本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及用于檢測(cè)雌激素化合物的重組酵母及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

雌激素類化合物是指所有具有雌激素活性的化合物，是一類重要的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，種類繁多，結(jié)構(gòu)多樣。環(huán)境中的雌激素通過(guò)污染水、土壤、空氣而進(jìn)入生物鏈，在生物鏈富集、放大，通過(guò)飼料、飲水、空氣等途徑在畜禽體內(nèi)富集、放大，危害家畜的生產(chǎn)繁殖性能以及危害動(dòng)物性食品安全。該類化合物可與下丘腦、垂體、子宮等臟器的雌激素受體結(jié)合，對(duì)生殖發(fā)育過(guò)程、內(nèi)分泌系統(tǒng)、癌癥發(fā)生機(jī)制產(chǎn)生不利的影響，也威脅到生物種族的存亡。

隨著人們對(duì)環(huán)境內(nèi)分泌干擾物危害作用的認(rèn)識(shí)不斷深入，控制、防治內(nèi)分泌干擾物對(duì)人群健康的影響己成為當(dāng)務(wù)之急，而準(zhǔn)確地甄別、評(píng)價(jià)內(nèi)分泌干擾物是首先需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前己建立的環(huán)境雌激素干擾物的檢測(cè)方法主要有：體內(nèi)試驗(yàn)方法(包括子宮增重試驗(yàn)、陰道細(xì)胞角化試驗(yàn))和體外試驗(yàn)方法(包括受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、雌激素調(diào)控內(nèi)源性基因的表達(dá)、受體轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn))。從目前已建立的體外、體內(nèi)檢測(cè)方法來(lái)看，由于外源性化學(xué)物在體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的機(jī)制十分復(fù)雜，涉及諸多環(huán)節(jié)，因此整體動(dòng)物試驗(yàn)具有相對(duì)的準(zhǔn)確性和權(quán)威性，但同時(shí)往往操作過(guò)程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于高通量篩選以及現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，并且現(xiàn)有的檢測(cè)方法大多數(shù)敏感性較低而特異性偏高，因此建立快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、可靠，并可實(shí)現(xiàn)高通量篩選的體外檢測(cè)系統(tǒng)是目前該領(lǐng)域研究和發(fā)展的主要方向之一。

體外雌激素受體轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn)是近年來(lái)建立的一種測(cè)評(píng)方法。研究表明雌激素與雌激素受體(ER)在細(xì)胞核結(jié)合形成二聚體，增強(qiáng)雌激素受體與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中作為順式調(diào)控元件的雌激素效應(yīng)元件ERE特異性結(jié)合能力，二聚化的雌激素受體復(fù)合物再結(jié)合位于目標(biāo)基因啟動(dòng)子的雌激素效應(yīng)元件(EREs)，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而發(fā)揮作用。

該方法根據(jù)上述的激素在受體介導(dǎo)下調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的作用機(jī)制，構(gòu)建能夠表達(dá)雌激素受體、并帶有雌激素反應(yīng)元件及其所調(diào)控的報(bào)告基因的酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)水平評(píng)估受試物的雌激素樣作用的強(qiáng)弱。宿主細(xì)胞可以選用酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是酵母本身不具有內(nèi)源性類固醇激素及激素受體系統(tǒng)，且培養(yǎng)基中也無(wú)需加入血清，因此排除了內(nèi)源性激素的干擾作用；酵母表達(dá)產(chǎn)物與天然蛋白有極為相似的生物活性；并且酵母所表達(dá)的激素受體是人為轉(zhuǎn)化到細(xì)胞中的，因此排除了體內(nèi)受體基因突變可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響。但是，目前已構(gòu)建的重組酵母細(xì)胞檢測(cè)體系對(duì)雌激素類化合物的敏感性偏低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。

本發(fā)明提供的重組菌，為在酵母中表達(dá)雌激素受體β基因和含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒，得到的重組菌。

所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒依次包括所述3個(gè)串聯(lián)ERE基因、驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的啟動(dòng)子和所述報(bào)告基因。

