本發(fā)明屬于細胞工程
技術領域：
，特別涉及一種永生化的牛精原干細胞系及其構建的方法。
背景技術：
：雄性生殖干細胞，又稱作精原干細胞(spermatogonialstemcells，SSCs)，是位于睪丸曲細精管基膜上能通過自我更新維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定，同時在體內定向分化并最終生成精子的一類成體干細胞。同時，它也能在特定條件下誘導去分化成為多能干細胞，這樣就能繞過胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESCs)治療的理論與技術難題。與其他成體干細胞不同的是，它是雄性成年哺乳動物體內唯一能通過自然生殖過程將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細胞，因此，在生殖醫(yī)學、干細胞生物學、物種保護等領域都將作其為重點來研究。西北農林科技大學陜西省干細胞研究中心在精原干細胞的研究上已開展了一定的基礎工作。(Wu,Songetal.2013)(Zhu,Maetal.2014)等先后在奶山羊精原干細胞的分離純化，培養(yǎng)基的篩選，以及細胞生物學，分子生物學鑒定方面做了大量的工作。并且發(fā)現(xiàn)了奶山羊雄性生殖干細胞表達多能性與生殖細胞的標記，具有增殖能力和向三胚層細胞分化的潛能，同時也發(fā)掘出在雄性生殖干細胞自我更新及分化機制研究中起重要作用的多個關鍵因子。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術問題在于提供一種永生化的牛精原干細胞系及其構建的方法，永生化后的牛精原干細胞沒有丟失精原干細胞的表型特征和生物學特性，且能夠向三胚層以及精子樣方向分化。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：一種永生化的牛精原干細胞系，是以牛精原干細胞作為宿主細胞，通過用pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體表達的慢病毒轉導，轉導后的牛精原干細胞表達SV40大T抗原，成為具有多向分化潛能的轉化體。其細胞為成纖維樣，呈多角形和短梭狀，有兩個或兩個以上的核仁，細胞間存在接觸抑制。牛精原干細胞系在傳代培養(yǎng)35代以后SV40大T抗原還能夠被表達。一種永生化的牛精原干細胞系的構建方法，包括以下步驟：1)將預處理的睪丸組織剪碎，加入10倍體積的CDD溶液中消化處理；然后等體積中和液中和，室溫離心后棄上清，用DMEM+10％FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巰基乙醇的溶液重新懸浮細胞后接種于培養(yǎng)皿上，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，再采用免疫磁珠抗體CD90分選獲取純化的牛精原干細胞；所述的CDD溶液包含2mg/mL膠原酶、20μg/mLDNase和2mg/mLDispase；所述的中和液為DMEM/F12+10％胎牛血清；2)驗證好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達載體和慢病毒包裝組成成分質粒pVSVG、pAX共同轉染293T細胞包裝獲得假慢病毒感染顆粒，用來轉導細胞，并進一步檢測。操作如下：⑴多聚賴氨酸溶液包被處理細胞培養(yǎng)皿，吸除多聚賴氨酸晾干培養(yǎng)皿后接種107個293T細胞。⑵待次日細胞生長至70-90％鋪滿培養(yǎng)皿時，換取新鮮溫熱培養(yǎng)液。⑶按照轉染試劑轉染體系，將目的載體、慢病毒輔助質粒共同轉染進293T細胞。取質粒:pLOX-Ttag-iresTKT14μg；pVSVG7μg；pAX7μg，依次將轉染組分別加入一個無菌潔凈的玻璃離心管，混勻室溫靜置15min后逐滴加到293T細胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。在換取新鮮培養(yǎng)液48h收取包含病毒顆粒的細胞上清液，0.45μm濾器過濾去除細胞碎片等雜質后，將此病毒液-80℃凍存或者用PG8000濃縮，以備后繼試驗。牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿，上將牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿上，12h后將含有10μg/mlpolybrene的病毒液溶液加入含有低血清培養(yǎng)皿中。