本發(fā)明涉及多糖提取
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及孔石莼多糖分離產(chǎn)物及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
：孔石莼(Ulvapertusa)屬綠藻門(mén)(Chlorophyta)石莼科(Ulvaceae)石莼屬(Ulva)，是一種可食用的大型綠藻，它廣泛分布于北太平洋的西部、朝鮮、日本、中國(guó)及獨(dú)聯(lián)體亞洲部分海區(qū)的沿岸。在我國(guó)它主要分布于遼寧、河北、山東、江蘇等省沿海地區(qū)，其幼體綠色，成體顏色加深而為碧綠色，生長(zhǎng)在中潮帶及大潮干線附近的巖石或石沼中?？资欢嗵菍偌?xì)胞間產(chǎn)物，在藻體中以雜多糖形式而存在?，F(xiàn)代藥理研究證明，孔石莼多糖具有抗氧化、調(diào)血脂、抗腫瘤及抗病毒等多方面生理活性。但相比于臨床上常用的調(diào)血脂藥物，孔石莼多糖的降血脂效果起效慢且用藥劑量較大。因此獲得高效的多糖分離組分對(duì)于增強(qiáng)其降血脂效果、減輕病人用藥負(fù)擔(dān)等具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供具有高效抗氧化、調(diào)血脂活性的孔石莼多糖分離產(chǎn)物。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：孔石莼多糖分離產(chǎn)物，所述分離產(chǎn)物包括分離產(chǎn)物F1、分離產(chǎn)物F2和分離產(chǎn)物F3中的至少一種；所述分離產(chǎn)物F1由鼠李糖、木糖和葡萄糖按照摩爾比1:0.29～0.35:0.13～0.15的比例組成；分離產(chǎn)物F2由鼠李糖、木糖和葡萄糖按照摩爾比1:0.38～0.46:0.26～0.28的比例組成；分離產(chǎn)物F3由鼠李糖和木糖按照摩爾比1:0.36～0.44的比例組成。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述分離產(chǎn)物F1的重均分子量為200893Da，數(shù)均分子量為194940Da，分子量分布寬度為1.03；所述分離產(chǎn)物F2的重均分子量為190368Da，數(shù)均分子量為186162Da，分子量分布寬度為1.02；所述分離產(chǎn)物F3的重均分子量為83094Da，數(shù)均分子量為35374Da，分子量的分布寬度為2.35。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種操作簡(jiǎn)便、環(huán)境友好、適于大規(guī)?；a(chǎn)、且具有高效抗氧化活性和調(diào)血脂活性的孔石莼多糖分離產(chǎn)物的分離純化方法，所述分離純化方法包括下列步驟：(1)超聲溶解：通過(guò)水提醇沉方法得到孔石莼多糖，然后按照8g/L～11g/L的加入量加入到蒸餾水中，以200W～400W功率超聲處理1h～2h，間歇攪拌使其溶解得到多糖溶液；(2)離心處理：將步驟(1)得到的多糖溶液，按照6000-10000r/min的轉(zhuǎn)速離心5～10min，收集上清液；(3)離子交換柱層析處理：將步驟(2)所得上清液過(guò)DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱，依次用蒸餾水、0.5mol/L氯化鈉溶液、1mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，分部收集；(4)透析處理：將步驟(3)所得三種洗脫液分別于截留分子量為500Da的透析袋中，蒸餾水透析48h，得到保留液；(5)冷凍干燥：將步驟(4)中得到的三種保留液分別濃縮、冷凍干燥后，分別得到分離產(chǎn)物F1、分離產(chǎn)物F2和分離產(chǎn)物F3。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述步驟(1)中孔石莼多糖加入量為10g/L。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述步驟(2)中離心處理的轉(zhuǎn)速為8000r/min，時(shí)間為8min。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述步驟(3)中洗脫液的流速為10ml/min。作為一種改進(jìn)的技術(shù)方案，所述步驟(5)得到的分離產(chǎn)物，F(xiàn)1/g中糖醛酸含量為23.14％，硫酸根含量為21.75％；F2/g中糖醛酸含量為15.27％，硫酸根含量為15.56％；F3/g中糖醛酸含量為25.99％，硫酸根含量為23.99％。