上述重組菌中，所述重組菌中還表達(dá)抗性基因表達(dá)盒；

所述3個(gè)串聯(lián)ERE基因的核苷酸為序列表中序列4第1815‐1853位；

或，所述驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的啟動(dòng)子為部分ADH1；

所述部分ADH1的核苷酸序列為序列4第1860‐2269位。

上述重組菌中，所述在酵母中表達(dá)雌激素受體β基因?yàn)閷⑺龃萍に厥荏wβ基因以重組載體的方式導(dǎo)入所述酵母中進(jìn)行表達(dá)；

或，所述在酵母中表達(dá)雌激素受體β基因、抗性篩選基因表達(dá)盒和含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒為將同源重組片段整合到所述酵母基因組中進(jìn)行表達(dá)；

所述同源重組片段包括所述抗性篩選基因表達(dá)盒和所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒的片段。

上述重組菌中，所述重組載體為將所述雌激素受體β基因插入表達(dá)載體中，且表達(dá)所述雌激素受體β基因的載體；

所述重組載體中，驅(qū)動(dòng)所述雌激素受體β基因表達(dá)的啟動(dòng)子為序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；

或所述整合均采用基因組定點(diǎn)編輯或同源重組的方式進(jìn)行；

或所述基因組定點(diǎn)編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；

或所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組或整合質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組。

上述重組菌中，所述雌激素受體β基因的核苷酸序列為序列1第7-1599位；

或所述抗性篩選基因表達(dá)盒的抗性篩選基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颍?/p>

或所述抗性篩選基因表達(dá)盒的核苷酸序列為序列4第540‐1853位；

或所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒的報(bào)告基因?yàn)镚FP基因，所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒的核苷酸序列為序列4第1815‐3242位；

或所述表達(dá)載體為p426GDP載體或p416GDP載體；

或所述同源重組片段的核苷酸序列為序列4第33‐3748位；

或所述同源重組片段通過(guò)整合質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組整合；

或所述整合質(zhì)粒的核苷酸序列為序列4；

或所述酵母為釀酒酵母。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：將雌激素受體β基因和含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒導(dǎo)入所述酵母，得到重組菌。

上述方法中，所述方法還包括將抗性篩選基因表達(dá)盒導(dǎo)入所述酵母；

或，所述雌激素受體β基因以重組載體的方式導(dǎo)入所述酵母中進(jìn)行表達(dá)；

或，所述抗性篩選基因表達(dá)盒和所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒通過(guò)同源重組片段整合到所述酵母基因組中進(jìn)行表達(dá)；所述同源重組片段包括抗性篩選基因表達(dá)盒和所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒。

上述方法中，所述重組載體為將所述雌激素受體β基因插入表達(dá)載體中，且表達(dá)所述雌激素受體β基因的載體；

所述重組載體中，驅(qū)動(dòng)所述雌激素受體β基因表達(dá)的啟動(dòng)子為序列表中序列2或序列4所示的DNA分子；

或所述整合均采用基因組定點(diǎn)編輯或同源重組的方式進(jìn)行；

或所述基因組定點(diǎn)編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；

或所述同源重組具體為λ-red同源重組或sacB基因介導(dǎo)篩選的同源重組或整合質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組。

上述方法中，所述雌激素受體β基因的核苷酸序列為序列1第7-1599位；

或所述抗性篩選基因表達(dá)盒的抗性篩選基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颍?/p>

或所述抗性篩選基因表達(dá)盒的核苷酸序列為序列4第540‐1853位；

或所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒的報(bào)告基因?yàn)镚FP基因，所述含有3個(gè)串聯(lián)ERE基因的報(bào)告基因表達(dá)盒的核苷酸序列為序列4第1815‐3242位；

或所述表達(dá)載體為p426GDP載體或p416GDP載體；

或所述同源重組片段的核苷酸序列為序列4第33‐3748位；

或所述同源重組片段通過(guò)整合質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組整合；

或所述整合質(zhì)粒的核苷酸序列為序列4；

或所述酵母為釀酒酵母。

上述重組菌在檢測(cè)雌激素化合物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述重組菌在制備檢測(cè)雌激素化合物產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供檢測(cè)雌激素化合物產(chǎn)品。