24h后換上新鮮的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)、傳代3個月以上，直到細胞永生化，永生化后使用含血清的完全培養(yǎng)基。所述的低血清培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/mL青霉素，100mg/mL鏈霉素.20ng/mLGDNF,20ng/mLbFGF,10ng/mLLIF。永生化的細胞使用的含有血清的完全培養(yǎng)基為DMEM/F12加入10％FBS、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素。所述的睪丸組織的處理為：將3月齡以上的睪丸組織經高濃度雙抗(300U/mL青霉素，300mg/mL鏈霉素)清洗后轉移到細胞培養(yǎng)室，經75％醫(yī)用酒精浸泡1-2min；剪開白膜及睪丸組織，取出部分組織浸泡于PBS中，反復清洗3-4次后用剪刀剪碎。所述精原干細胞的純化是原代差速貼壁法分離收集未貼壁的精原細胞，將收集的未貼壁精原細胞按如下步驟進行細胞分選：1)未貼壁精原細胞1200rpm室溫離心5min，棄去培養(yǎng)液；2)離心所得細胞用PBS重懸后計數(shù)，按1×107/管分裝，1200rpm室溫離心5min，棄去PBS；3)離心沉淀所得細胞用20μL的CD90磁珠抗體加80μL的MACSBuffe重懸，4度孵育15min；4)孵育細胞1200rpm室溫離心5min，收集上層一抗稀釋液；5)細胞沉淀再用500μLMACSBuffer重懸成細胞懸液，用500μLMACSBuffer潤洗MACS分選柱，待潤洗的MACSBuffer將要流完時，及時緩慢滴加細胞懸液；6)收集流過分選柱的細胞懸液，獲得CD90陰性精原細胞；待細胞懸液完全流過MACS分選柱后，再用500μLMACSBuffer緩慢潤洗分選柱，然后取下分選柱，再向分選柱中滴加500μLMACSBuffer，收集用助推活塞推出的MACSBuffer，其中含有CD90陽性精原細胞，收集分選的牛精原干細胞接種到鋪了Laminin的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mmol/Lβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/ml青霉素，100mg/mL鏈霉素.20ng/mLGDNF,20ng/mLbFGF,10ng/mLLIF。通過pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體轉導致牛精原干細胞得到連續(xù)傳代3個月以上且能夠表達SV40大T抗原。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果：1)本發(fā)明通過將pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體轉染牛精原干細胞，使得重組后的牛精原干細胞表達SV40大T抗原，以解決分離出的牛精原干細胞隨著傳代次數(shù)的提高活力差和難以存活的問題，得到具有多向分化潛能的永生化的牛精原干細胞系。2)本發(fā)明篩選獲得的永生化的牛精原干細胞系，其生長狀況良好，細胞的生命力較之以前的大大提高，便于規(guī)?；膽茫辉隗w外傳代35代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，不發(fā)生凋亡，是一種永生化的細胞系，目前已能夠傳至45代。3)本發(fā)明篩選獲得的永生化的牛精原干細胞系，其營養(yǎng)要求較低，原始分離得到的牛精原干細胞的培養(yǎng)需要10％的胎牛血清、GDNF、bFGF等各種生長因子，而現(xiàn)在只要求10％的胎牛血清，降低了培養(yǎng)的成本。4)將篩選獲得的永生化的牛精原干細胞系，經過誘導后能夠分化形成三胚層細胞，及其精子樣細胞，將其移植到生精缺陷的受體小鼠睪丸中內，能在受體老鼠的睪丸中增殖形成克隆，并遷移到曲細精管基底膜。