本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的馴化方法。

背景技術(shù)：
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在能源短缺及環(huán)境污染的雙重壓力下，既能處理廢棄物又能產(chǎn)生可再生能源的沼氣產(chǎn)業(yè)得到了較快發(fā)展，從小規(guī)模的戶用沼氣走向了規(guī)模化生產(chǎn)。據(jù)統(tǒng)計，全國沼氣用戶約4300萬戶，全國規(guī)?；託夤こ碳s10萬處，然而，多數(shù)沼氣池由于無法長期穩(wěn)定運行而處于閑置狀態(tài)，大部分沼氣工程至今無法盈利。由揮發(fā)性有機酸累積導(dǎo)致的酸抑制問題是制約沼氣發(fā)酵穩(wěn)定性及經(jīng)濟性的因素之一。

酸抑制或酸敗現(xiàn)象在餐廚垃圾、農(nóng)林廢棄物、城市有機垃圾、能源作物等為原料的厭氧發(fā)酵過程中常發(fā)生。酸抑制是由于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)上游產(chǎn)酸過程與下游產(chǎn)甲烷過程失衡，中間產(chǎn)物揮發(fā)性脂肪酸累積(主要是丙酸，乙酸)，致使發(fā)酵系統(tǒng)pH降低，抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性，最終導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氣能力下降或者發(fā)生酸敗。氨抑制是由于含氮有機物分解成小分子的氨，其對產(chǎn)甲烷菌具有毒害作用，降低產(chǎn)甲烷菌的活性，最終導(dǎo)致發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氣能力下降。通常的解決方法是宏觀上優(yōu)化運行參數(shù)，如降低有機負荷和發(fā)酵濃度，使發(fā)酵在相對較低的發(fā)酵濃度下運行，這就限制了發(fā)酵效率。隨著生物強化技術(shù)在廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用，研究人員開始嘗試將其應(yīng)用到沼氣發(fā)酵系統(tǒng)中，即人為的添加特定功能的微生物來應(yīng)對酸抑制或氨抑制，提高發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高發(fā)酵濃度，或恢復(fù)酸敗系統(tǒng)產(chǎn)氣。

雖然，已有關(guān)于生物強化技術(shù)緩解酸抑制的報道，但是投加功能菌的多為購買的純培養(yǎng)的針對丙酸降解的互營丙酸氧化細菌，或針對乙酸產(chǎn)甲烷過程的產(chǎn)甲烷古菌，亦或是人為地將幾種微生物進行組合制成復(fù)合微生物菌劑。這些菌劑的制備技術(shù)存在以下問題：第一，厭氧的微生物培養(yǎng)條件苛刻，需要專門厭氧設(shè)備及微生物專業(yè)技術(shù)人員進行培養(yǎng)；第二，純培養(yǎng)的微生物丙酸氧化細菌或產(chǎn)甲烷菌作為外源投加的菌種很難適應(yīng)厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中的復(fù)雜環(huán)境條件，如低pH，高氨氮濃度等；第三，單一類型的微生物作為生物強化菌劑投加到厭氧發(fā)酵體系后很難抵抗土著微生物的競爭并長期地保持生物持有量以發(fā)揮強化作用。此外，鑒于氨抑制導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌活性減低，甚至失活，乙酸不能及時被轉(zhuǎn)化成甲烷并發(fā)生累積，而丙酸的降解又會受到乙酸的產(chǎn)物抑制，從而導(dǎo)致丙酸累積。因此，為應(yīng)對氨抑制和酸累積的雙重壓力，有必要提出一種有效地馴化耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的馴化方法，得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系主要包括丙酸氧化細菌群、互營丙酸氧化菌群、乙酸裂解產(chǎn)甲烷菌群、氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群及硝化與反硝化菌群等，具有耐沖擊性強，生物強化作用穩(wěn)定性高等優(yōu)點，用于提高沼氣發(fā)酵性能，解決了厭氧發(fā)酵過程中的氨抑制和酸抑制問題。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