本發(fā)明的產(chǎn)品，包括上述重組菌。

上述釀酒酵母為BY4742。

上述雌激素化合物為17‐β雌二醇、17‐a雌二醇或4‐羥基雌二醇。

本發(fā)明利用合成生物學(xué)和代謝工程手段將抗性基因表達(dá)盒、3個(gè)串聯(lián)的ERE和啟動(dòng)子為ADH的GFP基因表達(dá)盒整合到酵母宿主染色體中，然后再轉(zhuǎn)入含有雌激素受體表達(dá)載體，獲得重組酵母。結(jié)果顯示，重組酵母在雌激素類化合物存在時(shí)，可穩(wěn)定高效合成GFP，GFP的表達(dá)量與雌激素類化合物的濃度呈正比，17β雌二醇的EC₅₀為3.25pM，比現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道提高約20倍。本發(fā)明為快速、靈敏地檢測(cè)環(huán)境中雌激素類化合物奠定基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為表達(dá)ERβ的不同載體得到的重組菌在檢測(cè)雌激素化合物的效果比較。

圖2為p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)檢測(cè)不同濃度的不同雌激素化合物的效果比較。

圖3為p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)在檢測(cè)雌激素的穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果。

圖4為不同GFP啟動(dòng)子構(gòu)建的重組菌在檢測(cè)雌激素化合物的效果比較。

圖5為不同個(gè)數(shù)ERE構(gòu)建的重組菌在檢測(cè)雌激素化合物的效果比較。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、構(gòu)建用于檢測(cè)雌激素化合物的重組酵母

雌激素的生物學(xué)效應(yīng)大致受到三種雌激素受體的調(diào)節(jié)，即雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)、G蛋白偶聯(lián)的雌激素受體(GPER)。經(jīng)典的雌激素受體ERα、ERβ大部分存在于細(xì)胞核，在細(xì)胞內(nèi)作為配基激活的轉(zhuǎn)錄因子。這兩種受體發(fā)揮作用的方式主要通過(guò)經(jīng)典調(diào)節(jié)途徑，即雌激素與雌激素受體(ER)在細(xì)胞核結(jié)合形成二聚體，再結(jié)合位于目標(biāo)基因啟動(dòng)子的雌激素反應(yīng)元件(EREs)，從而發(fā)揮作用。其中雌激素受體ERβ比ERα對(duì)大部分雌激素類化合物反應(yīng)比較敏感，因此選用ERβ作為雌激素檢測(cè)系統(tǒng)中的雌激素受體。

為了增強(qiáng)雌激素經(jīng)典調(diào)控途徑的靈敏度，本發(fā)明的發(fā)明人選用3個(gè)串聯(lián)雌激素反應(yīng)元件(EREs)及缺失ADH啟動(dòng)子。綠色熒光蛋白(GFP)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒無(wú)害，是生物標(biāo)記中常用的信號(hào)，因此選用GFP為雌激素檢測(cè)系統(tǒng)的報(bào)告基因。

一、重組表達(dá)載體p416GDP‐ERβ和p426GDP‐ERβ的構(gòu)建

載體p416GDP與p426GDP啟動(dòng)子一樣，但是質(zhì)?？截悢?shù)不同，在宿主中p416GDP為低拷貝，p426GDP為高拷貝。

1、重組表達(dá)載體p416GDP‐ERβ的構(gòu)建

(1)以在金斯瑞公司進(jìn)行合成序列1所示的核苷酸為模板，采用引物ERβ‐Fwd(SpeI)和ERβ‐Rev(SalI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI進(jìn)行雙酶切。

ERβ‐Fwd(SpeI)：5’‐GCGCGCACTAGTATGGATATTAAAAATTCTCCATC‐3’(下劃線部分為SpeI的識(shí)別序列)；

ERβ‐Rev(Sall)：5’‐GCGCGCGTCGACTTATTGTGATTGTGGATTTTG‐3’(下劃線部分為SalI的識(shí)別序列)。

(2)采用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI雙酶切p416GDP載體(87360^TM)。

(3)將步驟(1)所得酶切產(chǎn)物與步驟(2)所得的p416GDP載體載體骨架大片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒，將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為p416GDP‐ERβ。

重組表達(dá)載體p416GDP‐ERβ的結(jié)構(gòu)描述如下：將p416GDP載體的酶切位點(diǎn)SpeI和SalI之間的小片段替換為序列表中序列1的第7‐1599位所示的人源雌激素受體β(ERβ)基因后得到的重組質(zhì)粒。

