本發(fā)明屬于有害藻類檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有害藻類塔瑪亞歷山大藻Alexandrium tamarense的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

塔瑪亞歷山大藻Alexandrium tamarense是一種廣布性的有毒赤潮甲藻，在大西洋、太平洋、北極、溫帶及熱帶都有出現(xiàn)，而以北半球的溫帶水域出現(xiàn)的頻率最高，大多數(shù)麻痹性中毒事件與之密切相關(guān)。塔瑪亞歷山大藻與其余一些藻種在形態(tài)學(xué)上相似，難以用顯微鏡區(qū)分，需要研究人員豐富的經(jīng)驗(yàn)，然而現(xiàn)階段，用于檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的方法主要通過(guò)顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征。因此，找到一種更快，更方便，更適合塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)方法迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速檢測(cè)有害藻類塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)對(duì)塔瑪亞歷山大藻進(jìn)行安全、特異、快速、靈敏、簡(jiǎn)單的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，包含有以下的引物：

F3引物AT-F3:5′-CGGGCGAAATTTAAGCATA-3′(SEQ ID NO:1)、

B3引物AT-B3:5′-GCACATGACAAACAGGAC-3′(SEQ ID NO:2)、

FIP引物AT-FIP:

5′-CAGCTCCATTTGTCAAGCTAAGCAGTGGTGGAAATTAAACCAACT-3′(SEQ ID NO:3)、

BIP引物AT-BIP:

5′-TGGCTCTGAATTGTATTGTGGGAATTCTCACCCTCATTGATGC-3′(SEQ ID NO:4)、

LF引物AT-LF:5′-GCGCAATTACTGAAGAGATCCC-3′(SEQ ID NO:5)

LB引物AT-LB:5′-GTATTACCAACAGAGGTGCAGG-3′(SEQ ID NO:6)；

作為優(yōu)選，F(xiàn)IP引物AT-FIP的序列如下:

5′-CAGCTCCATTTGTCAAGCTAAGCAGTGGTGGAAATTAAACCAACT-3′(SEQ ID NO:7)、

BIP引物AT-BIP的序列如下:

5′-TGGCTCTGAATTGTATTGTGGGAATTCTCACCCTCATTGATGC-3′(SEQ ID NO:8)。

作為實(shí)施例的優(yōu)選，AT-FIP的5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記，LF引物AT-LF的5′端進(jìn)行異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記；

本發(fā)明還提供一種檢測(cè)有害藻塔瑪亞歷山大藻的方法，包括如下的步驟

1)配制LAMP反應(yīng)體系：

各引物的終濃度為：內(nèi)引物AT-FIP和AT-BIP各1.6μmol/L，外引物AT-F3和AT-B3各0.2μmol/L，環(huán)引物AT-LF和AT-LB各0.8μmol/L；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO₄8mmol/L，(NH₄)₂SO₄ 10mmol/L，0.1％的Tween20，Betaine 0.8mol/L，dNTPs1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶和2μL樣品DNA模板，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25μL；

2)LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增：將上述反應(yīng)體系進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)所需溫度為61℃-65℃，擴(kuò)增反應(yīng)所需時(shí)間為30min-60min；

3)LFD檢測(cè)：取8μL核酸擴(kuò)增產(chǎn)物將產(chǎn)物加入到100μL Buffer中混勻，然后將LFD試紙條垂直浸入混合溶液中顯色檢測(cè)，通過(guò)試紙條判斷擴(kuò)增結(jié)果。

其中步驟2中所述的最適反應(yīng)溫度為63℃，最適反應(yīng)時(shí)間為45min。

本發(fā)明所提供的塔瑪亞歷山大藻的LAMP-LFD檢測(cè)方法具有如下優(yōu)點(diǎn)：

一、高靈敏度，對(duì)塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)最低線可至65pg/μL，其檢測(cè)靈敏度比傳統(tǒng)PCR的檢測(cè)靈敏度高10倍。

二、強(qiáng)特異性，所用的特異性引物根據(jù)塔瑪亞歷山大藻的ITS基因中的六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)，其中LF同時(shí)做為DNA特異性探針，該檢測(cè)特異性比常規(guī)PCR強(qiáng)很多。

三、檢測(cè)時(shí)間較短，50分鐘左右可獲得檢測(cè)結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)間節(jié)省2-4h。

四、儀器設(shè)備要求低，不需要PCR儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)，只需一個(gè)恒溫加熱器即可完成檢測(cè)。