采用了上述技術(shù)方案后，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明以孔石莼為原料采用水提醇沉法得到的孔石莼多糖，經(jīng)過(guò)超聲溶解、離心處理、離子交換柱層析處理、透析處理、冷凍干燥后得到三種分離產(chǎn)物F1、F2和F3,通過(guò)紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)這三種分離產(chǎn)物與孔石莼多糖結(jié)構(gòu)相似，通過(guò)對(duì)超氧陰離子自由基清除實(shí)驗(yàn)、有機(jī)自由基DPPH的清除實(shí)驗(yàn)及還原能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)，得出這三種分離產(chǎn)物與孔石莼多糖相比具有較好的抗氧化活性，因此結(jié)合多糖的特性及構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)一步為開(kāi)發(fā)以孔石莼為原料，獲得高效生理活性的多糖分離組分并對(duì)于增強(qiáng)多糖分離組分的降血脂效果、減輕病人用藥負(fù)擔(dān)等研究奠定了基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為孔石莼多糖的紅外光譜圖；圖2為分離產(chǎn)物F1的紅外光譜圖；圖3為分離產(chǎn)物F2的紅外光譜圖；圖4為分離產(chǎn)物F3的紅外光譜圖。具體實(shí)施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。將孔石莼多糖與分離產(chǎn)物F1、F2和F3分別進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，紅外光譜吸收峰及對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)見(jiàn)表1。表1孔石莼多糖及分離產(chǎn)物F1、F2和F3的紅外光譜數(shù)據(jù)由于F1、F2和F3的紅外譜圖對(duì)比孔石莼多糖(U)的紅外譜圖并無(wú)明顯差異，沒(méi)有出現(xiàn)新的吸收峰，因此認(rèn)為各分離組分并無(wú)新的官能團(tuán)產(chǎn)生，即分離產(chǎn)物F1、F2和F3與孔石莼多糖(U)結(jié)構(gòu)相似。實(shí)施例1孔石莼多糖的提取方法(1)預(yù)處理：將孔石莼藻體用自來(lái)水洗凈，除去泥沙，雜草及其他附著物；然后自然涼干，粉碎后過(guò)60目篩，得到孔石莼藻體粉末，封裝備用；(2)脫脂處理：稱(chēng)取步驟(1)中的孔石莼藻體粉末，用80％乙醇回流三次，離心，40℃減壓干燥得到脫脂孔石莼藻體；(3)熱水提?。簩⒉襟E(2)得到的脫脂孔石莼藻體在125℃水浴條件下提取3次，每次提取2h，過(guò)濾，合并三次濾液，然后將濾液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用75％的乙醇沉淀24h，濾出沉淀；(4)干燥：將步驟(3)中濾出的沉淀用無(wú)水乙醇脫水處理兩次后，置于干燥箱內(nèi)40℃條件下烘干，得到孔石莼多糖粗品。該方法制備的孔石莼多糖主要的重復(fù)二糖單元:[-4>-β-D-GlcA-(1->4)-α-L-Rha3S-1>]和[-4>-α-L-IdoA-(1->4)-α-L-Rha3S-1>]。其結(jié)構(gòu)式分別為：其中G:(1→4)連接β－D－葡萄糖醛酸；R:(1→4)連接α－L－鼠李糖－3－硫酸基(與β－D－葡萄糖醛酸相連)；I:(1→4)連接α－L－艾杜糖醛酸；R*:(1→4)連接α－L－鼠李糖－3－硫酸基(與α－L－艾杜糖醛酸相連)。實(shí)施例2孔石莼多糖分離產(chǎn)物的分離純化方法(1)超聲溶解：準(zhǔn)確稱(chēng)取孔石莼多糖粗品(實(shí)施例1制備)10g置于1000ml燒杯中，加入蒸餾水1000ml，以400W功率超聲處理1h，間歇攪拌使其溶解；(2)離心處理：將步驟(1)得到的多糖溶液于高速離心機(jī)8000r/min離心8min，收集上清液；(3)離子交換柱層析：采用DEAE-SepharoseFastFlow離子交換填料裝柱使成5cm×20cm柱床，10倍蒸餾水平衡，然后將步驟(2)所得的1L上清液過(guò)DEAE-SepharoseFastFlow離子交換柱，依次用蒸餾水、0.5mol/L氯化鈉溶液、1mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，洗脫流速10ml/min，分部收集，苯酚—硫酸法在485nm處逐管測(cè)定多糖含量，以吸光度為縱坐標(biāo)，管數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，合并相同組分。