本發(fā)明涉及一種BHK21懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)方法，特別涉及一種BHK21懸浮細(xì)胞高密度流加培養(yǎng)方法、用于該方法的流加培養(yǎng)液以及該方法在口蹄疫病毒增殖中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：口蹄疫(Foot-and-MouthDisease，F(xiàn)MD)是致偶蹄動(dòng)物感染的一種急性、高度接觸性、發(fā)熱性傳染病，以傳播迅速、感染率高而著稱，國(guó)際獸疫局(OIE)將其列為A類傳染病之首。多年來，口蹄疫作為重大動(dòng)物疫病不僅嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的健康發(fā)展，而且會(huì)引起人們對(duì)食品安全擔(dān)憂等一系列社會(huì)問題。目前的防控手段主要是采取撲殺感染動(dòng)物和免疫接種健康易感動(dòng)物達(dá)到凈化的目的。隨著生物生產(chǎn)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)疫苗產(chǎn)品品質(zhì)提出了更高的要求。因此開發(fā)和優(yōu)化BHK-21細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，研究維持細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，是口蹄疫疫苗生產(chǎn)的必然趨勢(shì)。本發(fā)明根據(jù)BHK-21細(xì)胞基礎(chǔ)代謝流水平，在前期研究得到的一種用于BHK-21細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基(命名為ZN-MEM，申請(qǐng)?zhí)枮?01510980603.7)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了營(yíng)養(yǎng)物均衡供給的流加培養(yǎng)基，并調(diào)整了ZN-MEM中葡萄糖以及谷氨酰胺的含量，采用調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)基進(jìn)行流加培養(yǎng)，設(shè)計(jì)不同的流加策略，確定適宜于口蹄疫病毒生產(chǎn)的BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)關(guān)鍵過程控制工藝參數(shù)，使得培養(yǎng)細(xì)胞在維持高活率的條件下，終密度提高近2倍左右，細(xì)胞代謝副產(chǎn)物濃度降低30％，增殖的口蹄疫病毒抗原含量提高達(dá)80％左右，提高了口蹄疫病毒的生產(chǎn)效率，為口蹄疫疫苗高效大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供一種成分較為明確、培養(yǎng)效果顯著的適用于BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)的個(gè)性化濃縮培養(yǎng)液；本發(fā)明的目的之二是提供一種BHK21懸浮細(xì)胞高密度流加培養(yǎng)方法；本發(fā)明的目的之三是提供所述流加培養(yǎng)方法在口蹄疫病毒增殖中的應(yīng)用。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：本發(fā)明的一種適用于BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)的濃縮培養(yǎng)液，由以下含量的各原料物質(zhì)組成：在本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液中，優(yōu)選的，由以下含量的各原料物質(zhì)組成：進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了所述的濃縮培養(yǎng)液在BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了一種BHK-21懸浮細(xì)胞高密度流加培養(yǎng)方法，該方法利用生物反應(yīng)器進(jìn)行流加培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，補(bǔ)加本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，收獲細(xì)胞；其中，所述的調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括氨基酸部分，平衡鹽部分，維生素部分、其他添加物、血清以及蒸餾水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加濃度為1％(v/v)，其他各原料物質(zhì)在培養(yǎng)基中的終濃度為：①氨基酸部分，包括：②平衡鹽部分，包括：③維生素部分，包括：④其它添加物，包括：優(yōu)選的，其他各原料物質(zhì)在培養(yǎng)基中的終濃度為：①氨基酸部分，包括：②平衡鹽部分，包括：③維生素部分，包括：④其它添加物，包括：在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，以初始接種密度0.4～0.5×106個(gè)/ml向調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種復(fù)蘇后的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)參數(shù)：溫度為36.5～37.0℃，pH值為6.8～7.0，DO值為60.0％～80.0％，攪拌轉(zhuǎn)速為100～120r/min；在細(xì)胞培養(yǎng)至24-36h，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到1.5×106個(gè)/ml以上時(shí)，開始補(bǔ)加本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液，補(bǔ)加體積為原培養(yǎng)基體積的3％；培養(yǎng)至48h-60h，再補(bǔ)加原培養(yǎng)基體積2％的本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液；培養(yǎng)至72h，收獲細(xì)胞；優(yōu)選的，在細(xì)胞培養(yǎng)至24h，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到1.5×106個(gè)/ml以上時(shí)，開始補(bǔ)加本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液，補(bǔ)加體積為原培養(yǎng)基體積的3％；培養(yǎng)至48h，再補(bǔ)加原培養(yǎng)基體積2％的本發(fā)明所述的濃縮培養(yǎng)液；培養(yǎng)至72h，收獲細(xì)胞。