一種耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的馴化方法，所述耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系包括丙酸氧化細菌群、互營丙酸氧化菌群、乙酸裂解產(chǎn)甲烷菌群、氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌群及硝化與反硝化菌群，該方法以沼氣發(fā)酵液為接種物，以丙酸為碳源，以尿素或NH₄Cl為氨氮來源，通過交替提高丙酸濃度及氨氮濃度的方法來馴化沼氣發(fā)酵液來獲得耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系，該方法包括以下步驟：在氮氣和二氧化碳體積比為4:1的混合氣氛中，按體積比為19:1-9：1將接種物接種到丙酸濃度為0.5g/L、氨氮濃度為0.5g/L的新鮮培養(yǎng)基中，放入試劑瓶中37℃進行培養(yǎng)，每24h置換新鮮的培養(yǎng)基，保持新鮮培養(yǎng)基中丙酸和氨氮濃度不變，20天為一個培養(yǎng)周期，初始周期后新鮮培養(yǎng)基中丙酸濃度或氨氮濃度保持不變，提高氨氮濃度或丙酸濃度，穩(wěn)定培養(yǎng)1-2周期后，再保持氨氮濃度或丙酸濃度不變，提高丙酸濃度或氨氮濃度，并穩(wěn)定培養(yǎng)1-2周期，如此交替提高丙酸濃度及氨氮濃度，直至氨氮濃度大于3.0g/L、丙酸濃度大于2.0g/L獲得高氨氮耐受能力的丙酸產(chǎn)甲烷菌系；所述試劑瓶配有帶兩個孔的橡膠塞，其中一個孔中插有橡膠管至試劑瓶中下部作為進出料的通道，另一個孔連接收集氣體的氣袋；所述新鮮培養(yǎng)基配制方法為：在1L水中加入400mg NH₄Cl、250mg MgSO₄·6H₂O、400mg KCl、120mg CaCl₂·2H₂O、80mg(NH₄)₂HPO₄、55mg FeCl₃·6H₂O、5000mg NaHCO₃，還加入CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、AlCl₃·6H₂O、ZnCl₂、Na₂WO₄·2H₂O、H₃BO₃、Na₂SeO₃、Ma₂MoO₄·2H₂O各0.0005mg；此外還加入碳源和氨氮，碳源和氨氮的質(zhì)量跟相應(yīng)的濃度對應(yīng)。

所述交替提高丙酸濃度及氨氮濃度，丙酸濃度的提高幅度為30-50％，氨氮濃度的提高幅度為0.3-0.5g/L。

本發(fā)明還保護上述馴化后得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的應(yīng)用，馴化后得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系可長期穩(wěn)定地在氨氮濃度大于3.0g/L、丙酸濃度大于2.0g/L條件下穩(wěn)定產(chǎn)氣，其產(chǎn)氣率大于理論產(chǎn)量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

本發(fā)明還提供一種耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷系固體菌劑的制備方法，將上述馴化后得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷系的菌液經(jīng)離心，棄去液體部分后置于厭氧環(huán)境下室溫風(fēng)干，收集固體粉末并真空密封保存得到目標產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供一種液體濃縮耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌劑的制備方法，將上述馴化后的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷系菌液經(jīng)離心，收集全部的固體沉淀及少許上清液，利用滅菌的液體甘油封液面以隔絕空氣，-20℃低溫保存。

本發(fā)明的有益效果如下：

(1)本發(fā)明得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系具有耐沖擊性強，生物強化作用穩(wěn)定性高等優(yōu)點，用于解除沼氣發(fā)酵過程中的氨氮及丙酸的綜合抑制，提高沼氣發(fā)酵性能，長期穩(wěn)定地在氨氮濃度大于3.0g/L、丙酸濃度大于2.0g/L條件下穩(wěn)定產(chǎn)氣，其產(chǎn)氣率大于理論產(chǎn)量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

(2)本發(fā)明得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系固體菌劑和液體濃縮耐酸產(chǎn)甲烷菌劑便于運送和長期保存。

具體實施方式：

以下是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

本實施例接種物沼氣發(fā)酵液為餐廚垃圾發(fā)酵液，有機負荷1.0g/L d，日容積產(chǎn)氣率為0.3L/L d。(也可選取其他任意穩(wěn)定運行發(fā)酵罐的發(fā)酵液)。

