本發(fā)明屬于微生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種快速色譜制備非達(dá)霉素的方法。

背景技術(shù)：

艱難梭菌是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧芽孢桿菌，廣泛分布于自然環(huán)境及動(dòng)物和人的糞便中。其過(guò)度生長(zhǎng)并釋放毒素時(shí)，可引起艱難梭菌感染(CDI)，導(dǎo)致結(jié)腸炎癥、嚴(yán)重腹瀉甚至死亡。

非達(dá)霉素(fidaxomicin)是Optimer制藥公司研發(fā)的一種新型窄譜的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，于2011年5月獲得FDA批準(zhǔn)在美國(guó)上市，成為30年來(lái)首個(gè)主要用于治療艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(CDAD)的抗生素。非達(dá)霉素通過(guò)抑制艱難梭菌的RNA聚合酶，阻斷核糖核酸合成而殺菌。與傳統(tǒng)藥物萬(wàn)古霉素相比，它可顯著降低艱難梭菌感染的復(fù)發(fā)率并提高整體治愈率。非達(dá)霉素的結(jié)構(gòu)如下：

現(xiàn)有技術(shù)中，從發(fā)酵液中提取純化非達(dá)霉素的方法有：

中國(guó)專利CN104846043A公開(kāi)了一種從發(fā)酵液中分離和純化非達(dá)霉素的工藝；該工藝采用極性有機(jī)溶劑浸提菌絲體；浸提液通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱并解吸；解吸液用有機(jī)溶劑萃取，再經(jīng)過(guò)正相柱層析，得到非達(dá)霉素粗品；該粗品經(jīng)高壓液相色譜設(shè)備，以有機(jī)溶劑/酸水洗脫，收集高純度非達(dá)霉素流出液；洗脫液再經(jīng)聚苯乙烯微球樹(shù)脂柱層析；洗脫液萃取、濃縮、干燥，得到白色粉末狀非達(dá)霉素純品，純度96％～97％，收率約73％。該工藝步驟繁瑣，而且使用了高壓液相設(shè)備，僅適合于實(shí)驗(yàn)室操作。

中國(guó)專利CN104418925A公開(kāi)了一種制備高純度非達(dá)霉素的方法；該方法將從非達(dá)霉素發(fā)酵液中分離出的菌絲體用極性有機(jī)溶劑浸提；浸提液加水稀釋后導(dǎo)入大孔吸附樹(shù)脂SP825L吸附，然后對(duì)樹(shù)脂柱進(jìn)行凈化和解吸，得到非達(dá)霉素的粗品解吸液Ⅰ，濃縮、結(jié)晶后得非達(dá)霉素粗品；非達(dá)霉素粗品用乙腈的水溶液溶解后，導(dǎo)入U(xiǎn)niPS40樹(shù)脂柱，經(jīng)洗脫得到非達(dá)霉素洗脫液Ⅱ，蒸除溶解得到固體，再用極性有機(jī)溶劑重結(jié)晶，得到非達(dá)霉素產(chǎn)品。該方法收率50％～60％，純度98.5％以上，但需一次或多次結(jié)晶，操作較為繁瑣。

中國(guó)專利CN104098637A公開(kāi)了一種非達(dá)霉素的純化方法；該方法將非達(dá)霉素發(fā)酵液進(jìn)行固液分離得到菌絲體，接著用有機(jī)溶劑浸泡菌絲體得到含非達(dá)霉素的溶液；將該溶液進(jìn)行納濾濃縮；濃縮液通過(guò)裝有C8填料的DAC200制備柱層析，并用含有有機(jī)溶劑的酸水溶液進(jìn)行洗脫，收集、合并含非達(dá)霉素的餾分，加水逼出非達(dá)霉素，過(guò)濾、干燥得到非達(dá)霉素干粉，且收率達(dá)到50％以上、純度達(dá)到99.5％以上。該法操作簡(jiǎn)單、獲得非達(dá)霉素純度及收率高，但是由于采用了動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(DAC)技術(shù)，對(duì)設(shè)備和填料規(guī)格要求較高，成本投入較大。

因此，從發(fā)酵液中提取純化非達(dá)霉素的方法仍需進(jìn)行優(yōu)化改進(jìn)，以期得到一種具有如下優(yōu)點(diǎn)的方法：純度和收率高，同時(shí)操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本投入較低，且適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種快速色譜制備非達(dá)霉素的方法，不僅所得非達(dá)霉素的純度與收率高，而且操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，并適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問(wèn)題的：一種快速色譜制備非達(dá)霉素的方法，包括如下具體操作步驟：

