijing, China)試劑盒說明操作從全血樣中提取和純化基因組DNA（gDNA）。

實施例4：白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒的應(yīng)用

以實施例3的基因組DNA為對象，應(yīng)用實施例2建立的白內(nèi)障致病基因檢測方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)7個已知突變位點（表4）和16個新突變位點（表-5和附圖-2）。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：60.5% (26/43)的先證者/家系中檢出致病性的突變，低于文獻報道的檢出率80.27% (240/299，X2=7.99，p=0.005)。而對于常染色體顯性遺傳家系來說，檢出率為80%(24/30)，與基于文獻報道的檢出率83.57%(234/280)無統(tǒng)計學(xué)差異(X2=0.489, p=0.484)。對于無家族史家系和散發(fā)病例，檢出率僅為16.67% (2/12)。 故本發(fā)明提供的試劑盒及其檢測方法特別適合常染色體顯性遺傳白內(nèi)障家系致病基因的檢測。

表4.在10個先天性白內(nèi)障家系中鑒定7個已知致病基因突變位點

表5 在先天性白內(nèi)障家系中鑒定16個白內(nèi)障致病基因新突變位點

備注: D= damaging; PD = probably damaging; MPA = mostprobably affecting splicing

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種白內(nèi)障致病基因檢測試劑盒及其檢測方法

<130> 54

<160> 54

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttggaaagga gaggtacccc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cagaggccac agacaacatg a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttccggatcc tgcctctgta 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cctttcatct tgccctacgt a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccatcccagt accatccag 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cctgcttgag cttcttcca 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acggtggact gcttcatctc 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctatctgct ggtgggaagt g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaacacgaa aatgcccttg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tgcttgaaac catccagtga 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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cttcttcatg agctcacgcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgacggagca agaccagagt 20

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ctgaccccag tacagtacag t 21

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

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catttctctc tcgctgtcac tctctc 26

<210> 15

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<212> DNA

<213> 人工序列

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actctgggca aatgaacacc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

tcccctatcc ccactctatg 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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caggctcagg tccagagaag 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gggaagcaaa ggaagacaga 20

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

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gttgtcatgg catttggtct c 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cttgataatt tgggcctgcc 20

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cctgtcaact cattcctcaa ctc 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cacctggtgg agaaaaatca a 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

cctcaccaag ctggactgc 19

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

gccaggaaca cacagaaaat att 23

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

cgcagcaacc acagtaatct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

cccaccccat tcacttctta 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

ggacccaaga gtgagcatga 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

ccctcctcct ctttgctcat 20

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cccgggaagc caggttatca gaagt 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

tttgagactg ctggggtaac ctgac 25

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

agctctcttg ccctacaggt cccc 24

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ctaagtgctc agctgtgtgc gtctc 25

<210> 33

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

gccacctcat ctcgtttatt g 21

<210> 34

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 34

gggagcaagc cagtcaaaa 19

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 35

agctgggcat ccaggttt 18

<210> 36

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 36

cctgcaccca cagtacattc t 21

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 37

tgcataaaat ccccttaccg 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 38

cctccctgta acccacattg 20

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 39

tgggtgcact gggaagaga 19

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 40

gaagccagag gtcagcagag 20

<210> 41

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 41

ccagacaggg catcagt 17

<210> 42

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 42

tggtacagca gccaacac 18

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 43

gcacagagca ggaagggata 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 44

cgaggaagtc acatcccagt 20

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 45

ccttcagcat cctttgggtt ctct 24

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 46

gcagttctaa aagcttcatc agtc 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 47

gaaaccatca atagcgtcta aatg 24

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 48

tgaaaagcgg gtaggctaaa 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 49

gactgtccac ccagacaagg 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 50

tcagggagtc agggcaatag 20

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 51

tgaaggagca ctgttaggag atg 23

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 52

agagggatag ggcagagttg att 23

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 53

aacccctgac atcaccattc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 54

aaggactctc ccgtcctagc 20