技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微藻的培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法。

背景技術(shù)：

世界原油產(chǎn)量持續(xù)減少，預(yù)計到2018年將下降至75億桶/年，僅相當于1950年原油產(chǎn)量。生物柴油是指由植物油、動物脂肪以及微生物胞內(nèi)油脂與短鏈醇，經(jīng)酯交換反應(yīng)得到的有機脂肪酸酯類物質(zhì)，作為可再生替代能源，環(huán)境友好性和可再生性使其具有很強的競爭力。微藻具有生長周期短、速度快等特點，因而通過微藻培養(yǎng)合成生物油脂進而制備生物柴油是最有效途徑之一。

微藻能夠利用自然界中的光能和無機碳源進行光合培養(yǎng)，但是光合培養(yǎng)存在著生長速度慢、最終生物量低、生長周期長的缺點。另外，微藻在不需要光照的條件下能夠利用有機物作為碳源和氮源進行異養(yǎng)培養(yǎng)，異養(yǎng)培養(yǎng)具有生長速度快、最終生物量高的優(yōu)點，能夠縮短周期。

微藻生物柴油生產(chǎn)的最終目的是用最低的成本獲得最大的脂質(zhì)生產(chǎn)。與光合培養(yǎng)相比，異養(yǎng)培養(yǎng)微藻主要考慮的是碳和氮來源的成本。

例如中國專利文獻CN 102746992 A（申請?zhí)?201210244511.9）公開了一種利用污泥水解液異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻的方法，先取生活污水處理廠的剩余污泥，濃縮后超聲處理；將超聲處理后的污泥在轉(zhuǎn)速為180r/min，溫度為35℃的條件下，進行厭氧水解2至3天；向得到的污泥水解液中加入微量元素和其他營養(yǎng)元素，高壓蒸汽滅菌后得培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液冷卻至室溫后，將小球藻接種至培養(yǎng)液中，置于振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)150h～180h，完成小球藻的培養(yǎng)。但是污泥降解液的含氮量不高，而且降解液中含有大量重金屬，抑制微藻生長。

家禽糞便(PM)富含營養(yǎng)鹽，特別是氮，其容量可通過組合達到55.7g/L。此外，除了豐富的氮、鉀、磷外，微量元素如鎂、鈣、鐵、銅、鋅等也存于PM降解液中。因此PM是一種有價值的主要營養(yǎng)素的來源，如果營養(yǎng)鹽能被高效率的吸收，那么對于微藻培養(yǎng)，PM絕對是一個可開發(fā)的有效資源。

雞糞(CM)作為一種典型的PM，富含有機氮、磷等元素。中國專利文獻CN 103756908（申請?zhí)?201410014303.9）公開了一種微藻有機培養(yǎng)液的配制方法，將從養(yǎng)雞場運輸?shù)碾u糞，放置在操場上，在溫度為20℃～28℃的條件下曝曬8天，然后用篩子除去雞糞中的石、沙、羽毛；將曝曬干燥后的雞糞與100℃的廢水按照1∶10的比例混合，并充分攪拌；將攪拌后得到的溶液浸泡3h，浸泡過程中對其進行充分攪拌；浸泡后得到的培養(yǎng)液通過24目的篩網(wǎng)過濾，濾網(wǎng)上方的溶質(zhì)與其他進行浸泡的雞糞混合使用，得到的溶液為小球藻培養(yǎng)液的原液；將過濾得到的培養(yǎng)液原液進行稀釋，得到小球藻培養(yǎng)液；將10%～20%的小球藻藻種與80%～90%小球藻培養(yǎng)液混合，進行小球藻培養(yǎng)。雞糞中的碳、氮等營養(yǎng)元素均以有機物的形式存在，上述對雞糞的處理方法不能將有機氮分解為無機氮如氨態(tài)氮和硝態(tài)氮從而被微藻所吸收，因而雞糞的營養(yǎng)物質(zhì)利用率較低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻從而促進微藻合成生物油脂的方法。

實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案是一種利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法，包括以下步驟：

①雞糞降解；

取養(yǎng)雞場的新鮮雞糞，用蒸餾水稀釋、攪勻得到雞糞稀釋液。

取雞糞稀釋液轉(zhuǎn)移入三角瓶中，在三角瓶的瓶口用紗布封住瓶口，然后將三角瓶分別轉(zhuǎn)移至搖床中，在40rpm～60rpm的轉(zhuǎn)速下降解4～6天后獲得降解后的物料，過濾得到低氮降解液，低氮降解液殺菌后轉(zhuǎn)移至冰箱保存待用。