(1)、將非達(dá)霉素發(fā)酵液進(jìn)行固液分離得到菌絲體，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌絲體并離心，得到非達(dá)霉素浸提液，待用；

(2)、將步驟(1)所得的非達(dá)霉素浸提液用水稀釋至乙醇濃度為10％～40％，之后導(dǎo)入聚苯乙烯樹(shù)脂柱內(nèi)進(jìn)行吸附，然后采用乙醇進(jìn)行梯度解吸，收集非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液；

(3)、將步驟(2)所收集的解吸液合并，并加水稀釋至乙醇濃度為45％～55％，接著導(dǎo)入反相硅膠層析柱中，采用甲醇-水-乙酸進(jìn)行梯度洗脫，收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液；

(4)、將步驟(3)所收集到的洗脫液合并，并采用水稀釋至甲醇濃度為55％～65％，再次導(dǎo)入反相硅膠層析柱中，采用乙腈-水-乙酸進(jìn)行梯度洗脫，收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液并進(jìn)行合并，進(jìn)行濃縮、干燥后得到高純度的非達(dá)霉素成品。

進(jìn)一步地，所述步驟(1)中，60％～80％乙醇的加入量為每千克濕的菌絲體中加入1～8升；浸提溫度為10～50℃；浸提時(shí)間為2～8h。

進(jìn)一步地，所述步驟(2)中，聚苯乙烯樹(shù)脂柱為DIAION HP-20聚苯乙烯樹(shù)脂柱、納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱、D101聚苯乙烯樹(shù)脂柱、HPD-400聚苯乙烯樹(shù)脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹(shù)脂柱或HZ816聚苯乙烯樹(shù)脂柱中的任一種。

進(jìn)一步地，所述步驟(3)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm。

進(jìn)一步地，所述步驟(4)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm。

本發(fā)明的有益效果在于：

提供一種快速色譜制備非達(dá)霉素的方法，不僅能夠快速便捷的獲得非達(dá)霉素，而且所獲得的非達(dá)霉素的純度與收率均高，此外，整個(gè)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，能夠適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

【附圖說(shuō)明】

下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1-3中浸提液的HPLC色譜圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中解吸液的HPLC色譜圖。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中所收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中所收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中解吸液的HPLC色譜圖。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例2中所收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例2中所收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例3中解吸液的HPLC色譜圖。

圖9是本發(fā)明實(shí)施例3中所收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

圖10是本發(fā)明實(shí)施例3中所收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液的HPLC色譜圖。

【具體實(shí)施方式】

本發(fā)明一種快速色譜制備非達(dá)霉素的方法，包括如下具體操作步驟：

(1)、將非達(dá)霉素發(fā)酵液進(jìn)行固液分離得到菌絲體，然后加入60％～80％乙醇浸泡菌絲體并離心，得到非達(dá)霉素浸提液，待用；

(2)、將步驟(1)所得的非達(dá)霉素浸提液用水稀釋至乙醇濃度為10％～40％，之后導(dǎo)入聚苯乙烯樹(shù)脂柱內(nèi)進(jìn)行吸附，然后采用乙醇進(jìn)行梯度解吸，收集非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液；

(3)、將步驟(2)所收集的解吸液合并，并加水稀釋至乙醇濃度為45％～55％，接著導(dǎo)入反相硅膠層析柱中，采用甲醇-水-乙酸進(jìn)行梯度洗脫，收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液；

(4)、將步驟(3)所收集到的洗脫液合并，并采用水稀釋至甲醇濃度為55％～65％，再次導(dǎo)入反相硅膠層析柱中，采用乙腈-水-乙酸進(jìn)行梯度洗脫，收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液并進(jìn)行合并，進(jìn)行濃縮、干燥后得到高純度的非達(dá)霉素成品。