五、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果呈現(xiàn)明顯，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不涉及復(fù)雜昂貴儀器和設(shè)備，稍具有分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成整個(gè)操作；檢測(cè)結(jié)果清晰明顯，直接通過(guò)肉眼觀察即可判別。

六、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境更安全，檢測(cè)過(guò)程不需要進(jìn)行凝膠電泳故不使用EB等有毒試劑。

綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有傳統(tǒng)技術(shù)PCR檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的方法更高的特異性、靈敏度、實(shí)用性及便捷性，可以在實(shí)際野外現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，有利于檢測(cè)和控制塔瑪亞歷山大藻的爆發(fā)，提前做好預(yù)防。運(yùn)用本發(fā)明的方法對(duì)有害藻類塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)，能有效的預(yù)防有害藻類塔瑪亞歷山大藻發(fā)生大規(guī)模赤潮，這對(duì)保護(hù)我國(guó)海洋及水產(chǎn)養(yǎng)殖具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1：塔瑪亞歷山大藻ITS基因的LAMP-LFD引物和探針設(shè)計(jì)示意圖，引物和探針由方框圈出、

圖2：PCR-AGE檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的靈敏度圖、

圖3：LAMP檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的靈敏度圖、

圖4：LAMP-LFD檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻靈敏度圖、

在圖2和圖4中，泳道M為DL2000DNA marker,NC為陰性對(duì)照，1泳道為10⁰(模板濃度65ng/μL),2-8泳道依次為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7倍稀釋的基因組DNA。

圖5：PCR-AGE檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的特異性圖、

圖6：LAMP檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的特異性圖、

圖7：LAMP-LFD檢測(cè)塔瑪亞歷山大藻的特異性圖；

在圖5和圖6中，泳道M為DL2000DNA marker,NC為陰性對(duì)照，1-8泳道依次為：塔瑪亞歷山大藻、塔瑪亞歷山大藻、東海原甲藻、海洋原甲藻、微小原甲藻、赤藻異灣藻、中肋骨條藻、米氏凱倫藻。

具體實(shí)施方式

LAMP-LFD技術(shù)是環(huán)介導(dǎo)橫溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification)與橫向流動(dòng)試紙條(Lateral flow dipstick)相結(jié)合的一種新穎的檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)將核酸橫溫?cái)U(kuò)增和可視化試紙條檢測(cè)有機(jī)的結(jié)合。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)，只需要在恒溫(60℃–65℃)條件下保溫幾十分鐘，即可將所需目的基因擴(kuò)增到10⁹水平。橫向流動(dòng)試紙條(LFD)，融合了免疫層析技術(shù)和分子生物學(xué)手段，能在紙條上形成有顏色的檢測(cè)線從而可以特異性地檢測(cè)出該目標(biāo)產(chǎn)物。環(huán)介導(dǎo)橫溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)與橫向流動(dòng)試紙條(LFD)相互結(jié)合的技術(shù)，使LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)可視化，檢測(cè)結(jié)果明顯直觀，通過(guò)肉眼即可辨認(rèn)，LAMP-LFD結(jié)合方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無(wú)設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)所無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案包括以下三個(gè)部分：1、提供3對(duì)用于塔瑪亞歷山大藻的LAMP引物序列，即長(zhǎng)度分別為20bp、18bp、32bp、42bp、22bp和21bp的寡核苷酸序列，依次命名為AT-F3、AT-B3、AT-FIP、AT-BIP、AT-LF和AT-LB；2、配制LAMP反應(yīng)體系，通過(guò)LAMP反應(yīng)程序?qū)悠纺０暹M(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件；3、將AT-LF設(shè)計(jì)為DNA探針，結(jié)合LFD技術(shù)對(duì)LAMP擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。

本發(fā)明所使用的8種藻：塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)以上微藻藻種均由寧波大學(xué)海洋生物實(shí)驗(yàn)室藻種室提供,培養(yǎng)海水(鹽度25‰)經(jīng)0.45μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾后煮沸冷卻,培養(yǎng)液采用浙江水產(chǎn)學(xué)院三號(hào)液配方(NMB 3#)。藻種在2500mL錐形瓶中于日光燈光照下培養(yǎng),光照強(qiáng)度45～55μmo l/(m2·s),光暗周期12∶12,培養(yǎng)溫度為(20±2)℃。

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。

實(shí)施例1:LAMP-LFD技術(shù)檢測(cè)有害塔瑪亞歷山大藻的方法建立

Takara MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver.50購(gòu)置寶生物工程(大連)有限公司脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒，榮研生物科技(中國(guó))有限公司，LFD檢測(cè)試紙條購(gòu)自Milenia Biotec GmbH公司(Milenia GenLine HybriDetect MGHD1，Germany)。