在重組表達(dá)載體p416GDP‐ERβ中，啟動(dòng)人源雌激素受體β(ERβ)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子GDP啟動(dòng)子，其序列具體如序列表中序列2所示；終止人源雌激素受體β(ERβ)基因轉(zhuǎn)錄的終止子為CYC1終止子，其序列具體如序列表中序列3所示。

2、重組表達(dá)載體p426GDP‐ERβ的構(gòu)建

(1)以質(zhì)粒p416GDP‐ERβ模板，采用引物ERβ‐Fwd(SpeI)和ERβ‐Rev(SalI)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將所得PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI進(jìn)行雙酶切。

ERβ‐Fwd(SpeI)：5’‐GCGCGCactagtatggatattaaaaattctccatc‐3’(下劃線部分為SpeI的識(shí)別序列)；

ERβ‐Rev(Sall)：5’‐GCGCGCGTCGACTTATTGTGATTGTGGATTTTG‐3’(下劃線部分為SalI的識(shí)別序列)。

(2)采用限制性內(nèi)切酶SpeI和SalI雙酶切p426GDP載體(87361^TM)。

(3)將步驟(1)所得酶切產(chǎn)物與步驟(2)所得的p426GDP載體載體骨架大片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒，將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為p426GDP‐ERβ。

重組表達(dá)載體p426GDP‐ERβ的結(jié)構(gòu)描述如下：將p426GDP載體的酶切位點(diǎn)SpeI和SalI之間的小片段替換為序列表中序列1的第7‐1599位所示的人源雌激素受體β(ERβ)基因后得到的重組質(zhì)粒。

在重組表達(dá)載體p426GDP‐ERβ中，啟動(dòng)人源雌激素受體β(ERβ)基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子GDP啟動(dòng)子，其序列具體如序列表中序列2所示；終止人源雌激素受體β(ERβ)基因轉(zhuǎn)錄的終止子為CYC1終止子，其序列具體如序列表中序列3所示。

二、重組表達(dá)載體pETM6‐rDNA‐GFP的構(gòu)建

重組表達(dá)載體pETM6‐rDNA‐GFP的核苷酸序列為序列4，該載體包括同源重組片段，該同源重組片段的核苷酸序列為序列4第33‐3748位；該片段包括KanMx表達(dá)盒和含有3個(gè)串聯(lián)ERE的GFP表達(dá)盒；該片段各組成的序列如下：序列4第33‐533位為上游rDNA，序列4第540‐1794為KanMx表達(dá)盒(序列4第540‐748位為KanMx的啟動(dòng)子TRP1、序列4第位為KanMx、序列4第1560‐1794位為KanMx的終止子TEF1)，序列第1815‐3242位為含有3個(gè)串聯(lián)ERE的GFP表達(dá)盒(序列4第1815‐1853位為3個(gè)串聯(lián)的ERE，序列4第1860‐2269位為GFP的啟動(dòng)子部分ADH1、序列4第2270‐2983位為GFP、序列4第2990‐3242位為GFP的終止子CYC1)，序列4第3248‐3748位為下游rDNA。

其構(gòu)建方法如下：

重組表達(dá)載體pETM6-rDNA-GFP為將序列4第33-3748位所示的同源重組片段插入pETM6載體(該載體記載在如下文獻(xiàn)中：Xu,P.,Vansiri,A.,Bhan,N.,&Koffas,M.A.(2012).ePathBrick:a synthetic biology platform for engineERing metabolic pathways in E.coli.ACS Synth Biol,1(7),256-266.doi:10.1021/sb300016b)的XbaI和SalI酶切位點(diǎn)間得到的載體。

三、重組酵母的構(gòu)建

選用釀酒酵母BY4742(記載在如下文獻(xiàn)中：PLoS One.2014Dec 17；9(12):e113869.doi:10.1371/journal.pone.0113869.eCollection 2014.Formation of hydrogen sulfide from cysteine in Saccharomyces cERevisiae BY4742:genome wide screen reveals a central role of the vacuole.)作為待轉(zhuǎn)化的受體酵母細(xì)胞。

