本發(fā)明涉及固定酶載體技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種固定酶的纖維素-SiO2復(fù)合載體的制備方法及纖維素-SiO2復(fù)合載體在固定酶方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酶屬于生物催化劑，與普通的化學(xué)反應(yīng)催化劑相比，酶可在常溫、常壓等較為溫和的條件下進(jìn)行高選擇性的催化反應(yīng)。但由于酶一般是水溶性蛋白質(zhì),故往往存在如下缺點(diǎn):①不穩(wěn)定，易失活；②難以回收與反復(fù)使用；③不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。
固定化酶技術(shù)可改善上述缺點(diǎn)。固定化酶技術(shù)中，最為關(guān)鍵的是載體材料的選擇或處理。目前典型的載體材料有天然高分子材料、合成高分子材料、無機(jī)材料等。其中，基于天然生物質(zhì)材料的固定化酶載體由于具備無毒性，傳質(zhì)性能好、原料易得，價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注。而纖維素作為世界上產(chǎn)量最大的生物質(zhì)材料，用作固定化酶載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。近年出現(xiàn)了將纖維素的羥基改造為醛基制備雙醛纖維素，籍此直接與蛋白質(zhì)的氨基產(chǎn)生共價(jià)鍵交聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)酶的固定化的方法。這種方法避免了傳統(tǒng)方法中添加醛類，如甲醛與戊二醛等易造成污染的弊端。
但纖維素作為一種天然高分子材料，用作固定化酶載體依然存在一些不足，主要體現(xiàn)在以下兩方面：①親水性過強(qiáng)，使用時(shí)易吸附其它雜質(zhì)而受到污染；②有機(jī)物的剛性不強(qiáng)，耐用性有待改善。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為此，需要提供一種固化酶載體制備方法，該方法所制備的纖維素-SiO2復(fù)合載體具有疏水性，不易吸附污染物，同時(shí)本身具有剛性，耐用性，可應(yīng)用于各種酶的固定。
本發(fā)明提供一種用于固定酶的纖維素-SiO2復(fù)合載體的制備方法，包括以下步驟：
S1：將雙醛纖維素-SiO2粉末加入離子溶液，攪拌至粉末完全溶解后將溶液進(jìn)行離心脫泡，制成第一混合溶液；
S2：將所述第一混合溶液冷卻至溫度為20～40℃,冷卻時(shí)間為60～120分鐘，制成第二混合溶液；
S3：將S2步驟制備的第二混合溶液制成厚度0.2～1.0mm的液膜或直徑0.4～1.2mm的微球；
S4：將S3步驟制得的液膜或微球，置于體積百分比濃度為15％的乙醇-水溶液中凝固；
S5：去離子水清洗S4步驟中凝固成型的液膜或微球。
進(jìn)一步地，所述S1步驟中，所述離子溶液為1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽或1-乙基-3-甲基咪唑溴鹽中的任一種。
進(jìn)一步地，所述S1步驟中，所述雙醛纖維素-SiO2粉末與離子液體的重量比為1:10～30。
進(jìn)一步地，所述S1步驟中，控制溶液溫度保持在60～120℃，攪拌時(shí)間控制在2～6小時(shí)，離心脫泡時(shí)間為10分鐘，離心速度為8000～12000r/min。
進(jìn)一步地，所述S4步驟中，體積百分比濃度為15％的乙醇-水溶液每隔30分鐘更換1次，更換總次數(shù)為2～5次。
進(jìn)一步地，步驟S1中的雙醛纖維素-SiO2粉末通過以下方法制備而得：
A1：在乙醇-水溶液中依次投入雙醛纖維素和SiO2-NH2，混合均勻，得到第三混合溶液；
A2：所述第三混合溶液攪拌并加熱至63～67℃，并在63～67℃下反應(yīng)17～19小時(shí),得到第一懸濁液；