其中，步驟(1)中，60％～80％乙醇的加入量為每千克濕的菌絲體中加入1～8升；浸提溫度為10～50℃；浸提時(shí)間為2～8h。步驟(2)中，聚苯乙烯樹(shù)脂柱為DIAION HP-20聚苯乙烯樹(shù)脂柱、納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱、D101聚苯乙烯樹(shù)脂柱、HPD-400聚苯乙烯樹(shù)脂柱、AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹(shù)脂柱或HZ816聚苯乙烯樹(shù)脂柱中的任一種；可以優(yōu)選納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱或HZ816聚苯乙烯樹(shù)脂柱。步驟(3)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm；可以優(yōu)選C18烷基硅膠鍵合相(粒徑為50μm)。步驟(4)中，反相硅膠層析柱的填料選用C4、C8或C18烷基硅膠鍵合相中的任一種，且粒徑為50μm；可以優(yōu)選C18烷基硅膠鍵合相(粒徑為50μm)。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明中甲醇濃度、乙醇濃度的百分?jǐn)?shù)在無(wú)特殊說(shuō)明的情況下均為體積百分?jǐn)?shù)。

另外，本發(fā)明中所提及的非達(dá)霉素發(fā)酵液的發(fā)酵培養(yǎng)所用游動(dòng)放線菌為Actinoplanes deccanensis ATCC21983，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)；DIAION HP-20聚苯乙烯樹(shù)脂購(gòu)自三菱化學(xué)株式會(huì)社；納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂、D101聚苯乙烯樹(shù)脂、HPD-400聚苯乙烯樹(shù)脂購(gòu)自蘇州納微生物科技有限公司；AmberliteXAD-8聚苯乙烯樹(shù)脂購(gòu)自北京慧德易科技有限公司；HZ816聚苯乙烯樹(shù)脂購(gòu)自上海華震科技有限公司；購(gòu)買而來(lái)的聚苯乙烯樹(shù)脂在應(yīng)用時(shí)填入相應(yīng)的柱體內(nèi)形成相應(yīng)的聚苯乙烯樹(shù)脂柱；反相硅膠層析柱的填料是購(gòu)自YMC公司；甲醇、乙醇、乙腈等試劑均為市售；水為蒸餾水；高效液相色譜儀為島津LC-20A。

非達(dá)霉素檢測(cè)采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱為月旭Ultimate XB-C18(ID4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇：0.1％甲酸水溶液(73:27)，流速1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)266nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫40℃；非達(dá)霉素的保留時(shí)間在不同檢測(cè)批次間略有波動(dòng)，范圍在17～18min。

本發(fā)明中非達(dá)霉素發(fā)酵液的具體制備過(guò)程如下：

a、斜面菌落的制備與培養(yǎng)：將游動(dòng)放線菌菌體接至斜面培養(yǎng)基上，并于30℃下培養(yǎng)10天；斜面培養(yǎng)基為采用ISP培養(yǎng)基，其配方為：酵母提取物4g/L，麥芽提取物10g/L，葡萄糖4g/L，瓊脂20g/L，pH7.2；

b、種子培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng):采用鉑環(huán)將斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)所得的單菌落移入種子培養(yǎng)基中，并在培養(yǎng)溫度30℃下，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h，獲得非達(dá)霉素發(fā)酵的一級(jí)種子液；

種子培養(yǎng)基配方:可溶性淀粉20g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，黃豆粉5g/L，硫酸銨0.5g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L，碳酸鈣2g/L，pH7.2，搖瓶裝液量為50mL/500mL。

c、發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng):以體積百分比為5％的接種量將步驟(b)所獲得的一級(jí)種子液移入發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)溫度28℃，240rpm搖床振蕩培養(yǎng)136h，則獲得本發(fā)明所需的非達(dá)霉素發(fā)酵液；

發(fā)酵培養(yǎng)基配方:可溶性淀粉4g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨3g/L，酵母提取物1g/L，黃豆粉20g/L，氯化鈉2.5g/L，硫酸銨0.25g/L，磷酸氫二鉀0.25g/L，七水合硫酸鎂0.25g/L，碳酸鈣5g/L，微鹽1mL，pH7.5。

為了能夠清楚的闡述本發(fā)明方法的具體過(guò)程，本申請(qǐng)人例舉了如下幾個(gè)具體實(shí)施例。

實(shí)施例1

取非達(dá)霉素發(fā)酵液10L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到2kg菌絲體(濕重)；在菌絲體中加入70％乙醇4L，室溫下，電動(dòng)攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時(shí)后離心，收集含非達(dá)霉素的浸提液(4.5L，含非達(dá)霉素1179mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為20％后導(dǎo)入納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱吸附內(nèi)進(jìn)行吸附，樹(shù)脂裝量為300mL，流速為2BV/h，樹(shù)脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進(jìn)行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖2所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為50％后導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長(zhǎng)38cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖3所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為58％后再次導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長(zhǎng)38cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝45：55：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液，該脫液的HPLC色譜圖如圖4所示；合并收集到的非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達(dá)霉素精粉390mg。經(jīng)測(cè)定本實(shí)施非達(dá)霉素的總收率為33.1％。