在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，補(bǔ)加培養(yǎng)液后的培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37.0～37.5℃、pH值為6.95～7.20、DO值為50.0％～80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為60～100r/min、滲透壓值為260～320mOsm/L，更優(yōu)選的，培養(yǎng)參數(shù)為：溫度37.0、pH值為6.95、DO值為80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min、滲透壓值為320mOsm/L。再進(jìn)一步的，本發(fā)明還提出了按照本發(fā)明所述的方法制備得到的BHK-21細(xì)胞及所述的BHK-21細(xì)胞在口蹄疫病毒增殖中的應(yīng)用，相對(duì)于普通BHK-21細(xì)胞，該BHK-21細(xì)胞對(duì)口蹄疫病毒的感染性增加。其中，優(yōu)選的，所述的病毒增殖包括向按照本發(fā)明所述的方法制備得到的BHK-21細(xì)胞接種病毒，設(shè)定控制參數(shù)為：溫度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值為50.0％～70.0％，攪拌轉(zhuǎn)速為50～70r/min，進(jìn)行病毒增殖培養(yǎng)。更優(yōu)選的，設(shè)定控制參數(shù)為：溫度37.0℃，pH值7.6、DO為50.0％、攪拌為70r/min，進(jìn)行病毒增殖培養(yǎng)。其中，優(yōu)選的，所述的口蹄疫病毒為FMD/O/MYA98/BY/2010、FMD/Re-AWH/09和FMD/Asia1JSL/06毒株。相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：1、采用本發(fā)明建立的流加培養(yǎng)方法培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞，細(xì)胞活率保持在96％以上，細(xì)胞密度可達(dá)6.0×106個(gè)/ml，較普通批式培養(yǎng)提高近2倍；2、采用本發(fā)明建立的流加培養(yǎng)方法培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞，通過優(yōu)化生物反應(yīng)器設(shè)定參數(shù)，有效控制了細(xì)胞及環(huán)境因素的變化，確保了生產(chǎn)過程的一致性和穩(wěn)定性，確保細(xì)胞產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量在可控范圍內(nèi)，BHK-21細(xì)胞在流加培養(yǎng)過程中，乳酸濃度低于9.4mM，氨離子濃度小于4.5mM，有效地消除了底物和產(chǎn)物抑制、毒害作用，促進(jìn)了細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，提高了細(xì)胞的培養(yǎng)效能；3、采用本發(fā)明建立的流加培養(yǎng)方法獲得的BHK21細(xì)胞，對(duì)口蹄疫病毒的感染性增加，病毒的有效抗原含量得到顯著提升(提高80％左右)，從而實(shí)現(xiàn)了BHK21細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的目標(biāo)，達(dá)到了細(xì)胞培養(yǎng)過程的可控性和有效性，提高了口蹄疫病毒的生產(chǎn)效率，為高品質(zhì)疫苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益。附圖說明圖1為不同葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響；圖2為不同氨濃度對(duì)BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；圖3為乳酸濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響；圖4為BHK21細(xì)胞流加培養(yǎng)和批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線；圖5為應(yīng)用流加培養(yǎng)基代謝產(chǎn)物的積累；圖6為不同組別病毒滴度分析圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例一BHK21懸浮細(xì)胞基礎(chǔ)代謝水平的研究以及BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)流加培養(yǎng)基的建立1材料1.1BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞工作細(xì)胞庫，批號(hào)為BHK-21/W/S-201201。1.2培養(yǎng)基ZN-MEM培養(yǎng)基，按照申請(qǐng)?zhí)枮?01510980603.7，發(fā)明名稱為“一種用于BHK-21細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基及其在口蹄疫病毒增殖中的應(yīng)用”的專利申請(qǐng)的配方，調(diào)整葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為1.98g/L和0.47g/L，委托宜興賽爾公司加工。