A3：所述第一懸濁液進(jìn)行抽濾、洗滌、真空干燥、研磨，得到所述雙醛纖維素-SiO2粉末。
進(jìn)一步地，步驟A1中雙醛纖維素和SiO2-NH2的重量比是20.0～60.0；
進(jìn)一步地，步驟A1中的SiO2-NH2通過以下方法制備而得：
B1：正硅酸乙酯或正硅酸丁酯加入乙醇水溶液，混合均勻,得到第四混合溶液；
B2：所述第四混合溶液加入冰乙酸后升溫至70～80℃，反應(yīng)10～20分鐘,得到第五混合溶液；
B3：所述第五混合溶液逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出現(xiàn)凝膠；
B4：將B3步驟制備的凝膠真空干燥，得到SiO2-NH2。
進(jìn)一步地，步驟A1中的雙醛纖維素通過以下方法制備而得：
C1：微晶纖維素或漿粕加入鹽酸溶液中，攪拌均勻，反應(yīng)12小時(shí)后離心取沉淀物質(zhì)；
C2：將C1步驟制備的沉淀物質(zhì)用去離子水洗滌、浸泡,得到第二懸濁液；
C3：所述第二懸濁液中加入高碘酸鈉，直至沉淀物質(zhì)分散均勻，得到第三懸濁液，過程中控制懸濁液pH值保持在3～5，溫度保持在35～50℃，本步驟在避光條件下進(jìn)行。
C4：所述第三懸濁液中加入叔丁醇，離心分離得到所述雙醛纖維素。
同時(shí)，發(fā)明人提供了一種纖維素-SiO2復(fù)合載體在固定酶方面的應(yīng)用。纖維素-SiO2復(fù)合載體中，雙醛纖維素為固定酶載體的主體，側(cè)鏈帶有大量醛基，可與酶蛋白產(chǎn)生交聯(lián)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，起到穩(wěn)定的固定酶的作用；而SiO2粒子，可同時(shí)起到兩方面作用：一方面，SiO2粒子對(duì)纖維素進(jìn)行無機(jī)雜化，可使載體帶有部分無機(jī)材料的性質(zhì)，有效改善纖維素材料的耐候性、耐用性與穩(wěn)定性；另一方面，SiO2粒子具有一定的疏水性，可避免載體使用時(shí)吸附污染物，即具有一定的自清潔效果。
復(fù)合載體用于固化酶后，可保留游離酶大部分的酶活，相比其他固化酶載體物質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，固化在復(fù)合載體上的酶可以進(jìn)行回收和反復(fù)使用，并實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。固化在該載體上的酶對(duì)溫度的敏感性相比游離酶大大下降，具有穩(wěn)定不易失活的特性。
區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)，上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所提供的纖維素-SiO2復(fù)合載體，引入SiO2-NH2，使之與雙醛纖維素的部分醛基發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，使無機(jī)物SiO2與有機(jī)物纖維素雜化，可同時(shí)起到增強(qiáng)纖維素凝膠載體機(jī)械強(qiáng)度與疏水性的作用。纖維素-SiO2復(fù)合載體疏水性的改善，可避免固定酶載體使用時(shí)吸附污染物，具有一定的自清潔效果。同時(shí)復(fù)合載體用于固化酶后，可保留游離酶大部分的酶活，固化在復(fù)合載體上的酶可以進(jìn)行回收和反復(fù)使用，對(duì)溫度的敏感性相比游離酶大大下降，具有穩(wěn)定不易失活的特性。
具體實(shí)施方式
本實(shí)施方式中所述微晶纖維素是一種純化的、部分解聚的纖維素，白色、無臭、無味，由多孔微粒組成的結(jié)晶粉末，其主要成分為以β-1,4-葡萄糖苷鍵結(jié)合的直鏈?zhǔn)蕉嗵穷愇镔|(zhì)。