根據(jù)面積歸一化法計(jì)算了本實(shí)施例制備過(guò)程各步驟中非達(dá)霉素的HPLC純度：浸提液中非達(dá)霉素純度為33.7％；解吸液中非達(dá)霉素純度為55.5％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為92.9％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為98.8％。

實(shí)施例2

取非達(dá)霉素發(fā)酵液20L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到3.9kg菌絲體(濕重)；在菌絲體中加入60％乙醇8L，室溫下，電動(dòng)攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時(shí)后離心，收集含非達(dá)霉素的浸提液(9L，含非達(dá)霉素2358mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為40％后導(dǎo)入納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱吸附內(nèi)進(jìn)行吸附，樹(shù)脂裝量為500mL，流速為2BV/h，樹(shù)脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進(jìn)行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖5所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為45％后導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長(zhǎng)38cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為4BV、10BV，流速為10mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖6所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為55％后再次導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑3cm，柱長(zhǎng)38cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為3BV、10BV，流速為12mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液，該脫液的HPLC色譜圖如圖7所示；合并收集到的非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達(dá)霉素精粉806mg；經(jīng)測(cè)定本實(shí)施非達(dá)霉素的總收率為34.2％。

根據(jù)面積歸一化法計(jì)算了本實(shí)施例制備過(guò)程各步驟中非達(dá)霉素的HPLC純度：浸提液中非達(dá)霉素純度為33.7％；解吸液中非達(dá)霉素純度為58.8％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為92.7％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為99.1％。

實(shí)施例3

取非達(dá)霉素發(fā)酵液30L，將發(fā)酵液以4500rpm離心10分鐘，得到5.9kg菌絲體(濕重)；在上述菌絲體中加入80％乙醇12L，室溫下，電動(dòng)攪拌器攪拌(350rpm)浸提4小時(shí)后離心，收集含非達(dá)霉素的浸提液(13.6L，含非達(dá)霉素3531mg)，且浸提液的HPLC色譜圖如圖1所示；將浸提液加水稀釋至乙醇濃度為10％后導(dǎo)入納微NM-200聚苯乙烯樹(shù)脂柱吸附，樹(shù)脂裝量為500mL，流速為2BV/h，樹(shù)脂柱依次用濃度40％、50％、60％的乙醇溶液進(jìn)行梯度解吸，流速為2BV/h，分段收集收集非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液，解吸液的HPLC色譜圖如圖8所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量45％以上的解吸液合并，加水稀釋至乙醇濃度為55％后導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑4.6cm，柱長(zhǎng)40cm)，然后依次用甲醇：水：乙酸＝50：50：0.1(V/V/V)、甲醇：水：乙酸＝70：30：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為2BV、10BV，流速為25mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖9所示。

將收集到的非達(dá)霉素含量85％以上的洗脫液合并，加水稀釋至甲醇濃度為65％后再次導(dǎo)入YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱(柱直徑4.6cm，柱長(zhǎng)40cm)，然后依次用乙腈：水：乙酸＝30：70：0.1(V/V/V)、乙腈：水：乙酸＝45：55：0.1(V/V/V)進(jìn)行梯度洗脫，洗脫體積分別為2BV、10BV，流速為25mL/min，分段收集非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液，該洗脫液的HPLC色譜圖如圖10所示；合并收集到的非達(dá)霉素含量98.5％以上的洗脫液并將其濃縮、干燥得到非達(dá)霉素精粉1144mg；經(jīng)測(cè)定本實(shí)施非達(dá)霉素的總收率為32.4％。

根據(jù)面積歸一化法計(jì)算了本實(shí)施例制備過(guò)程各步驟中非達(dá)霉素的HPLC純度：浸提液中非達(dá)霉素純度為33.7％；解吸液中非達(dá)霉素純度為55.1％，YMC·GEL ODS-A-HG反相硅膠層析柱的甲醇/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為88.5％，YMC·GEL ODS-A-HG層析柱的乙腈/水/乙酸洗脫液中非達(dá)霉素純度為98.9％。

綜上，本發(fā)明方法，不僅能夠快速便捷的獲得非達(dá)霉素，而且所獲得的非達(dá)霉素的純度與收率均高，此外，整個(gè)方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本較低，能夠適用于工業(yè)化生產(chǎn)。