調(diào)整后的ZN-MEM培養(yǎng)基包括氨基酸部分，平衡鹽部分，維生素部分、其他添加物、血清以及蒸餾水，pH值7.0～7.2，其中，血清添加濃度為1％(v/v)，其他各原料物質(zhì)在培養(yǎng)基中的終濃度如下所示：①氨基酸部分，包括：②平衡鹽部分，包括：③維生素部分，包括：④其它添加物，包括：1.3血清新生牛血清，購(gòu)自合格供應(yīng)商，按照中農(nóng)威特生物科技股份有限公司新生牛血清內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后使用。1.4試劑與設(shè)備主要試劑：Labtech氨基酸色譜柱(5μm，250×4.6mmol)；20種氨基酸標(biāo)樣；乙腈(色譜純)；醋酸鈉(分析純)；醋酸(分析純)；三乙胺(TEA)；苯異硫氰酸酯(PITC)；葡萄糖及乳酸測(cè)定試劑盒(南京建成)等。主要儀器：細(xì)胞分析儀(德國(guó)INNOVATIS公司)；氨離子測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)；顯微鏡(日本Olympus)；LC600高效液相色譜儀(北京Labtech公司)。Uv1700紫外分光光度計(jì)(日本島津)，5L生物反應(yīng)器(美國(guó)NBS)，500L生物反應(yīng)器(中農(nóng)威特現(xiàn)有生物反應(yīng)器)。2BHK-21細(xì)胞代謝需求水平的確定通過細(xì)胞代謝流的研究，觀察BHK21細(xì)胞特有的反應(yīng)性變化，測(cè)知細(xì)胞與外界環(huán)境的關(guān)系，了解細(xì)胞生存條件，BHK21細(xì)胞對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的代謝情況，檢測(cè)BHK21細(xì)胞培養(yǎng)性能，為流加培養(yǎng)的研究奠定基礎(chǔ)。2.1BHK21細(xì)胞對(duì)氨基酸的代謝需求通過檢測(cè)BHK-21細(xì)胞在調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基批式培養(yǎng)過程中對(duì)谷氨酰胺等各種氨基酸的消耗量，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)情況，確定生產(chǎn)單位細(xì)胞量的各種氨基酸消耗率。氨基酸采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。2.2BHK-21細(xì)胞對(duì)葡萄糖的代謝需求收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度至0.4×106個(gè)/ml，分別接種于6個(gè)5L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)參數(shù)：溫度37℃、DO值為68％、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速120r/min。分別加入2.0mmol/L、4.0mmol/L、6.0mmol/L、8.0mmol/L、12.0mmol/L、24.0mmol/L的葡萄糖濃縮液，培養(yǎng)參數(shù)均自動(dòng)控制，每12h取樣，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞密度與活率，分析葡萄糖的消耗情況。葡萄糖濃度采用葡萄糖氧化酶法試劑盒測(cè)定。2.3代謝副產(chǎn)物氨對(duì)BHK-21細(xì)胞增殖的影響收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度至0.4×106個(gè)/ml，分別接種至6個(gè)5L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)參數(shù)：溫度37℃、DO值為68％、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速120r/min。分別加入0.0mmol/L、1.8mmol/L、2.5mmol/L、4.0mmol/L、6.5mmol/L、10.5mmol/L的氨濃縮液，培養(yǎng)參數(shù)均自動(dòng)控制，每12h取樣，分析氨離子濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響，確定了BHK21細(xì)胞對(duì)氨離子最大耐受濃度為6.5mmol/L。氨濃度采用氨離子測(cè)定儀測(cè)定。2.4代謝副產(chǎn)物乳酸對(duì)BHK-21細(xì)胞增殖的影響收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整密度至0.4×106個(gè)/ml，分別接種至6個(gè)5L生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)參數(shù)：溫度37℃、DO值為68％、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速120r/min。分別加入2.0mmol/L、5.6mmol/L、9.4mmol/L、25.5mmol/L、45mmol/L和70mmol/L的乳酸濃縮液，培養(yǎng)參數(shù)均自動(dòng)控制，每12h取樣一次，分析乳酸濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響,確定了BHK21細(xì)胞對(duì)乳酸最大耐受濃度為25.5mmol/L。乳酸濃度采用乳酸脫氫酶法測(cè)定試劑盒測(cè)定。