本實(shí)施方式中所述漿粕為青山紙業(yè)股份有限公司提供。漿粕中α-纖維素含量大于91％，動(dòng)力粘度為9.0mPa·S，白度大于85％ISO，鐵離子含量小于15mg/kg，聚戊糖含量小于3.0％，灰分含量小于0.15％，樹脂含量小于0.3％。
本實(shí)施方式中所述離子液體1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽、1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽和1-乙基-3-甲基咪唑溴鹽為中科院蘭州化學(xué)物理研究所提供。離子液體純度均大于98.5％，水分含量小于1.0％，咪唑與酸根離子含量小于0.5％。
實(shí)施例1一種纖維素-SiO2復(fù)合載體的制備方法
(1)稱取6g微晶纖維素溶于100mL濃度為5mol/L的鹽酸溶液中，攪拌，水解反應(yīng)12小時(shí)后離心后取沉淀。沉淀物質(zhì)用去離子水洗滌、浸泡，使沉淀懸浮于去離子水中；在攪拌下向溶液中加入高碘酸鈉，直至沉淀物質(zhì)分散均勻。反應(yīng)在避光環(huán)境中進(jìn)行，過程中溶液pH值保持為4，溫度為35℃。反應(yīng)后溶液中加入叔丁醇，離心分離得雙醛纖維素。
(2)將10mL四乙基硅氧烷加入50mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合均勻，再加入0.1mL冰乙酸，升溫至75℃，10分鐘后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出現(xiàn)凝膠。將凝膠真空干燥，得到SiO2-NH2。
(3)步驟(1)中所得雙醛纖維素取6g，步驟(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合，在75℃下反應(yīng)8小時(shí)，抽濾，洗滌，真空干燥，研磨，得到粉末狀的雙醛纖維素－SiO2。
(4)取1g步驟(3)中所得的粉末狀雙醛纖維素－SiO2溶解在20g的1-乙基-3-甲基咪唑醋酸鹽離子液體中，溶液過程液體溫度控制在60℃，并攪拌120分鐘，使粉末完全溶解，得到含有纖維素－SiO2的離子溶液，離子溶液用高速離心機(jī)在8000r/min轉(zhuǎn)速下離心脫泡10min后，在自來水中冷卻60分鐘至20℃，使溶液粘度增加。將冷卻后的溶液倒在刮膜機(jī)的刮膜面板上，啟動(dòng)刮刀，將溶液推平，從而制成厚度為0.2mm的液膜，將液膜置于體積百分比濃度為15％的乙醇-水溶液中進(jìn)行凝固，凝固期間換液2次，每次換液間隔為30分鐘。經(jīng)去離子水清洗后得到雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠薄膜。
實(shí)施例2葡萄糖氧化酶的固化試驗(yàn)。
實(shí)施例1所得的雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠薄膜進(jìn)行葡萄糖氧化酶的固化，固化步驟如下：配制濃度為1mg/mL的葡萄糖氧化酶-磷酸鹽溶液(pH＝6.5)，將雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠薄膜浸入溶液，置于搖床中33℃振蕩反應(yīng)4小時(shí)后，取出凝膠薄膜，用磷酸鹽緩沖液和去離子水各洗滌3次，得到固定化于載體上的葡萄糖氧化酶。
將該固化的葡萄糖氧化酶進(jìn)行系列測(cè)試，結(jié)果如下：固定化于載體上的固化葡萄糖氧化酶可保留游離葡萄糖氧化酶的活性達(dá)72.3％；重復(fù)使用5次后的葡萄糖氧化酶的酶活回收率為78.0％；在40℃的水浴下恒溫60分鐘后的葡萄糖氧化酶酶活相比在30℃的水浴下恒溫60分鐘后的葡萄糖氧化酶酶活僅下降6.1％，而游離葡萄糖氧化酶在同等條件下酶活下降達(dá)75.3％。
同時(shí)，該固化的葡萄糖氧化酶在磷酸鹽緩沖溶液中靜置15天未觀察到長菌現(xiàn)象。
實(shí)施例3一種纖維素-SiO2復(fù)合載體的制備方法
