本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，本發(fā)明還涉及一種抗瓜類作物白粉病的微生物菌劑。
背景技術：
：白粉病是瓜類作物發(fā)生較為普遍的一種病害，白粉病菌有3個屬6個種，瓜單囊殼菌和二孢白粉菌是主要病原，而瓜單囊殼菌又有報道發(fā)現(xiàn)多個生理小種。白粉病主要危害葉片，也侵染葉柄、瓜蔓和瓜。葉片發(fā)病初在葉面上產生近圓形白色小霉點(即病原菌菌絲和分生孢子)，后擴大成霉斑，條件適宜，霉斑迅速擴大，彼此連片，白粉狀物會布滿整個葉片，致葉片變脆，后期病斑上霉狀物變灰白色，其上長出黑色小粒點，即病菌的閉囊殼。發(fā)病重的，葉片出現(xiàn)不規(guī)則黃褐病斑，病斑連片致整個葉片褐色干枯，但不脫落。葉柄、瓜蔓和瓜染病，亦產生白色粉斑，發(fā)展后，病部布滿白粉。白粉病可減少植株冠層，降低單株座果率，使果實變小，從而導致減產失去市場價值，給栽培者造成嚴重的經濟損失。我國是農業(yè)大國，農藥使用品種多，用量大，其中70～80％的農藥直接散落在環(huán)境中。應用化學農藥后，不僅植物本身吸附大量農藥，而且通過滲透作用進入植物內部，造成嚴重殘留，進而對農產品產生污染。生物從環(huán)境介質或食物中不斷吸收低劑量的有毒物質，并逐漸在體內積累濃縮，在整個生態(tài)系統(tǒng)中，農藥不斷地通過生物富集與食物鏈的傳遞，逐級濃縮、逐級放大，人類處于食物鏈頂端，受害最為嚴重?；瘜W農藥的持續(xù)使用，造成土壤肥力下降，板結等，會引起土壤微生物體系的劇烈改變，進而影響土壤中酶的活性，營養(yǎng)物質的轉化，改變農業(yè)人生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)循環(huán)的效率和速度，使土地持續(xù)生產力下降。針對病害的生理特點，適時對癥下藥，選擇高效、安全、生物活性高的生物農藥，就顯得尤為重要。目前白粉病多采用化學防治方法，但由于白粉病病原菌分化快，亞種多，化學試劑很難長期有效地保證作物的無公害生產，因此，新的安全、高效、經濟的防控手段成為熱門。近年來已經研究報道了大量的拮抗微生物，包括細菌、酵母菌、放線菌等。然而普通細菌、酵母菌及放線菌抗逆性較差，生長環(huán)境要求高，無法批量推廣應用。芽孢作為整個生物界中抗逆性最強的生命體，在抗熱，抗化學藥物和抗輻射等方面，十分突出。解淀粉芽孢桿菌作為一種好氧產芽孢的革蘭氏陽性桿狀細菌，目前尚無報道對人畜致病，其營養(yǎng)要求簡單、易于存活、定植與繁殖，穩(wěn)定性好，不僅能提高作物的產量，增加抗逆性，而且還大大地增加了土壤肥力，當其在土壤中繁殖為優(yōu)勢菌群后，還可以達到抑制病原菌的效果，很適合作為生防菌和生物肥料大量生產應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了彌補解淀粉芽孢桿菌在瓜類作物白粉病防治應用領域的空白，提供一株具有芽孢高產的解淀粉芽孢桿菌及其微生物菌劑。本發(fā)明以解淀粉芽孢桿菌為出發(fā)菌株，經過常壓室溫等離子體誘變，獲得一株具有芽孢高產的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)KN-527，已于2015年11月26日在中國武漢武漢大學內的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號CCTCCNO:M2015709。本發(fā)明提供了一種抗瓜類作物白粉病的微生物菌劑，包含上述解淀粉芽孢桿菌KN-527。所述微生物菌劑能用作促進瓜類作物生長的生物肥料。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌經過離子體誘變篩選后，產芽孢數可以達到1.19E+10CFU/克，比誘變前的出發(fā)菌株7.37E+09CFU/克，提高了161％。田間試驗結果表明，施藥14天后，KN-527對甜瓜白粉病的防效達到95％以上，明顯優(yōu)于化學農藥多菌靈。