1、LAMP引物的設(shè)計(jì)

申請(qǐng)人對(duì)NCBI中公開(kāi)的塔瑪亞歷山大藻的IST基因進(jìn)行同源性分析后，并比較了與塔瑪亞歷山大藻近似種的IST基因的序列，從而設(shè)計(jì)和篩選出下面3對(duì)引物，引物序列如下所示：

AT-F3:5′-AAGCATGCCTTCTTCAGTGT-3′

AT-B3:5′-CTGGAGCAGGCTACGAGT-3′

AT-FIP:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTTTCATGCCCCTGACG-3′

AT-BIP:5′-TGGCCTTTGACGCATTCAGTGTACACAACGAAAGAGACACCG-3′

AT-LB:5′-TAGCGTCTCCAACGAGCAACT-3′

AT-LF:5′-GACAGCACCAAGAGAAGACTTG-3′

其中AT-FIP為5′端生物素標(biāo)記引物，AT-LF為5′端異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記探針；塔瑪亞歷山大藻的ITS基因LAMP擴(kuò)增引物序列位置如圖1所示。按照上述引物序列，在大連寶生物公司進(jìn)行LAMP引物合成。

2、LAMP擴(kuò)增條件優(yōu)化

以塔瑪亞歷山大藻的基因組DNA作為模板進(jìn)行擴(kuò)增條件優(yōu)化。LAMP法DNA擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒購(gòu)自博奧生物科技有限公司。首先配制具有最佳擴(kuò)增效率和檢測(cè)特異性的反應(yīng)體系，本發(fā)明中的LAMP反應(yīng)體系為：各引物濃度為：FIP-bio和BIP各1.6μmol/L，F(xiàn)3和B3各0.2μmol/L，LF-fitc和LB各0.8μmol/L；緩沖液組成及濃度為：Tris-HCl(pH 8.8)20mmol/L、KCl 10mmol/L，MgSO4 8mmol/L，(NH4)2SO4 10mmol/L，Tween20 0.1％，Betaine 0.8mol/L，dNTPs 1.4mmol/L；8U Bst DNA聚合酶；基因組DNA模板2μl。按照上述體系要求配制反應(yīng)混合物，混勻后分裝到無(wú)菌PCR管中，反應(yīng)總體積為25μl。LAMP-LFD反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1：LAMP-LFD反應(yīng)體系

在反應(yīng)過(guò)程中，擴(kuò)增溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于LAMP反應(yīng)。應(yīng)用本發(fā)明提供的引物和采用本發(fā)明確定的反應(yīng)體系，分別比較不同溫度(61℃、63℃、65℃)條件下對(duì)LAMP反應(yīng)的影響，通過(guò)實(shí)時(shí)濁度儀對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控最終確定最佳反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)所需溫度。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析最終選擇63℃，45min作為后續(xù)LAMP擴(kuò)增的最佳反應(yīng)條件。

3、LFD檢測(cè)

LAMP擴(kuò)增結(jié)束后，取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入到100μL Buffer溶液中混勻，將LFD試紙條垂直浸入混合液中，觀察試紙條檢測(cè)帶是否顯色。如果檢測(cè)帶顯色表示該樣品中塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，如果不顯色則表示該樣品塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)結(jié)果為陰性。

實(shí)施例2

用本發(fā)明的LAMP-LFD技術(shù)對(duì)有害藻類塔瑪亞歷山大藻靈敏度進(jìn)行測(cè)定

1、參照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取的塔瑪亞歷山大藻基因組DNA，將所提取的塔瑪亞歷山大藻的基因組DNA模板原始濃度(74ng/μL)按10倍梯度稀釋，分別做為反應(yīng)模板。

2、用LAMP、LAMP-LFD和PCR法對(duì)塔瑪亞歷山大藻進(jìn)行檢測(cè)比較靈敏度。

2.1將上述梯度稀釋的基因組DNA用作PCR反應(yīng)模板，利用上述特異引物F3和B3進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：20μmol/L F3和20μmol/L B3各1μL，Premix Taq酶(TaKaRa)25μL，塔瑪亞歷山大藻模板3μL，雙蒸水定容至50μL體系。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃5min；95℃40s，51℃40s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果(圖2)。

2.2將上述梯度稀釋的基因組DNA用作LAMP的模板進(jìn)行核酸擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.3按照本發(fā)明提供的LAMP的6條引物結(jié)合LFD技術(shù)將上述梯度稀釋后的基因組DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)的模板進(jìn)行擴(kuò)增，用本發(fā)明提供的LFD方法分析LAMP反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖4。