經(jīng)檢測(cè)自蒸餾水洗脫開(kāi)始，收集200ml-1200ml洗脫液為水洗脫組分F1；自0.5mol/L氯化鈉溶液洗脫開(kāi)始，收集250ml-1200ml洗脫液為0.5mol/L氯化鈉溶液洗脫組分F2；自1mol/L氯化鈉溶液洗脫開(kāi)始，收集250ml-800ml洗脫液為1mol/L氯化鈉溶液洗脫組分F3；(4)透析處理：將步驟(3)所得三種洗脫液分別于截留分子量為500Da的透析袋中蒸餾水透析48h，得到保留液；(5)冷凍干燥：將步驟(4)中得到的三種保留液分別濃縮、在-40℃冷凍干燥14-18h，得到孔石莼多糖的三種分離純化產(chǎn)物。分離產(chǎn)物F1、F2和F3的收率見(jiàn)表2。表2分離產(chǎn)物F1、F2和F3的分離純化收率重量(g)多糖收率(％)孔石莼多糖原料10F14.8248.2F21.5615.6F30.454.5實(shí)施例3分離產(chǎn)物F1、F2和F3對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用清除實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系含有不同濃度多糖樣品以及435molL-1還原型輔酶I(NADH)1mL,150molL-1硝基四氮唑藍(lán)(NBT)1mL,72molL-1吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液1mL,上述各個(gè)溶液均為T(mén)ris-HCl緩沖液(16mmolL-1,pH8.0)配制,室溫下放置5min后,在560nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻捉M不加樣品和NADH溶液,對(duì)照組不加樣品溶液。清除率計(jì)算公式:清除率(％)＝(A對(duì)照-A樣品)/(A對(duì)照-A空白)100％清除率結(jié)果見(jiàn)表3。表3分離產(chǎn)物F1、F2和F3對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的F1、F2和F3樣品溶液對(duì)體外超氧陰離子自由基都有一定的清除能力，并且在0.012～0.2mg/ml的范圍內(nèi)，其清除率隨著濃度的增高而增強(qiáng)，在此濃度范圍內(nèi)分離產(chǎn)物F1和F3對(duì)超氧陰離子自由基的清除率都高于孔石莼多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除率。實(shí)施例4分離產(chǎn)物F1、F2和F3的還原性測(cè)定用磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)分別按照表3中的多糖濃度配制三種分離產(chǎn)物的樣品2mL和鐵氰化鉀(1％w/v)2mL，在50℃保溫反應(yīng)20min，用2mL三氯乙酸(10％w/v)中止反應(yīng)。搖勻，取上清2mL，加入三氯化鐵(0.1％w/v)1mL，搖勻，在700nm處測(cè)定吸光度，以0.13mmoL/LVc作為陽(yáng)性對(duì)照。三種產(chǎn)物的還原性結(jié)果見(jiàn)表4。表4分離產(chǎn)物F1、F2和F3的還原性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的F1、F2和F3樣品溶液具有一定能力的還原能力，并且在0.8～4mg/ml的濃度范圍內(nèi)，其還原力隨著濃度的增高而增強(qiáng)。而且在此濃度范圍內(nèi)分離產(chǎn)物F2的還原性比孔石莼多糖的還原性強(qiáng)。實(shí)施例5分離產(chǎn)物F1、F2和F3對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用清除反應(yīng)體系是以水為溶劑，分別按照表3中的濃度依次配置三種分離產(chǎn)物樣品溶液和2mL0.1mmolL-1DPPH溶液,其中DPPH以乙醇溶液為溶劑,室溫放置30min后,于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。對(duì)照組使用1mL蒸餾水代替樣品溶液。清除率計(jì)算公式:清除率(％)＝(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100％清除率結(jié)果見(jiàn)表5。表5分離產(chǎn)物F1、F2和F3對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的F1、F2和F3樣品溶液對(duì)體外有機(jī)自由基DPPH都有一定的清除能力，并且在1.5～7.9mg/ml的范圍內(nèi)，其清除率隨著濃度的增高而增強(qiáng)，在此濃度范圍內(nèi)分離產(chǎn)物F2對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除率要高于孔石莼多糖對(duì)有機(jī)自由基DPPH的清除率。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3