(1)稱取4g漿粕溶于100mL濃度為5mol/L的鹽酸溶液中，攪拌，水解反應(yīng)12小時(shí)后離心后取沉淀。沉淀物質(zhì)用去離子水洗滌、浸泡，使沉淀懸浮于去離子水中；在攪拌下向溶液中加入高碘酸鈉，直至沉淀物質(zhì)分散均勻。反應(yīng)在避光環(huán)境中進(jìn)行，過程中溶液pH值保持為3，溫度為50℃。反應(yīng)后溶液中加入叔丁醇，離心分離得雙醛纖維素。
(2)將20mL正硅酸丁酯加入60mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合均勻，再加入0.5mL冰乙酸，升溫至85℃，15分鐘后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出現(xiàn)凝膠。將凝膠真空干燥，得SiO2-NH2。
(3)步驟(1)中所得雙醛纖維素取4g，步驟(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合，在65℃下反應(yīng)24小時(shí)，抽濾，洗滌，真空干燥，研磨，得到粉末狀的雙醛纖維素－SiO2。
(4)取3g步驟(3)中所得的粉末狀雙醛纖維素－SiO2溶解在30g1-烯丙基-3-甲基咪唑氯鹽離子液體中，控溫在120℃，攪拌40分鐘使粉末完全溶解，得到含有雙醛纖維素－SiO2的離子溶液，趁熱用高速離心機(jī)在10000r/min轉(zhuǎn)速下離心脫泡10分鐘，在空氣中自然冷卻100分鐘至30℃，使溶液粘度增加。將溶液用直徑1.2毫米的擠出口擠出顆粒狀液滴，置于乙醇-水溶液(體積百分比為15％)中進(jìn)行凝固，凝固期間換液3次，每次間隔為30分鐘。經(jīng)去離子水清洗后得到雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠微球。
實(shí)施例4纖維素酶的固化試驗(yàn)。
實(shí)施例3所得的雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠薄膜進(jìn)行纖維素酶的固化，固化步驟如下：配制濃度為1.5mg/mL的纖維素酶-磷酸鹽溶液(pH＝7.2)，將雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠微球浸入溶液中，置于搖床中振蕩，于40℃下反應(yīng)6小時(shí)后取出凝膠微球，最后凝膠微球用磷酸鹽緩沖液和去離子水各洗滌3次，得到固定化于微球載體上的纖維素酶。
將該固化的纖維素酶進(jìn)行系列測(cè)試，結(jié)果如下：固定化于載體上的固化纖維素酶可保留游離纖維素酶的活性達(dá)81.5％；重復(fù)使用5次后纖維素酶的酶活回收率為76.7％；在70℃的水浴90分鐘后纖維素酶的酶活相比在60℃水浴90分鐘后纖維素酶的酶活，僅下降3.4％，而游離纖維素酶的酶活在同等條件下下降達(dá)36.9％。
同時(shí)，該固化的纖維素酶在磷酸鹽緩沖溶液中靜置15天未觀察到長菌現(xiàn)象。
實(shí)施例5一種纖維素-SiO2復(fù)合載體的制備方法
(1)稱取3g微晶纖維素溶于100mL濃度為5mol/L的鹽酸溶液中，均勻攪拌，水解反應(yīng)12小時(shí)后離心后取沉淀。沉淀物質(zhì)用去離子水洗滌、浸泡，使沉淀懸浮于去離子水中；在攪拌下向溶液中加入高碘酸鈉，直至沉淀物質(zhì)分散均勻。反應(yīng)在避光環(huán)境中進(jìn)行，過程中溶液pH值保持為5，溫度為45℃。反應(yīng)后溶液中加入叔丁醇，離心分離得雙醛纖維素。
(2)將15mL正硅酸丁酯加入40mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合均勻，再加入0.3mL冰乙酸，升溫至80℃，20分鐘后，逐滴加入N-氨乙基-γ-氨丙基三甲氧基硅烷，直至出現(xiàn)凝膠。將凝膠真空干燥，得SiO2-NH2。
(3)步驟(1)中所得雙醛纖維素取2g，步驟(2)中所得SiO2-NH2取0.1g，加入50mL乙醇-水溶液(體積百分比為50％)中，混合，在70℃下反應(yīng)16小時(shí)，抽濾，洗滌，真空干燥，研磨，得到粉末狀的雙醛纖維素－SiO2。