所述菌株能有效預防瓜類白粉病的發(fā)生，實驗組黃瓜、南瓜、西瓜的病情指數遠遠低于對照組，0.1億cfu/g解淀粉芽孢桿菌菌劑稀釋3000倍菌液(施藥14天)能有效防治瓜類白粉病，病指控制在6％以下，防效達到90％以上；施藥14天后，對照組病指均達到了97％以上，而對草莓、小麥、辣椒等非瓜類作物的白粉病防效較低。具體實施方式以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1(1)解淀粉芽孢桿菌出發(fā)菌株的純化培養(yǎng)挑取出發(fā)菌株解淀粉芽孢桿菌KN-52(從武漢蔬菜種植基地土壤中自然篩選而得)單菌落，接入由蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％，氯化鈉1％，pH7.2-7.5組成的簡單培養(yǎng)基中，在溫度32℃與180rpm的條件下恒溫搖床上培養(yǎng)16-20小時，取10ml發(fā)酵液，4℃，6000r/min條件下離心，收集菌漿待用；(2)初篩：常溫常壓等離子誘變法取步驟(1)制備的菌體用10ml無菌生理鹽水溶解震蕩均勻，取10μl涂于在已滅菌的金屬載片上，將載片置于載物臺上，調整載物臺高度，設定好處理時間后對解淀粉芽孢桿菌進行照射。氦氣為載體，照射功率150W，工作空氣流量10SLPM，照射距離2mm，照射時間60～240s。照射處理后將載片轉移到裝有1ml無菌生理鹽水的EP管中，振蕩1～2min，使附著在載片上的菌體洗脫到生理鹽水中，形成新的敏感菌懸液。將敏感菌懸液稀釋至10-4、10-5、10-6共3個梯度。(3)甜瓜白粉病病原菌的收集，制備壓力篩選平板田間采集嚴重感染白粉病的甜瓜葉片，葉片表面噴灑無菌水，4℃冰箱過夜。在超凈工作臺中，用洗耳球吹入水瓊脂平板，放入培養(yǎng)箱，20攝氏度培養(yǎng)7d。配置壓力篩選平板固體培養(yǎng)基，蔗糖5％-10％、酵母抽提物0.1-0.5％、氯化鈉0.02％-0.05％、硫酸鎂0.02％-0.05％、碳酸鈣0.05％-0.2％、瓊脂粉2％，pH7.2-7.5組成，滅菌后與45度左右加入2％白粉病病原菌；將稀釋的敏感菌懸液的每個梯度涂布3塊壓力篩選平板。將涂布后的平板放置培養(yǎng)箱中30℃進行培養(yǎng)16h。挑取抑菌圈透明帶大的單菌落接入斜面培養(yǎng)基，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)全部形成芽孢后收入4℃冰箱保存?zhèn)溆?；所述的斜面培養(yǎng)基是由蛋白胨1％、酵母浸粉0.5％、氯化鈉1％、瓊脂粉1.5％-2％，pH7.2-7.4組成；(4)抗性菌株高產株的選擇取步驟(3)中斜面菌種，用25ml無菌水洗下裝入無菌帶玻璃珠的100ml三角瓶中，震蕩混合均勻制成菌懸液后放入70℃水浴鍋中水浴30min，取出用冷水立即降至室溫后接入發(fā)酵種子搖瓶32℃與180rpm的條件下培養(yǎng)16-24h后轉入發(fā)酵搖瓶，同樣在32℃與180rpm的條件下培養(yǎng)40-48h；取搖瓶發(fā)酵液，常規(guī)涂片，用堿性石炭酸復紅染色，用奧林巴斯顯微鏡油鏡(16×100倍)觀察發(fā)酵后芽孢形成率。選擇具有典型解淀粉芽孢桿菌芽孢形態(tài)，芽孢形成率高的菌株。根據上述結果，綜合判斷誘變菌株的抗病能力和芽孢形成率，得到一株芽孢形成率高的菌株KN-527。經發(fā)酵后CFU對比，KN-527芽孢數可達1.19E+10，比誘變前的出發(fā)菌株CFU7.37E+09，提高161％，見表1。表1菌株編號取樣量(ml)試管123空白CFUKN-52(出發(fā)菌株)1-10.5767827137.43E+09KN-52(出發(fā)菌株)1-20.5773726867.30E+09KN-5272-10.5711011711951.18E+10KN-5272-20.5712011811921.20E+10實施例2解淀粉芽孢桿菌KN-527對甜瓜白粉病的田間抑制效果驗證。1.材料供試藥劑：解淀粉芽孢桿菌KN-527、化學農藥選用傳統(tǒng)白粉病防治藥劑。