3結(jié)果3.1BHK-21細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)代謝流分析3.1.1氨基酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如下表1和表2所示：表1BHK21批式培養(yǎng)過程中各種氨基酸的消耗情況(mM)AA/cell(*10-6)12h24h36h48h60h天冬氨酸0.0620810.0552960.0134650.0186580.040111谷氨酸0.3394780.216380.1015380.0903460.359461天冬酰胺0.0465680.0814410.0267580.0144040絲氨酸0.0544430.0919610.0085370.020020.057325谷氨酰胺1.9569114.2882731.0688160.2628780.061508甘氨酸0.2597330.3680040.1790140.0750810.080595組氨酸0.1441590.1040170.0277370.0206110.021832精氨酸0.3204330.3618770.063070.0447490.066662蘇氨酸0.6029890.611540.0832610.076770.191953丙氨酸0.4348430.5317350.3487010.4626180.846247脯氨酸0.0744960.0492530.0124060.0178510.036927絡(luò)氨酸0.4394220.1664050.0817840.0358070.069667纈氨酸0.6618890.4467440.1225380.1316650.209746蛋氨酸0.15590.14170.0315030.023420.026142胱氨酸0.1382120.2370220.0226440.0440370.181174異亮氨酸0.5601110.5122670.0602150.1594920.448084亮氨酸0.5896330.6584340.0552940.1843620.29804苯丙氨酸0.3371440.2533070.033990.0564450.111219色氨酸0.0751580.0639330.0056960.0096340.015861賴氨酸0.5151420.5116630.0401610.0685190.286571表2BHK21細(xì)胞對(duì)氨基酸的基礎(chǔ)代謝水平3.1.2不同葡萄糖濃度對(duì)BHK-21細(xì)胞增殖的影響不同葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響如圖1所示。由圖1可知，葡萄糖濃度低于6mmol/L時(shí)，細(xì)胞增殖明顯變緩，葡萄糖濃度在8mmol/L～12mmol/L時(shí)，細(xì)胞倍增數(shù)目最大且具有明顯的穩(wěn)定期，葡萄糖濃度達(dá)24mmol/L時(shí)，細(xì)胞沒有明顯的生長(zhǎng)周期，表現(xiàn)為持續(xù)的延遲期。可見BHK-21細(xì)胞在葡萄糖代謝過程中最適范圍在8mmol/L～12mmol/L。3.1.3代謝副產(chǎn)物氨和乳酸對(duì)BHK21細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響不同氨濃度對(duì)BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)的影響如圖2所示，不同乳酸濃度對(duì)細(xì)胞增殖的影響如圖3所示。由圖2和圖3可知，BHK21細(xì)胞對(duì)代謝副產(chǎn)物乳酸的最大耐受濃度為25.5mM，對(duì)氨離子的最大耐受濃度為6.5mM。4BHK-21細(xì)胞流加濃縮培養(yǎng)液配方的確定通過上述檢測(cè)BHK-21細(xì)胞對(duì)葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝需求量，應(yīng)用化學(xué)計(jì)量的方法確定生產(chǎn)單位細(xì)胞所需的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的比例，按營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗速率設(shè)計(jì)一種適合BHK-21細(xì)胞增殖的流加培養(yǎng)基濃縮液配方和流加策略。流加培養(yǎng)基濃縮液配方命名為L(zhǎng)P，包括蒸餾水、氨基酸、葡萄糖、維生素和其它添加物成份，各原料物質(zhì)的濃度為：優(yōu)選的，各原料物質(zhì)的終濃度為：實(shí)施例二BHK21懸浮細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝的優(yōu)化與建立1.材料1.1BHK-21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞工作細(xì)胞庫，批號(hào)為BHK-21/W/S-201201。1.2培養(yǎng)基調(diào)整后的ZN-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，同實(shí)施例一，委托宜興賽爾公司加工；流加濃縮培養(yǎng)液按照實(shí)施例一所述的優(yōu)選配方制備。1.3血清新生牛血清，購(gòu)自合格供應(yīng)商，按照中農(nóng)威特生物科技股份有限公司新生牛血清內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后使用。1.4試劑與設(shè)備主要試劑：Labtech氨基酸色譜柱(5μm，250×4.6mmol)；20種氨基酸標(biāo)樣；乙腈(色譜純)；醋酸鈉(分析純)；醋酸(分析純)；三乙胺(TEA)；苯異硫氰酸酯(PITC)；葡萄糖及乳酸測(cè)定試劑盒(南京建成)等。主要儀器：細(xì)胞分析儀(德國(guó)INNOVATIS公司)；氨離子測(cè)定儀(美國(guó)Thermo公司)；顯微鏡(日本Olympus)；LC600高效液相色譜儀(北京Labtech公司)。500L生物反應(yīng)器(美國(guó)NBS)，3000L生物反應(yīng)器(自主設(shè)計(jì)委托生物反應(yīng)器廠家生產(chǎn))，微泡通氣，自動(dòng)控制pH值、DO值、攪拌轉(zhuǎn)速、溫度等參數(shù)，安裝和使用按說明書進(jìn)行。2.方法2.1細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)從懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞工作細(xì)胞庫復(fù)蘇細(xì)胞一支，靜置培養(yǎng)于T100細(xì)胞方瓶?jī)?nèi)，傳2～3代，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，用胰蛋白酶消化，補(bǔ)加適量細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至1000ml三角瓶中(培養(yǎng)量約200ml)，37℃恒溫?fù)u床振蕩(120r/min)培養(yǎng)約48h，轉(zhuǎn)入3000ml三角瓶中，待細(xì)胞培養(yǎng)體積達(dá)到一定數(shù)量后，收集細(xì)胞，逐級(jí)放大，轉(zhuǎn)入5L生物反應(yīng)器培養(yǎng)。