(4)取1g步驟(3)中所得的粉末狀雙醛纖維素－SiO2溶解在30g 1-乙基-3-甲基咪唑溴鹽離子液體中，控溫在90℃，攪拌80分鐘使粉末完全溶解，得到含有雙醛纖維素－SiO2的離子溶液，趁熱將溶液用高速離心機(jī)在12000r/min轉(zhuǎn)速下離心脫泡10min后，將溶液在空氣中自然冷卻60分鐘至40℃，使溶液粘度增加。將溶液用直徑0.4毫米的擠出口擠出顆粒狀液滴，置于乙醇-水溶液(體積百分比為15％)中進(jìn)行凝固，凝固期間換液5次，每次間隔為30分鐘。經(jīng)去離子水清洗后得到雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠微球。
實(shí)施例6β-半乳糖苷酶的固化試驗(yàn)。
實(shí)施例5所得的雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠薄膜進(jìn)行纖維素酶的固化，固化步驟如下：配制濃度為2.5mg/mL的β-半乳糖苷酶-磷酸鹽溶液(pH＝7)，將雙醛纖維素－SiO2復(fù)合凝膠微球浸入溶液中，置于搖床中振蕩，于20℃下反應(yīng)3小時(shí)，用磷酸鹽緩沖液和去離子水各洗滌3次，得到固定化于微球載體上的β-半乳糖苷酶。
將該固化的β-半乳糖苷酶進(jìn)行系列測(cè)試，結(jié)果如下：固定化于載體上的β-半乳糖苷酶可保留游離β-半乳糖苷酶的活性達(dá)74.8％；重復(fù)使用5次后β-半乳糖苷酶的酶活回收率為71.2％；在45℃的水浴60分鐘后β-半乳糖苷酶的酶活相比在30℃水浴60分鐘后β-半乳糖苷酶的酶活下降12.5％，而游離β-半乳糖苷酶在同等條件下酶活下降達(dá)42.9％。
同時(shí)，固定化于載體上的β-半乳糖苷酶在磷酸鹽緩沖溶液中靜置15天未觀察到長菌現(xiàn)象。
通過以上試驗(yàn)，表明本發(fā)明產(chǎn)品一種用于固定酶的纖維素-SiO2復(fù)合載體在固化酶后，可保留游離酶70％以上的酶活，相比其他固化酶載體物質(zhì)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，固化在本復(fù)合載體上的酶在重復(fù)使用5次后的酶活依然有使用前70％以上，證明固化在本復(fù)合載體上的酶可以進(jìn)行回收和反復(fù)使用，并實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。而實(shí)施例中水浴試驗(yàn)說明固化在該載體上的酶對(duì)溫度的敏感性相比游離酶大大下降，固化在該載體上的酶具有穩(wěn)定不易失活的特性。最后，固化于該載體上的酶在磷酸鹽緩沖溶液中靜置15天未觀察到長菌現(xiàn)象，說明該載體具有一定的自清潔效果。
需要說明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語僅僅用來將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者終端設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者終端設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者終端設(shè)備中還存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超過”等理解為不包括本數(shù)；“以上”、“以下”、“以內(nèi)”等理解為包括本數(shù)。
盡管已經(jīng)對(duì)上述各實(shí)施例進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例做出另外的變更和修改，所以以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利保護(hù)范圍，凡是利用本發(fā)明說明書所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍之內(nèi)。