培養(yǎng)裝置為1L的試劑瓶，所述試劑瓶配有帶兩個孔的橡膠塞，其中一個孔中插有橡膠管至試劑瓶中下部作為進出料的通道，另一個孔連接收集氣體的氣袋。

本實施例耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系的馴化方法，包括以下步驟：在氮氣和二氧化碳體積比為4:1的混合氣氛中，以保證厭氧環(huán)境，將接種物950ml接種到丙酸濃度為0.5g/L氨氮濃度為0.5g/L的50ml新鮮培養(yǎng)基中，放入1L的試劑瓶中37℃的水浴鍋中進行靜置培養(yǎng)，每24h用注射器吸出50ml的菌液，并注入50ml新鮮的培養(yǎng)基，保持新鮮培養(yǎng)基中丙酸和氨氮濃度不變，20天為一個培養(yǎng)周期，初始周期后第二個周期新鮮培養(yǎng)基丙酸濃度保持不變，提高氨氮濃度到1.0g/L，每24h用注射器吸出50ml的菌液，并注入50ml新鮮的培養(yǎng)基，保持新鮮培養(yǎng)基中丙酸濃度為0.5g/L、氨氮濃度1.0g/L不變，20天為一個培養(yǎng)周期，穩(wěn)定培養(yǎng)1周期后，再保持氨氮濃度1.0g/L不變，提高丙酸濃度到0.75g/L，并穩(wěn)定培養(yǎng)1周期，如此交替提高丙酸濃度及氨氮濃度，直至氨氮濃度大于3.0g/L、丙酸濃度大于2.0g/L(參見表1)獲得高氨氮耐受能力的丙酸產(chǎn)甲烷菌系；所述新鮮培養(yǎng)基，每升是這樣配制的：在1L水中加入0.5mg丙酸鈉、400mg NH₄Cl、250mg MgSO₄·6H₂O、400mg KCl、120mg CaCl₂·2H₂O、80mg(NH₄)₂HPO₄、55mg FeCl₃·6H₂O、5000mg NaHCO₃、還加入CoCl₂·6H₂O、NiCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuCl₂·2H₂O、AlCl₃·6H₂O、ZnCl₂、Na₂WO₄·2H₂O、H₃BO₃、Na₂SeO₃、Ma₂MoO₄·2H₂O各0.0005mg，此外還加入碳源和氨氮，碳源和氨氮的質(zhì)量跟相應(yīng)的濃度對應(yīng)。上述馴化后的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系能長期穩(wěn)定地在氨氮濃度大于3.0g/L、丙酸濃度大于2.0g/L條件下穩(wěn)定產(chǎn)氣，其產(chǎn)氣率大于理論產(chǎn)量的60％，丙酸及乙酸的利用率均大于90％。

表1

將上述馴化后的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系菌液以5000-8000rpm的轉(zhuǎn)速離心5-10min，棄去液體部分后置于厭氧環(huán)境(厭氧操作箱，厭氧氣袋)下室溫風(fēng)干，收集固體粉末并真空密封保存得到耐酸產(chǎn)甲烷菌系固體菌劑。

將上述馴化后的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系菌液以5000-8000rpm的轉(zhuǎn)速離心5-10min，收集全部的固體沉淀及少許上清液，利用滅菌的液體甘油封液面以隔絕空氣，-20℃低溫保存。

實施例2：本發(fā)明獲得的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌劑對餐廚垃圾的厭氧發(fā)酵生物強化作用

發(fā)酵原料：人工配置的餐廚垃圾，由米粉，奶粉及全蛋粉組成的，三種成分的比例為米粉：蛋白粉：奶粉為1：1：1，C/N為20。

接種物：餐廚垃圾厭氧發(fā)酵液。

反應(yīng)裝置：2L的連續(xù)CSTR在線自動采氣裝置。

實驗設(shè)置：共運行2個2L半連續(xù)厭氧發(fā)酵罐，分別為R1，R2。R1為空白對照，即餐廚垃圾獨立厭氧發(fā)酵，不添加菌劑。R2從運行的第41天開始每天添加實施例1得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌系固體菌劑0.3g。

2個反應(yīng)器的運行過程如下：水力停留時間(HRT)為20天，即每天排出100ml的發(fā)酵液，注入100ml的人工配置的餐廚垃圾。2個反應(yīng)器共連續(xù)運行100d，即4個HRT，每個HTR的有機負荷率(OLR)依次為0.5g/L d，0.75g/L d，1.0g/L d，1.5g/L d及2.0g/L d。

結(jié)果表明：有機負荷率為0.5g/L d的前15天內(nèi)，R1和R2的氨氮濃度相對較低為0.3g/L，產(chǎn)氣未受到抑制，兩個發(fā)酵罐的容積甲烷產(chǎn)量在0.16L左右，當(dāng)有機負荷提升至1.0g/L d時，氨氮濃度為2.0g/L d，R1未加菌劑的發(fā)酵體系產(chǎn)氣明顯下降，當(dāng)有機負荷率提至2.0g/L d，氨氮濃度達到3.0g/L，丙酸濃度為1.5g/L,由于氨氮和丙酸的綜合抑制導(dǎo)致R1完全不能產(chǎn)氣。而R2從第40天開始添加菌劑，隨著有機負荷的提升，發(fā)酵體系產(chǎn)氣量穩(wěn)定增加，當(dāng)有機負荷率提至2.0g/L d，氨氮濃度達到3.0g/L，仍可穩(wěn)定運行，且發(fā)酵液內(nèi)的丙酸濃度小于1.0g/L。

由此可見，通過本發(fā)明得到的耐氨氮丙酸產(chǎn)甲烷菌劑可應(yīng)對氨氮及丙酸的綜合抑制，提高餐廚垃圾厭氧發(fā)酵的發(fā)酵濃度，促進產(chǎn)氣。