2.2BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝策略的優(yōu)化2.2.15L生物反應(yīng)器BHK21細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)利用5L生物反應(yīng)器進(jìn)行批式培養(yǎng)，所用培養(yǎng)基為調(diào)整后的ZN-MEM培養(yǎng)基；以初始接種密度0.5×106個(gè)/ml接種復(fù)蘇后的BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)參數(shù)：溫度37℃、DO值為68％、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速120r/min。作為試驗(yàn)組1。2.2.2流加培養(yǎng)策略的設(shè)計(jì)在5L生物反應(yīng)器進(jìn)行流加培養(yǎng)，在2.2.1所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，根據(jù)培養(yǎng)體積，在不同時(shí)間流加濃縮營(yíng)養(yǎng)液，分別作為試驗(yàn)組2-5，流加方式如下表3所示：表3BHK21細(xì)胞流加培養(yǎng)方案流加培養(yǎng)過程中，每隔24h無菌在線取樣，進(jìn)行細(xì)胞密度、活率和主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氨基酸、葡萄糖和維生素含量的測(cè)定，考察流加培養(yǎng)效果。2.3BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)生物反應(yīng)器關(guān)鍵參數(shù)的確定與優(yōu)化以調(diào)整后的ZN-MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按照試驗(yàn)組5的方法進(jìn)行流加培養(yǎng)，采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取溫度(T)、pH值、溶解氧(DO值)、攪拌速度(Agit)、滲透壓(mOsm)作為考察因素，以細(xì)胞密度和細(xì)胞活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以4.0×105個(gè)/ml為細(xì)胞接種密度，確定培養(yǎng)過程中關(guān)鍵參數(shù)控制對(duì)細(xì)胞增殖的影響。水平及正交實(shí)驗(yàn)方案見表4以及表5。表4工藝參數(shù)優(yōu)化水平及因素水平T(A)pH(B)DO(C)Agit(D)mOsm(E)136.06.805060320236.56.956080300337.07.1070100280437.57.2080120260表5L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)注：T1、T2、T3、T4分別為各因素同一水平的均值。2.4工藝放大試驗(yàn)取生長(zhǎng)良好的細(xì)胞種子，以5L生物反應(yīng)器確定的工藝最佳參數(shù)組合為標(biāo)準(zhǔn)，將細(xì)胞接種于500L和3000L生物反應(yīng)器中，對(duì)其細(xì)胞活率、密度及比生長(zhǎng)率等參數(shù)進(jìn)行分析，進(jìn)行放大效果驗(yàn)證。3.結(jié)果3.1BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝策略的優(yōu)化為了避免細(xì)胞培養(yǎng)過程中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)限制和有毒代謝產(chǎn)物的積累，有效增加細(xì)胞密度和提高產(chǎn)物濃度，我們根據(jù)BHK-21細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝流和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，結(jié)合細(xì)胞生長(zhǎng)速率、細(xì)胞產(chǎn)量等情況，進(jìn)行了流加策略的研究，流加方式如表3所示，不同流加培養(yǎng)方案對(duì)BHK21細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響如表6所示。表6不同流加培養(yǎng)方案對(duì)BHK21細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響由表6可知，不同試驗(yàn)組都表現(xiàn)出典型的細(xì)胞生長(zhǎng)周期，其中試驗(yàn)組5培養(yǎng)效果最優(yōu)，細(xì)胞經(jīng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)至72h，細(xì)胞在維持較高活率的條件下細(xì)胞密度達(dá)到了6.4×106cells/ml，較批式培養(yǎng)最大細(xì)胞密度提高近2倍。因此，在BHK21細(xì)胞的流加培養(yǎng)過程中，結(jié)合基礎(chǔ)培養(yǎng)基，我們選擇在培養(yǎng)24-36h，細(xì)胞密度1.5×106cells/ml以上，補(bǔ)加3％濃縮培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h-72h流加2％濃縮培養(yǎng)液，培養(yǎng)72h收獲細(xì)胞，為流加培養(yǎng)策略，最佳的，選擇在細(xì)胞培養(yǎng)至24h，細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到1.5×106個(gè)/ml以上時(shí)，開始補(bǔ)加濃縮培養(yǎng)液，補(bǔ)加體積為原培養(yǎng)基體積的3％；培養(yǎng)至48h，再補(bǔ)加原培養(yǎng)基體積2％的濃縮培養(yǎng)液；培養(yǎng)至72h，收獲細(xì)胞。