1、將上述二制備的重組表達(dá)載體pETM6-rDNA-GFP轉(zhuǎn)化受體酵母細(xì)胞BY4742的感受態(tài)細(xì)胞，挑選能在含有200μg/mL的G418的YPD固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在上述培養(yǎng)基平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，能在含有G418平板上那個(gè)生長(zhǎng)的酵母中必含有整合序列，得到遺傳穩(wěn)定的重組子gDNA(ERE‐ADH‐GFP)。

其中，YPD液體培養(yǎng)基：蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，葡萄糖10g/L，溶于雙蒸水中，pH調(diào)至6.5，高壓滅菌。YPD固體培養(yǎng)基：在YPD液體培養(yǎng)基中加入2％(2g/100ml)瓊脂粉，高壓滅菌。

2、將上述一制備的重組表達(dá)載體p416GDP‐ERβ和p426GDP‐ERβ分別轉(zhuǎn)化步驟1得到的gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，挑選能在含有200μg/mL的G418的SD/‐Ura固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落，使其在上述培養(yǎng)基平板上連續(xù)轉(zhuǎn)接三代，得到遺傳穩(wěn)定的重組酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)和p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)。

其中，SD/‐Ura固體培養(yǎng)基：無(wú)氨基酸酵母氮源6.7g/L，葡萄糖20g/L，CSM‐Ura0.76g/L，溶于雙蒸水中，pH調(diào)至6.5，2％(2g/100ml)瓊脂粉，高壓滅菌。

經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，

重組酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)為將p416GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列4第33‐3748位所示同源重組片段整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌。

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)為將p426GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列4第33‐3748位所示同源重組片段整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌。

構(gòu)建重組酵母gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，其為將序列4第33‐3748位所示同源重組片段整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌。

實(shí)施例2、重組酵母在檢測(cè)雌激素化合物中的應(yīng)用

一、對(duì)不同菌株對(duì)雌激素類化合物的檢測(cè)效果

培養(yǎng)實(shí)施例1得到的重組酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)和p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，在培養(yǎng)體系中加入雌激素類化合物(17‐β雌二醇)，使其終濃度為5nM。震蕩4hr后，用酶標(biāo)儀(infiniteM200PRO)測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。以不加入雌激素類化合物(17‐β雌二醇)為對(duì)照。

結(jié)果如圖1所示，由圖可見(jiàn)，與重組酵母p416GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)相比，重組菌p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)的熒光強(qiáng)度較高，表明該菌作為檢測(cè)雌激素化合物的效果較好。

二、對(duì)不同濃度的各種雌激素類化合物的檢測(cè)效果

培養(yǎng)重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，在培養(yǎng)體系中加入不同終濃度的雌激素類化合物(17‐β雌二醇、17‐a雌二醇、4‐羥基雌二醇)，震蕩4hr后，用酶標(biāo)儀(infiniteM200PRO)測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

結(jié)果如圖2所示，由圖可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度與雌激素類化合物存在較明顯的劑量關(guān)系，在所測(cè)三種雌激素類化合物中重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)對(duì)17‐β雌二醇最為靈敏，通過(guò)軟件Origin 8.0擬合得到對(duì)17‐β雌二醇的EC₅₀為3.25pm。

三、測(cè)定雌激素檢測(cè)系統(tǒng)隨時(shí)間的穩(wěn)定性

為了測(cè)定重組酵母細(xì)胞p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)隨時(shí)間的穩(wěn)定性，培養(yǎng)該菌，在培養(yǎng)體系中加入不同濃度17‐β雌二醇，震蕩不同時(shí)間(2、4、25、48、72hr)，用酶標(biāo)儀(infiniteM200PRO)測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)485nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

結(jié)果如圖3所示，由圖可見(jiàn)，震蕩4小時(shí)熒光強(qiáng)度最高，且在48小時(shí)內(nèi)，熒光穩(wěn)定性較好。

對(duì)比例1、不同GFP啟動(dòng)子的重組酵母菌構(gòu)建及其檢測(cè)雌二醇的效果

ERβ對(duì)啟動(dòng)子的激活活性具有特異性，為此測(cè)試了不同的啟動(dòng)子，如部分CYC1,部分TRP1,部分GAL1，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在相同條件下ERβ對(duì)部分ADH1啟動(dòng)子激活能力最強(qiáng)，GFP表達(dá)量最高，因此ERβ對(duì)部分ADH1啟動(dòng)子序列具有最強(qiáng)的特異性。