附圖說明圖1為牛精原干細胞形成的克隆及其相關標記基因和蛋白表達結果圖；圖2為永生化載體鑒定及永生化后細胞生長曲線結果圖；圖3為永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)系相關標記基因和蛋白表達結果圖；圖4為永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)系體外誘導分化能力檢測結果圖；圖5為永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)系向精子細胞分化功能的檢測結果圖；圖6為移植檢測生殖干細胞功能檢測結果圖；圖7為熒光顯微鏡檢測結果圖。具體實施方式本發(fā)明提供一種永生化的牛精原干細胞系，是以牛精原干細胞作為宿主細胞，通過將pLOX-Ttag-iresTK慢病毒表達載體轉染牛精原干細胞，該細胞系在體外傳代35代以上仍有較好的活力，保持分裂增殖，是一種永生化的細胞系。以下通過對永生化的牛精原干細胞系的構建、細胞形態(tài)特征、標志物的基因及免疫鑒定、誘導分化，以及移植到生精缺陷的受體小鼠睪丸中來做詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。1.牛精原干細胞(bSSCs)的分離及相關標記基因的鑒定1.1將取到的3月齡以上的睪丸組織經高濃度雙抗(300U/mL青霉素，300mg/mL鏈霉素)清洗后轉移到細胞培養(yǎng)室；經75％醫(yī)用酒精短暫浸泡1-2min。剪開白膜及睪丸組織，取出部分組織浸泡于PBS中，反復清洗3-4次后用剪刀剪碎；加入10倍體積的CDD(2mg/mL膠原酶+20μg/mLDNase+2mg/mLDispase)37℃消化30min；然后加入等體積的DMEM/F12+10％胎牛血清(FBS)中和，2000r/min室溫離心；5min后棄上清，用DMEM+10％FBS+2mmol/L谷氨酰胺+100μmol/Lβ-巰基乙醇的溶液重新懸浮細胞后接種于90mm培養(yǎng)皿上，37℃、5％CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，得到含有精原干細胞的細胞群；然后采用免疫磁珠抗體CD90分選純化精原干細胞；1.2CD90磁珠抗體分選富集精原干細胞原代差速貼壁法分離收集未貼壁的精原細胞(含有少量的精母細胞和精子細胞)，將收集的未貼壁精原細胞按如下步驟進行細胞分選：1)未貼壁精原細胞1200rpm室溫離心5min，棄去培養(yǎng)液；2)離心細胞用PBS重懸后計數(shù)，按1×107/管分裝，1200rpm室溫離心5min，棄去PBS；3)離心沉淀細胞用20μL的CD90磁珠抗體加80μL的MACSBuffe重懸，4度孵育15min；4)孵育細胞1200rpm室溫離心5min，收集上層一抗稀釋液；5)細胞沉淀再用500μLMACSBuffer重懸成細胞懸液，用500μLMACSBuffer潤洗MACS分選柱，待潤洗的MACSBuffer將要流完時，及時緩慢滴加細胞懸液；6)收集流過分選柱的細胞懸液，即為CD90陰性精原細胞；待細胞懸液完全流過分選柱后，再用500μLMACSBuffer緩慢潤洗分選柱，然后從分選磁架上取下分選柱，再向分選柱中滴加500μLMACSBuffer，收集用助推活塞推出的MACSBuffer，其中即含有CD90陽性精原細胞，收集分選的牛精原干細胞接種到鋪了Laminin的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，其中(圖1B)為培養(yǎng)兩周形成的克隆。1.2細胞免疫熒光檢測將牛精原干細胞用4％多聚甲醛固定后，細胞免疫熒光染色進行牛精原干細胞特征性標志和胚胎干細胞標志的鑒定，同時以BSA為陰性對照進行染色。具體結果如圖1所示。牛精原干細胞(bSSCs)的生殖標記基因(VASA)、干性標記基因(PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP9.5)、胚胎干細胞標記基因(OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF4)分別如圖1A所示，結果表明:VASA、PLZF、GFRα-1、ETV-5、LIN28、PGP9.5、OCT/4、SOX-2、NANOG、KLF-4均為陽性。1.3RT-PCR檢測以PCR擴增的第一鏈cDNA為模板，各個標志物相對應的引物(如表1所示)進行PCR擴增，然后對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。