供試作物：甜瓜防治對象：白粉病試驗共設置3個處理：(1)對照組：清水處理；(2)處理組：0.1億CFU/g所述解淀粉芽孢桿菌稀釋1000、2000和3000倍(3)50％多菌靈可濕性粉劑；以上處理在科研基地甜瓜大棚內進行。供試甜瓜施藥前摘除瓜的側蔓，于發(fā)病初期第一次施藥，隔7d后再噴藥1次，將藥液均勻噴灑在植株葉片上。2.方法與結果定點定株調查，每片區(qū)選10株，每株視生長情況調查5片葉長5cm以上的葉片，藥前調查病情級數，藥后7d、14d各調查一次，按葉片發(fā)病程度分級計數。分級標準：按0～9級病情分級指數標準0級：葉健，無病斑1級：病斑占全葉葉面積的10％以下；3級：病斑占全葉葉面積的11％～25％；5級：病斑占全葉葉面積的16％～40％；7級：病斑占全葉葉面積的41％～65％；9級：病斑占全葉葉面積的65％以上；藥效計算方法：病情指數(％)＝∑(各級病葉數×相應病級數)×100％/調查總葉數×最高病級數；病指增長率＝(藥后病指-藥前病指)/藥前病指×100％；防效＝[1-(處理區(qū)藥后病指×對照區(qū)藥前病指)/(處理區(qū)藥前病指×對照區(qū)藥后病指)]×100％。表2解淀粉芽孢桿菌對甜瓜白粉病的田間抑制效果驗證從表2的數據中可以看出，0.1億cfu/g解淀粉芽孢桿菌菌劑稀釋1000、2000和3000倍菌液(施藥14天)能有效防治甜瓜白粉病，病指控制在5％以下，防效達到95％以上；施藥14天后，對照組病指達到了98.2％，50％多菌靈可濕性粉劑對甜瓜白粉病的防效為65.4％，而稀釋了3000倍的菌液防治甜瓜白粉病的防效就可以達到95.9％。實施例3解淀粉芽孢桿菌KN-527作為生物肥料對甜瓜的田間效果驗證。供試藥劑：解淀粉芽孢桿菌KN-527供試作物：甜瓜營養(yǎng)液：以色列Polyfood全元素營養(yǎng)液試驗方法:將定植一周后的甜瓜分為兩組，A組施用營養(yǎng)液+清水，B組施用營養(yǎng)液+解淀粉芽孢桿菌可濕性粉劑。在抽蔓期、座瓜期、膨瓜期對植株生長情況、果實生長情況及產量、品質進行考察。表3解淀粉芽孢桿菌作為生物肥料對甜瓜的田間效果驗證試驗結果表明，解淀粉芽孢桿菌KN-527可作為生物肥料，對甜瓜植株生長具有明顯促進作用，生發(fā)側枝能力增強，植株粗壯。實施例4解淀粉芽孢桿菌KN-527對瓜類白粉病和其他作物白粉病的田間抑制效果驗證。1.材料供試藥劑：解淀粉芽孢桿菌CCTCCNO:M2015709供試作物：黃瓜、南瓜、西瓜、草莓、小麥、辣椒防治對象：白粉病試驗共設置2個處理：(1)處理組：清水處理(CK)；(2)0.1億CFU/g所述解淀粉芽孢桿菌3000倍液以上處理在科研基地各大棚內進行。供試作物于發(fā)病初期第一次施藥，隔7d后再噴藥1次，將藥液均勻噴灑在植株葉片上。2.方法與結果定點定株調查，每片區(qū)選20株，每株視生長情況調查5片葉長5cm以上的葉片，藥前調查病情級數，藥后7d、14d各調查一次，按葉片發(fā)病程度分級計數。分級標準：按0～9級病情分級指數標準0級：葉健，無病斑1級：病斑占全葉葉面積的10％以下；3級：病斑占全葉葉面積的11％～25％；5級：病斑占全葉葉面積的16％～40％；7級：病斑占全葉葉面積的41％～65％；9級：病斑占全葉葉面積的65％以上；藥效計算方法：病情指數(％)＝∑(各級病葉數×相應病級數)×100％/調查總葉數×最高病級數；病指增長率＝(藥后病指-藥前病指)/藥前病指×100％；防效＝[1-(處理區(qū)藥后病指×對照區(qū)藥前病指)/(處理區(qū)藥前病指×對照區(qū)藥后病指)]×100％。表4解淀粉芽孢桿菌對瓜類及其它作物白粉病的田間抑制效果驗證白粉病菌有3個屬6個種，瓜單囊殼菌和二孢白粉菌是主要病原。黃瓜、南瓜、西瓜等瓜類白粉病的病原菌主要是瓜單囊殼菌，而草莓、小麥、辣椒白粉病的病原菌主要是羽衣草單囊殼菌、禾本科布氏白粉菌、韃靼內絲白粉病。從表4的數據中可以看出，0.1億cfu/g解淀粉芽孢桿菌菌劑稀釋3000倍菌液(施藥14天)能有效防治瓜類白粉病，病指控制在6％以下，防效達到90％以上；施藥14天后，對照組病指均達到了97％以上，對草莓、小麥、辣椒白粉病的防效分別為81.3％、50.2％和63.8％，防治效果不理想。當前第1頁1 2 3