另取雞糞稀釋液轉(zhuǎn)移入三角瓶中，在三角瓶的瓶口用紗布封住瓶口，然后將三角瓶分別轉(zhuǎn)移至搖床中，在240rpm～260rpm的轉(zhuǎn)速下降解4～6天后獲得降解后的物料，過濾得到高氮降解液，高氮降解液殺菌后轉(zhuǎn)移至冰箱保存待用。

②微藻異養(yǎng)培養(yǎng)；

先對微藻種子進行搖床培養(yǎng)，在三角瓶中裝入微藻培養(yǎng)液，從保貯斜面上取微藻細胞接種到三角瓶中的對應(yīng)微藻的培養(yǎng)液中，然后將三角瓶放在搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速140～160轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度28℃～32℃，培養(yǎng)65～75 h。

然后將搖床上培養(yǎng)后得到的微藻液以8%～12%(v/v)接種量接種到培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)罐中已加入對應(yīng)微藻的培養(yǎng)液,微藻異養(yǎng)培養(yǎng)180～220h后完成微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)；其中異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，在異養(yǎng)培養(yǎng)開始至第100～120小時內(nèi)，以14～16 mL/L/Day向培養(yǎng)體系添加步驟①準備的高氮降解液，然后從第100～120小時直至培養(yǎng)期結(jié)束，以14～16 mL/L/Day向培養(yǎng)體系添加步驟①準備的低氮降解液。

上述步驟①的低氮降解液的總氮、硝氮、氨氮含量分別為0.50～0.8g/L、130～260mg/L、300～360mg/L；高氮降解液的總氮、硝氮、氨氮含量分別為1.05～1.5g/L、780～910mg/L、70～120mg/L。

上述步驟②微藻異養(yǎng)培養(yǎng)時，培養(yǎng)體系的pH控制在5.0～7.0，溫度28～32℃，通氣速率0.8～1.2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速180～220rpm。

作為優(yōu)選的，培養(yǎng)體系的pH調(diào)節(jié)劑為硫酸或NaOH水溶液。

作為優(yōu)選的，步驟①得到的低氮降解液在115℃～121℃下殺菌15～25分鐘，轉(zhuǎn)移至冰箱 3℃～6℃下保存待用；步驟①得到的高氮降解液在115℃～121℃下殺菌15～25分鐘，轉(zhuǎn)移至冰箱 3℃～6℃下保存待用。

本發(fā)明具有積極的效果：（1）本發(fā)明在利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻時，首先在不同條件下對雞糞進行降解，獲得含氮量高的降解液和含氮量低的降解液；然后將微藻種子接種到其對應(yīng)的培養(yǎng)液中后，在培養(yǎng)期前段即前100～120h向培養(yǎng)體系中添加高氮降解液，此階段微藻細胞增長迅速；在培養(yǎng)期的后段向培養(yǎng)體系中添加低氮降解液，此時的培養(yǎng)體系利于微藻油脂合成；培養(yǎng)結(jié)束后微藻藻體量較高，并且培養(yǎng)得到的微藻的油脂含量高。

（2）由于本發(fā)明的雞糞降解液中除了豐富的氮、鉀、磷外，還含有微量元素如鎂、鈣、鐵、銅、鋅等，在整個微藻培養(yǎng)過程中，向培養(yǎng)液中直接加入雞糞高、低氮降解液即可，無需另外加入氮源，因而整個過程效率高、節(jié)省能源和成本。

（3）本發(fā)明培養(yǎng)微藻的方法工藝簡單、經(jīng)濟、環(huán)保，符合循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展的需要，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

具體實施方式

（實施例1）

本實施例異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻是小球藻(Chlorella protothecoides)，購買自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫，保藏編號為FACHB-3。

本實施例的利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法包括以下步驟：

①雞糞降解。

首選對雞糞降解的條件進行篩選。

取養(yǎng)雞場的新鮮雞糞300mL，該雞糞的含水率為70%～75%，向其中加入同體積即300mL的蒸餾水稀釋，攪勻后的雞糞稀釋液分別裝入6個三角瓶中，每個三角瓶中所裝的稀釋后的雞糞體積為30mL～50mL，本實施例中每瓶所裝物料的體積為30mL。

在每個三角瓶的瓶口用紗布封住瓶口，然后將各個三角瓶分別轉(zhuǎn)移至搖床中，分別在50rpm、100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、及300rpm的轉(zhuǎn)速下降解4～6天（本實施例中為5天）后獲得6份降解后的物料，過濾得到6份降解液，每份降解液在121℃下殺菌20分鐘，轉(zhuǎn)移至冰箱 4℃下保存。