表1牛精原干細胞和胚胎干細胞相關標志物及其相應的PCR擴增引物標志物上游引物下游引物擴增TPLZF5'-CACCGCAACAGCCAGCACTAT-3'5'-CGGCATACAGCAGGTCATCCAA-3'127bp60β-actin5'-CGGCAATGAGCGGTTCC-3'5'-CGTGTTGGCGTAGAGGTCCT-3'142bp60SOX-25'-CCCGTGGTTACCTCTTCTTCC-3'5'-CGCTCTGGTAGTGCTGGGAC-3'145bp60Nanog5'-CCCGAAGCATCCAACTCTAGG-3'5'-GTCCGTGTCGAGGGTGTCA-3'93bp60LIN285'-CTGGAATCTATCCGAGTCACCG-3'5'GATGCTCTGGCAGAAATGGC-3'192bp60KLF-45'-TGCGGCAAAACCTACACG-3'5'-CCCACAACCATCCCAGTCA-3'96bp60OCT-45'-AAGGGCAAACGATCAAGCA-3'5'-AATGGGACCGAAGAGTACAGAGT-3”167bp60牛精原干細胞(bSSCs)標記基因的表達情況如圖1C所示，各個標志物基因均被表達，說明其具有精原干細胞的特征。2、pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達載體的鑒定pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達載體購買于Addgene公司，pLOX-Ttag-iresTKT質粒全長12290bp(圖2A)，用NotI酶單酶切，用NotI酶和NotI和BamHI酶雙酶切后進行電泳，及PCR鑒定所得片段長度和預期一致(圖2B)，電泳結果表明質粒完好，可以使用。3、永生化的牛精原干細胞(bSSCs)系的構建3.1牛精原干細胞(bSSCs)的永生化1)慢病毒的包裝及病毒感染。驗證好的pLOX-Ttag-iresTKT慢病毒表達載體和慢病毒包裝組成成分質粒pVSVG、pAX共同轉染293T細胞包裝獲得假慢病毒感染顆粒，用來轉導細胞，并進一步檢測。操作如下：1)多聚賴氨酸溶液包被處理細胞培養(yǎng)皿，吸除多聚賴氨酸晾干培養(yǎng)皿后接種107個293T細胞。2)待次日細胞生長至70-90％鋪滿培養(yǎng)皿時，換取新鮮溫熱培養(yǎng)液。3)按照轉染試劑轉染體系，將目的載體、慢病毒輔助質粒共同轉染進293T細胞。取質粒:pLOX-Ttag-iresTKT14μg；pVSVG7μg；pAX7μg，依次將轉染組分別加入一個無菌潔凈的玻璃離心管，混勻室溫靜置15min后逐滴加到293T細胞培養(yǎng)液中，輕輕搖勻。在換取新鮮培養(yǎng)液后48h收取包含病毒顆粒的細胞上清液，0.45μm濾器過濾去除細胞碎片等雜質后，將此病毒液-80℃凍存或者用PG8000濃縮，以備后繼試驗。牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿，上將牛精原干細胞按照1×105細胞/35mm皿上，12h后將含有10μg/mlpolybrene的病毒液溶液加入含有低血清培養(yǎng)皿中。24h后換上新鮮的培養(yǎng)液連續(xù)培養(yǎng)、傳代3個月以上，直到細胞永生化，永生化后使用含血清的完全培養(yǎng)基。所述的低血清培養(yǎng)基組成成分為:DMEM/F12+10％KSR+0.1mMβ-巰基乙醇,2mmol/L谷氨酰胺,1％非必需氨基酸,1％FBS,100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素.20ng/mlGDNF,20ng/mlbFGF,10ng/mlLIF。永生化的細胞使用的含有血清的完全培養(yǎng)基為DMEM/F12加入10％FBS、1mmol/L丙酮酸鈉、0.1mmol/Lβ-巰基乙醇、2mmol/L谷氨酰胺、100mg/mL青霉素/鏈霉素。2)細胞群體倍增時間分析(Populationdoublingtime,PDT)牛精原干細胞連續(xù)傳代，統(tǒng)計起始細胞數(shù)和培養(yǎng)48h后的細胞數(shù)。PDT的計算參考PDT＝[log2/(logNt0-logN0)]×t，Nt＝培養(yǎng)后的細胞數(shù)，N0＝接種細胞數(shù)，t為培養(yǎng)時間。對細胞的群體倍增時間分析發(fā)現(xiàn)永生化的牛精原干細胞的群體倍增時間由50.9h縮短到了27.24h(圖2C、D)說明其增殖能力顯著地增強。3.2永生化牛精原干細胞系(bSSCs-Ttag)相關標記基因的鑒定3.2.1westernblotting鑒定牛精原干細胞相關基因的表達將第6代、第8代、第10代的牛精原干細胞bSSCs-Ttag用蛋白提取試劑盒提取細胞的總蛋白做Westernblotting。