3.2細(xì)胞培養(yǎng)過程中生物反應(yīng)器關(guān)鍵參數(shù)控制以調(diào)整后的MEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(其中葡萄糖和谷氨酰胺濃度分別為11mM和1.6mM)，按照試驗(yàn)組5的方法進(jìn)行流加培養(yǎng)，采用L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取溫度、pH值、DO值、攪拌轉(zhuǎn)速(Agit)、滲透壓(mOsm)作為考察因素，培養(yǎng)過程中，每隔24h無菌在線取樣，進(jìn)行細(xì)胞密度、活率和主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氨基酸、葡萄糖和維生素含量的測(cè)定。以細(xì)胞密度、活率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定培養(yǎng)過程中關(guān)鍵參數(shù)控制對(duì)細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果如表7所示。表7L16(45)正交試驗(yàn)結(jié)果分析注：T1、T2、T3、T4分別為各因素同一水平的均值。從表7結(jié)果可以看出，10號(hào)試驗(yàn)組細(xì)胞密度最大，即溫度、攪拌轉(zhuǎn)速在3水平、pH值在2水平、DO值在4水平、滲透壓在1水平時(shí)細(xì)胞增殖最快，各因子的最佳水平組合為A3B2C4D3E1，該組合可有效提高細(xì)胞的密度。但10、14、16組對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響差異不顯著。因此在大規(guī)模懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中，宜選擇如下工藝控制參數(shù)：溫度37.0～37.5℃、pH值為6.95～7.20、DO值為50.0％～80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為60～100r/min、滲透壓值為260～320mOsm/L，優(yōu)選的，工藝控制參數(shù)：溫度37.0、pH值為6.95、DO值為80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min、滲透壓值為320mOsm/L。3.2BHK21細(xì)胞流加培養(yǎng)和批式培養(yǎng)的比較應(yīng)用上述優(yōu)化的培養(yǎng)條件，在5L生物反應(yīng)器分別進(jìn)行流加培養(yǎng)和批式培養(yǎng)的比較。流加培養(yǎng)條件：溫度37.0℃、pH值為6.95、DO值為80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min，滲透壓值為320mOsm/L；批式培養(yǎng)條件：接種密度0.45×106個(gè)/ml，溫度37℃、DO值為68％、pH值為7.0、轉(zhuǎn)速120r/min。由于流加培養(yǎng)具有更加優(yōu)化的培養(yǎng)環(huán)境，細(xì)胞代謝旺盛，在保持高活率的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞密度可達(dá)6.0×106個(gè)/ml，較批式培養(yǎng)密度提高近2倍，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。BHK21細(xì)胞流加培養(yǎng)和批式培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線如圖4所示。3.3工藝放大及驗(yàn)證應(yīng)用上述優(yōu)化的流加培養(yǎng)基及流加培養(yǎng)工藝進(jìn)行500L和3000L規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用驗(yàn)證。3.3.1BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中細(xì)胞增殖狀態(tài)分析表8BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)情況將優(yōu)化的流加培養(yǎng)關(guān)鍵參數(shù)組合進(jìn)行500L和3000L不同規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的應(yīng)用驗(yàn)證，如表8所示，按本發(fā)明確定的工藝，細(xì)胞主要增殖時(shí)間在24～72h之間，培養(yǎng)過程中活率達(dá)到95％以上，在培養(yǎng)72h細(xì)胞密度達(dá)到最大值，倍增比率高達(dá)15倍，活率96％以上，可見建立的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)平臺(tái)能夠滿足規(guī)?；《旧a(chǎn)要求。3.3.2BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)過程中乳酸和氨濃度的變化應(yīng)用流加培養(yǎng)基代謝產(chǎn)物的積累如圖5所示，從圖5結(jié)果可以看出，乳酸濃度低于9.4mM，氨濃度小于4.5mM時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒有影響。由此可見，BHK-21細(xì)胞在流加批培養(yǎng)過程中，代謝副產(chǎn)物氨和乳酸的積累并未達(dá)到對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)的抑制濃度。4結(jié)論4.1以前期研究的基礎(chǔ)代謝水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，根據(jù)BHK-21細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝特性，設(shè)計(jì)了營(yíng)養(yǎng)物均衡供給的流加培養(yǎng)基，采用流加培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行流加培養(yǎng)，設(shè)計(jì)不同的流加策略，獲得了適宜于口蹄疫病毒生產(chǎn)的BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝參數(shù)，為口蹄疫疫苗高效大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。