分別測定上述6份降解液中氨氮(NH₄-N)、硝氮(NO₃-N)和總氮(TN)含量，選擇其中總氮含量最高的降解液和總氮含量最低的降解液作為本實施例微藻培養(yǎng)使用的降解液。

檢測發(fā)現(xiàn)搖床轉(zhuǎn)速為50rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最低，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為0.56～0.64g/L、140～180mg/L、330～360mg/L，將搖床轉(zhuǎn)速50rpm作為低氮雞糞降解液的降解條件。

搖床轉(zhuǎn)速為250rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最高，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為1.18～1.34g/L、830～860mg/L、 110～120mg/L，將搖床轉(zhuǎn)速250rpm作為高氮雞糞降解液的降解條件。

確定上述降解條件后，雞糞降解時：

取養(yǎng)雞場的新鮮雞糞600mL，向其中加入同體積即600mL的蒸餾水稀釋，攪勻后分別裝入2個三角瓶中，每個三角瓶中所裝的稀釋后的雞糞體積為100mL；在每個三角瓶的瓶口用紗布封住瓶口，然后將各個三角瓶分別轉(zhuǎn)移至搖床中，分別在50rpm和250rpm的轉(zhuǎn)速下降解5天后獲得2份降解后的物料，過濾得到2份降解液，每份降解液在121℃下殺菌20分鐘，轉(zhuǎn)移至冰箱 4℃下保存待用。

在50rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為低氮降解液，在250rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為高氮降解液。

②微藻異養(yǎng)培養(yǎng)。

先對小球藻種子進行搖床培養(yǎng)：準備5至10個250mL的三角瓶，在每個250mL的三角瓶中裝入50mL小球藻培養(yǎng)液，從保貯斜面上取一定量小球藻細胞接種到各個三角瓶中的培養(yǎng)液中，然后將各個三角瓶放在搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速140～160rpm，培養(yǎng)溫度28℃～32℃，培養(yǎng)65h～75 h。

所述小球藻培養(yǎng)液中除Bold’s basal media （BBM）培養(yǎng)基外，還包括下列物質(zhì) (g/L):葡萄糖 10.0，酵母粉2.0，甘氨酸 1.0。

BBM培養(yǎng)基中的主要物質(zhì)為 (g/L)： NaNO₃ 0.25， MgSO₄.7H₂O 0.075， NaCl 0.025， K₂HPO₄.3H₂O 0.075， KH₂PO₄ 0.175， CaCl₂.2H₂O 0.025， 微量物質(zhì)為 (10^-3g/L): ZnSO₄.7H₂O 8.82， MnCl₂.4H₂O 1.44，MoO₃ 0.71，CuSO₄.5H₂O1.57， Co(NO₃)₂.6H₂O 0.49，H₃BO₃ 11.42，EDTA 50.0，KOH 31.0 ， FeSO₄.7H₂O 4.98。

然后將搖床上培養(yǎng)后得到的小球藻液以8%～12%(v/v)接種量接種到5L的培養(yǎng)罐中，培養(yǎng)罐中小球藻培養(yǎng)液體積為2.5～3.5L,微藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中培養(yǎng)體系的pH控制在5.0～7.0，溫度28～32℃，通氣速率0.8～1.2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速180～220rpm，培養(yǎng)時間180～220h（本實施例為200h）。

異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，在異養(yǎng)培養(yǎng)開始至第100～120小時內(nèi)，以14～16 mL/L/Day向培養(yǎng)體系添加高氮降解液，即每天按照培養(yǎng)罐中每1L液體體積添加14～16 mL降解液的量添加；然后從第100～120小時直至培養(yǎng)期結(jié)束，以14～16 mL/L/Day向培養(yǎng)體系添加低氮降解液。

培養(yǎng)體系的pH調(diào)節(jié)劑為4M～6M（本實施例中為5M）的 硫酸或NaOH水溶液。

培養(yǎng)結(jié)束檢測小球藻的藻體量為7.47～7.68g/L, 油脂濃度為4.56～4.73 g/L。

若不向培養(yǎng)體系加入雞糞降解液，僅使用小球藻培養(yǎng)液進行異養(yǎng)培養(yǎng)，按照本實施例步驟②的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)結(jié)束獲得的小球藻的藻體量為5.73～6.12g/L, 油脂濃度為2.83～3.09 g/L。

可見本實施例通過向培養(yǎng)體系添加雞糞降解液，并且在不同的培養(yǎng)階段添加不同含氮量的降解液，使得培養(yǎng)結(jié)束后微藻藻體量較高，并且培養(yǎng)得到的微藻的油脂含量高。