結果說明永生化后的牛精原干細胞bSSCs-Ttag能夠成功的表達永生化基因(SV40)及精原干細胞標記基因(PGP9.5、OCT4)(如圖3A所示)。3.2.2RT-PCR鑒定相關基因的表達牛精原干細胞(bSSCs)標記基因的表達情況如圖3B所示，永生化基因(SV40)、干性標記基因(PLZF、LIN28、)、胚胎干細胞標記基因(OCT4、NANOG、KLF4)、增殖標記(PCNA)、分化標記基因(C-KIT)均被表達，說明永生化基因SV40成功的整合到細胞的基因組上，且建立的永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)沒有丟失其生物學特性。3.2.3細胞免疫熒光鑒定相關基因的表達將牛精原干細胞用4％多聚甲醛固定后，細胞免疫熒光染色進行永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)相關標志基因的鑒定，同時以BSA為陰性對照進行染色。結果顯示(如圖3B)永生化牛精原干細胞(bSSCs-Tag)的生殖標記基因(VASA)、干性標記基因(PLZF、ETV-5、CD49f、PGP9.5)均能夠表達。3.2.4永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)的體外分化能力檢測將第13代的永生化的牛精原干細胞解離成單細胞懸液，用DMEMF/12+10％FBS+2mmol/LGlu+1％NEAA+100U/ml青霉素+100mg/ml鏈霉素的溶液按照800–1000細胞/25μL懸浮培養(yǎng)以形成EB(如圖4A)。進一步分化時將EB接種在0.1％明膠處理的培養(yǎng)板上，用DMEM/F12+10％FBS+0.1mmol/Lβ-ME+2mmol/LGlu+1mmol/L丙酮酸鈉+0.1mmol/LNEAA培養(yǎng)3–14天以探究其自發(fā)分化能力。細胞分化后免疫熒光染色檢測NESTIN(外胚層)、ASM(中、內胚層)、PDX1(內胚層)均有出現(xiàn)部分陽性細胞，同時PCR檢測結果顯示NESTIN(外胚層)、ASM(中、內胚層)、PDX1(內胚層)均能夠表達(如圖4B、C所示)。3.2.5永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)向精子細胞分化功能的檢測永生化牛精原干細胞形成EB后用RA誘導，誘導7d后出現(xiàn)精子樣細胞(圖5A)。細胞免疫熒光染色檢測減數(shù)分裂各期細胞的表達情況，結果證實減數(shù)分裂前標記(STRA8)、減數(shù)分裂標記(DAZL)及減數(shù)分裂后標記(EXCO-2、ACR)都有表達(圖5B),同時q-PCR結果顯示經過RA誘導后的細胞其減數(shù)分裂前標記(STRA8)、減數(shù)分裂標記(SCP-3、DAZL)及減數(shù)分裂后標記(EXCO-2)均上調(圖5C)，這些結果證實了永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)具有分化為精子細胞的能力。3.2.6永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)移植檢測生殖干細胞功能收集培養(yǎng)到第15代轉導了GFP的永生化的牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)，用DMEM/F12+10％FBS的培養(yǎng)基重懸細胞，按照105細胞/睪丸的量將細胞注入生精缺陷的受體小鼠睪丸曲細精管中。2個月后收集移植后的小鼠睪丸，將曲細精管和固定、切片后的樣品在熒光顯微鏡下鏡檢，照相記錄結果。兩個月后通過受體小鼠睪丸的切片檢測，發(fā)現(xiàn)2個月后依然能夠檢測到永生化牛精原干細胞(bSSCs-Ttag)存在(如圖6A,B、圖7A,B所示)。證明永生化牛精原干細胞具有雄性生殖干細胞的功能。雄性生殖干細胞在機體內擔負傳遞遺傳信息的重擔，在生殖醫(yī)學、干細胞生物學、畜牧生產等領域具有重要的理論價值和廣闊的應用前景。在睪丸曲細精管內，雄性生殖干細胞在維持自我更新的基礎上，不斷分化，經減數(shù)分裂產生源源不斷的精子以維持雄性個體的生育能力。本發(fā)明將牛精原干細胞進行永生化，并且對永生化后的牛精原干細胞系bSSCs-Ttag進行相關基因的檢測以及誘導分化，結果顯示永生化后的牛精原干細胞系bSSCs-Ttag仍然具備雄性生殖干細胞的生物學特性。當前第1頁1 2 3