4.2進(jìn)行規(guī)?；骷优囵B(yǎng)，生物反應(yīng)器的過程控制參數(shù)對(duì)流加培養(yǎng)效果有著直接影響。本發(fā)明確定了流加工藝參數(shù)，即溫溫度37.0～37.5℃、pH值為6.95～7.20、DO值為50.0％～80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為60～100r/min、滲透壓值為260～320mOsm/L，優(yōu)選的，工藝控制參數(shù)：溫度37.0、pH值為6.95、DO值為80.0％、攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min、滲透壓值為320mOsm/L。通過控制細(xì)胞及環(huán)境因素的變化，可確保生產(chǎn)過程的一致性和穩(wěn)定性，確保細(xì)胞產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量在可控范圍內(nèi)，從而有效實(shí)施流加培養(yǎng)工藝。4.3應(yīng)用上述確定的流加培養(yǎng)工藝關(guān)鍵過程控制參數(shù)組合，通過3000L生物反應(yīng)器規(guī)模化流加培養(yǎng)的驗(yàn)證，使細(xì)胞在培養(yǎng)過程中處于能夠滿足其生長(zhǎng)代謝需要的營(yíng)養(yǎng)供給環(huán)境，提高了BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)的倍增數(shù)量，培養(yǎng)細(xì)胞終密度能達(dá)到6.5×106cells/ml，細(xì)胞活率可達(dá)94％以上，且避免了代謝副產(chǎn)物的積累。因此，本研究確定的用于口蹄疫病毒生產(chǎn)的BHK-21細(xì)胞流加培養(yǎng)工藝參數(shù)，能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求。實(shí)施例三FMDV規(guī)?；a(chǎn)過程中生物反應(yīng)器參數(shù)控制對(duì)病毒增殖的影響1材料1.1BHK-21細(xì)胞批號(hào)為BHK-21/W/S。1.2培養(yǎng)基MD611，購(gòu)自清大天一。1.3新生牛血清購(gòu)自合格供應(yīng)商，按照中農(nóng)威特生物科技股份有限公司新生牛血清內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后使用。1.4毒種O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia1JSL/06、Re-A/WH/09懸浮細(xì)胞毒由中農(nóng)威特生物科技股份有限公司保存并提供。1.5主要設(shè)備5L生物反應(yīng)器，購(gòu)自美國(guó)NBS公司；500L生物反應(yīng)器(中農(nóng)威特生物科技股份有限公司提供)，細(xì)胞分析儀，購(gòu)自德國(guó)INNOVATIS公司；生物安全柜等。1.6小鼠及乳鼠蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心引進(jìn)繁殖的昆明種小鼠，體重18～22g，乳鼠系2～3日齡小鼠。2方法2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取溫度(T)、pH值、DO值和Agit作為考察因素，分別命名為A、B、C、D4個(gè)因素，以146S含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定病毒培養(yǎng)過程中參數(shù)控制對(duì)病毒增殖的影響，從而進(jìn)行差異顯著性分析，對(duì)3個(gè)最優(yōu)組病毒液TCID50、LD50進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。水平及正交實(shí)驗(yàn)方案見表9和表10。表9因子水平表水平T(A)pH值(B)DO(C)Agit(D)136.07.45050236.57.66060337.07.87070表10L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)號(hào)T(A)pH值(B)DO(C)Agit(D)111112122231333421235223162312731328321393321T12.162.262.522.48T22.592.902.402.65T32.952.452.602.59極差R0.430.230.180.10注：T1、T2、T3分別為各因素同一水平的均值。2.2病毒培養(yǎng)將5L生物反應(yīng)器中按照實(shí)施例二方法培養(yǎng)好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21細(xì)胞4℃～8℃靜置，待細(xì)胞沉降后棄掉上清，加入病毒維持液，終體積為500mL，按病毒維持液體積的5％加入O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia1JSL/06或Re-AWH/09型種毒，其生物反應(yīng)器主要控制參數(shù)設(shè)定見表10，生物反應(yīng)器均自動(dòng)控制，測(cè)定146S含量，對(duì)3個(gè)最優(yōu)組病毒液TCID50、LD50進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)3次。2.3培養(yǎng)工藝放大效果驗(yàn)證采用前期在5L生物反應(yīng)器所獲得的生物反應(yīng)器工藝，對(duì)3個(gè)毒種的病毒在500L生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測(cè)病毒液TCID50、LD50和146S含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。2.4檢測(cè)方法2.4.1146S含量檢測(cè)按《口蹄疫滅活疫苗中間品及成品146S抗原含量檢測(cè)方法》進(jìn)行檢測(cè)。2.4.2LD50和TCID50檢測(cè)按常規(guī)方法進(jìn)行。