（實施例2）

本實施例的利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法其余與實施例1相同，不同之處在于：

步驟②中所培養(yǎng)的微藻為角刺藻（Chaetoceros gracilis）。培養(yǎng)時所用的培養(yǎng)液為角刺藻培養(yǎng)液。異養(yǎng)培養(yǎng)時間220h。

培養(yǎng)結(jié)束后檢測角刺藻(Chaetoceros gracilis)的藻體量為3.34～3.67g/L, 油脂濃度為1.13～1.25 g/L。

若不向培養(yǎng)體系加入雞糞降解液，按照本實施例步驟②的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)結(jié)束獲得的角刺藻的藻體量為2.34～2.56g/L, 油脂濃度為0.61～0.72 g/L。

（實施例3）

本實施例的利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法其余與實施例1相同，不同之處在于：

步驟②中所培養(yǎng)的微藻為微藻琴式菱形藻（Psammodictyon panduriforme）。培養(yǎng)時所用的培養(yǎng)液為微藻琴式菱形藻培養(yǎng)液。異養(yǎng)培養(yǎng)時間190h。

培養(yǎng)結(jié)束后檢測微藻琴式菱形藻的藻體量為0.82 g/L～0.96g/L, 油脂濃度為0.46～0.52 g/L。

若不向培養(yǎng)體系加入雞糞降解液，按照本實施例步驟②的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)結(jié)束獲得的微藻琴式菱形藻的藻體量為0.55～0.62g/L, 油脂濃度為0.23～0.28g/L。

（實施例4）

本實施例的利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法其余與實施例1相同，不同之處在于：

步驟①中將6個三角瓶分別在40rpm、90rpm、140rpm、190rpm、240rpm、及290rpm的轉(zhuǎn)速下降解4～6天（本實施例中為5天）后獲得6份降解后的物料，過濾得到6份降解液。分別測定上述6份降解液中氨氮(NH₄-N)、硝氮(NO₃-N)和總氮(TN)含量，40rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最低，將搖床轉(zhuǎn)速40rpm作為低氮雞糞降解液的降解條件；240rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最高，將搖床轉(zhuǎn)速240rpm作為高氮雞糞降解液的降解條件。

然后分別在40rpm和240rpm的轉(zhuǎn)速下降解6天后獲得2份降解液，在40rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為低氮降解液，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為0.51～0.57g/L、132～148mg/L、305～313mg/L。

在240rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為高氮降解液，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為1.09～1.21g/L、780～820mg/L、90～100mg/L。

步驟②培養(yǎng)結(jié)束后檢測小球藻的藻體量為7.32～7.53g/L, 油脂濃度為4.28～4.49 g/L。

若不向培養(yǎng)體系加入雞糞降解液，按照本實施例步驟②的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)結(jié)束獲得的小球藻的藻體量為5.73～6.12g/L, 油脂濃度為2.83～3.09 g/L。

（實施例5）

本實施例的利用雞糞降解液異養(yǎng)培養(yǎng)微藻的方法其余與實施例1相同，不同之處在于：

步驟①中將6個三角瓶分別在60rpm、110rpm、160rpm、210rpm、260rpm、及310rpm的轉(zhuǎn)速下降解4～6天（本實施例中為5天）后獲得6份降解后的物料，過濾得到6份降解液。分別測定上述6份降解液中氨氮(NH₄-N)、硝氮(NO₃-N)和總氮(TN)含量，60rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最低，將搖床轉(zhuǎn)速60rpm作為低氮雞糞降解液的降解條件；260rpm的條件下獲得的降解液的總氮含量最高，將搖床轉(zhuǎn)速260rpm作為高氮雞糞降解液的降解條件。

然后分別在60rpm和260rpm的轉(zhuǎn)速下降解6天后獲得2份降解液，在60rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為低氮降解液，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為0.65～0.76g/L、240～260mg/L、320～350mg/L。

在260rpm的轉(zhuǎn)速下降解獲得的降解液為高氮降解液，其總氮、硝氮、氨氮含量分別為1.21～1.49g/L、870～910mg/L、70～90mg/L。

步驟②培養(yǎng)結(jié)束后檢測小球藻的藻體量為7.51～7.72g/L, 油脂濃度為4.49～4.68 g/L。

若不向培養(yǎng)體系加入雞糞降解液，按照本實施例步驟②的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)結(jié)束獲得的小球藻的藻體量為5.73～6.12g/L, 油脂濃度為2.83～3.09 g/L。