塔瑪亞歷山大藻基因組DNA模板10倍梯度稀釋實(shí)驗(yàn)證明，LAMP-LFD和LAMP檢測(cè)的最低稀釋濃度為10^-4，模板濃度為7.4pg/μL。PCR擴(kuò)增最低濃度為74pg/μL。LAMP-LFD檢測(cè)的靈敏度比和常規(guī)PCR方法高1個(gè)數(shù)量級(jí)，上述結(jié)果表明本發(fā)明的引物組能夠保證檢測(cè)時(shí)的靈敏性。

實(shí)施例3

用本發(fā)明的LAMP-LFD技術(shù)對(duì)有害藻類塔瑪亞歷山大藻特異性進(jìn)行測(cè)定

選取塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)、東海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)、海洋原甲藻(Prorocentrum micans)、微小原甲藻(Prorocentrum minimum)、赤潮異灣藻(Heterosigma akashiwo)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi)8種常見(jiàn)海洋有害藻類作為L(zhǎng)AMP-LFD特異性試驗(yàn)藻，其中雙蒸水為陰性對(duì)照。提取藻類的基因組DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物分別用LFD試紙條和1％瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5-7，說(shuō)明本發(fā)明提供的塔瑪亞歷山大藻的LAMP-LFD檢測(cè)方法能保證對(duì)有害藻類塔瑪亞歷山大藻的特異性檢測(cè)，不與其他相關(guān)藻類發(fā)生交叉反應(yīng)。

實(shí)施例4

為進(jìn)一步提高LAMP擴(kuò)增的靈敏度，依據(jù)先前設(shè)計(jì)的引物，針對(duì)AT-FIP和AT-BIP我們對(duì)其引物中的堿基進(jìn)行了改造，改造后的引物序列如下：

AT-FIP-1:

5′-TGACACACAAACACGCACCCATTGATTATCATGCCTCTGACG-3′

AT-BIP-1:5′-TGGCCTATGACGCATTCAGAGTACACTACGAATGAGACACCG-3′

利用改造后的引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增的特異性和靈敏度檢測(cè)。擴(kuò)增反應(yīng)體系除將實(shí)施例1中兩條引物AT-FIP和AT-BIP分別更換為AT-FIP-1和AT-BIP-1外其他均不變，擴(kuò)增和LFD檢測(cè)過(guò)程也保持一致。與為進(jìn)行引物改造前的LAMP-LFD相比，引物改造后的LAMP-LFD在特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中與改造前的結(jié)果一致。但在靈敏度檢測(cè)方面，與未改造的引物相比較，靈敏度又上升了1個(gè)數(shù)量級(jí)，比常規(guī)的PCR方法靈敏度提高了2個(gè)數(shù)量級(jí)。上述結(jié)果表明經(jīng)改造后的本發(fā)明的引物組能夠在保證特異性檢測(cè)不變的情況下，進(jìn)一步提高檢測(cè)時(shí)的靈敏性。

實(shí)施例5

LAMP-LFD對(duì)各海域中有害藻類的檢測(cè)應(yīng)用

用實(shí)施例1中的試劑盒法提取各樣品的DNA模板。并用已經(jīng)設(shè)計(jì)好的LAMP-LFD方法檢測(cè)海水樣品中是否存在有害赤潮藻塔瑪亞歷山大藻；同時(shí)用實(shí)施案例2中的PCR法進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品分別作3個(gè)平行，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2：LAMP-LFD與PCR法對(duì)各海域中有害藻類塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)結(jié)果

注：+.陽(yáng)性；—.陰性

上述結(jié)果表明本發(fā)明的引物組及檢測(cè)方法所獲得的結(jié)果與PCR的結(jié)果一致，證明了本發(fā)明的可靠性。

SEQUENCE LISTING

<110> 寧波大學(xué)

<120> 一種塔瑪亞歷山大藻的檢測(cè)方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

cgggcgaaat ttaagcata 19

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gcacatgaca aacaggac 18

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

cagctccatt tgtcaagcta agcagtggtg gaaattaaac caact 45

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

tggctctgaa ttgtattgtg ggaattctca ccctcattga tgc 43

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

gcgcaattac tgaagagatc cc 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

gtattaccaa cagaggtgca gg 22

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

cagctccatt tgtcaagcta agcagtggtg gaaattaaac caact 45

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

tggctctgaa ttgtattgtg ggaattctca ccctcattga tgc 43