3結(jié)果3.1過程參數(shù)控制對(duì)病毒效價(jià)的影響確定細(xì)胞密度及病毒的接種量后，對(duì)過程參數(shù)控制進(jìn)行優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)工藝的最大優(yōu)化策略，L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果如表11所示。表11L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析注：T1、T2、T3分別為各因素同一水平的均值.同列中相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著(p>0.05)。如表11所示，8號(hào)試驗(yàn)組146S含量最高，由此可見當(dāng)溫度、攪拌在3水平、pH值在2水平、DO在1水平時(shí)146S含量最高，各因子的最佳水平組合為：A3B2C1D3，即溫度37.0℃，pH值7.6、DO為50.0％、攪拌為70r/min時(shí)，該組合可有效提高146S含量；極差分析表明：RA>RB>RC>RD，可見溫度和pH值對(duì)病毒增殖的影響最大。對(duì)最優(yōu)的三組進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明，第5組、第7組和第8組差異不顯著，然后對(duì)此三組進(jìn)行病毒效價(jià)的檢測(cè)，分別命名為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，結(jié)果如下圖6。3.2不同毒型的病毒工藝放大驗(yàn)證如表12所示，用該工藝生產(chǎn)O/MYA98/BY/2010株病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.50LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量為107.50TCID50～108.17TCID50，每1.0ml病毒液146S含量為6.88～7.01μg；Re-A/WH/09株病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.00LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0ml病毒液146S含量為5.75～6.32μg；FMD/Asia1JSL/06，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.00LD50～107.67LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0ml病毒液146S含量為5.19～5.66μg。表12不同毒種病毒含量及146S含量結(jié)果4小結(jié)4.1確定了流加培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞生產(chǎn)O/MYA98/BY/2010、FMD/Asia1JSL/06和Re-A/WH/09口蹄疫病毒時(shí)生物反應(yīng)器培養(yǎng)關(guān)鍵控制參數(shù)：溫度36.5～37.0℃，pH值7.4～7.6，DO值為50.0％～70.0％，攪拌轉(zhuǎn)速為50～70r/min。4.2用該流加培養(yǎng)工藝生產(chǎn)3種病毒，O/MYA98/BY/2010病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.50LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量為107.50TCID50～108.17TCID50，每1.0ml病毒液146S含量為6.88～7.01μg；Re-A/WH/09病毒，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.50LD50～108.00LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50、每1.0ml病毒液146S含量為5.75～6.32μg；FMD/Asia1JSL/06，每0.2ml的病毒液病毒含量為107.00LD50～107.67LD50，每1.0ml的病毒液病毒含量107.50TCID50～107.83TCID50，每1.0ml病毒液146S含量為5.19～5.66μg。4.3采用本發(fā)明所述的流加培養(yǎng)工藝可進(jìn)行規(guī)模化FMDV生產(chǎn)。實(shí)施例四ZN-MEM培養(yǎng)與流加培養(yǎng)得到的細(xì)胞培養(yǎng)病毒的對(duì)比結(jié)果為了說明采用ZN-MEM培養(yǎng)(按照申請(qǐng)?zhí)枮?01510980603.7，發(fā)明名稱為“一種用于BHK-21細(xì)胞高密度懸浮培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)基及其在口蹄疫病毒增殖中的應(yīng)用”專利申請(qǐng)所公開的方法制備)與本發(fā)明實(shí)施例二流加培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞在病毒培養(yǎng)中的差異，本發(fā)明分別采用ZN-MEM培養(yǎng)基與流加培養(yǎng)得到的BHK-21細(xì)胞按照實(shí)施例三的方法進(jìn)行病毒增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下13所示：表13ZN-MEM培養(yǎng)與流加培養(yǎng)得到的細(xì)胞培養(yǎng)病毒的對(duì)比結(jié)果注：A：ZN-MEM培養(yǎng)；B：流加培養(yǎng)。從該表結(jié)果可以看出，用流加培養(yǎng)獲得的BHK-21懸浮細(xì)胞生產(chǎn)得口蹄疫病毒液，其效價(jià)為107.50LD50～108.00LD50，107.50TCID50～108.00TCID50，具有較強(qiáng)的感染性，均可達(dá)到生物制品規(guī)程規(guī)定的要求。而應(yīng)用本發(fā)明研究的流加培養(yǎng)策略生產(chǎn)的不同型口蹄疫病毒液，較ZN-MEM培養(yǎng)試驗(yàn)組，其有效抗原146S含量提升達(dá)80％，這為口蹄疫疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品品質(zhì)的提升、生產(chǎn)效率的提高奠定了基礎(chǔ)。當(dāng)前第1頁1 2 3