一、不同GFP啟動(dòng)子的重組酵母菌的構(gòu)建

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)為將p426GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列4第33‐3748位所示同源重組片段整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌。

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐CYC‐GFP)為將p416GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列A所示片段A整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌；

序列A為將序列4第1860‐2269位的GFP啟動(dòng)子部分ADH1替換為序列5部分CYC1啟動(dòng)子，序列4其余核苷酸序列不變。

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐GAL‐GFP)為將p426GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列B所示片段B整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌；

序列B為將序列4第1860‐2269位的GFP啟動(dòng)子部分ADH1替換為序列6部分GAL1啟動(dòng)子，序列4其余核苷酸序列不變。

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐TRP‐GFP)為將p416GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列C所示片段C整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌。

序列C為將序列4第1860‐2269位的GFP啟動(dòng)子部分ADH1替換為序列7部分TRP啟動(dòng)子，序列4其余核苷酸序列不變。

二、重組酵母菌在檢測(cè)雌激素化合物中的應(yīng)用

將上述一構(gòu)建的重組菌按照實(shí)施例2的二所示的方法，以不加入雌激素類化合物(17‐β雌二醇)為對(duì)照。

結(jié)果如圖4所示，可以看出，GFP啟動(dòng)子為部分ADH1的重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)高于其它菌株，為最優(yōu)啟動(dòng)子。

對(duì)比例2、不同個(gè)數(shù)ERE的對(duì)照

片段D的核苷酸序列為序列D，序列D為將序列4第1815‐1853位的3個(gè)串聯(lián)的ERE序列替換為序列8(兩個(gè)保守的ERE序列)，序列4其余核苷酸序列不變。

重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE2‐GAL‐GFP)為將p426GDP‐ERβ質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母BY4742，且將序列D所示片段D整合到釀酒酵母BY4742的基因組的rDNA處得到的菌；

將上述一構(gòu)建的重組菌按照實(shí)施例2的二所示的方法，以不加入雌激素類化合物(17‐β雌二醇)為對(duì)照。

結(jié)果如圖5所示，可以看出，3個(gè)串聯(lián)的ERE序列的重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)高于2個(gè)串聯(lián)的ERE序列的重組酵母p426GDP‐ERβ+gDNA(ERE‐ADH‐GFP)，為最適的ERE序列。

序列表

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院

<120>用于檢測(cè)雌激素化合物的重組酵母及其構(gòu)建方法

<160> 8

<170> PatentIn vERsion 3.5

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

actagtatgg atattaaaaa ttctccatct tctttaaatt ctccatcttc atacaactgt 60

tctcaatcaa tcttgccatt agaacatggt tctatctata ttccatcttc atacgttgat 120

tcacatcatg aatatccagc tatgactttt tactctccag cagttatgaa ctactctatc 180

ccatcaaacg ttacaaattt ggaaggtggt ccaggtagac aaactacatc accaaatgtt 240

ttatggccaa ctccaggtca tttgtctcca ttagttgttc atagacaatt gtcacatttg 300

tatgctgaac cacaaaaatc tccatggtgt gaagcaagat cattggaaca tactttgcca 360

gttaacagag aaacattgaa gagaaaagtt tctggtaaca gatgtgcttc accagttaca 420

ggtccaggtt ctaaaagaga tgctcatttt tgtgcagttt gttctgatta tgcttcaggt 480

tatcattacg gtgtttggtc ttgtgaaggt tgtaaagcat ttttcaagag atcaatccaa 540

ggtcataatg attacatttg tccagctact aatcaatgta caatcgataa gaacagaaga 600

aagtcttgtc aagcatgtag attaagaaag tgttacgaag ttggtatggt taaatgtggt 660

tcaagaagag aaagatgtgg ttacagattg gttagaagac aaagatcagc tgatgaacaa 720

ttacattgtg ctggtaaagc aaaaagatca ggtggtcatg ctccaagagt tagagaattg 780

ttattggatg cattgtctcc agaacaattg gttttaacat tattggaagc tgaaccacca 840

catgttttga tttcaagacc atcagctcct tttactgaag catctatgat gatgtcattg 900

acaaaattag ctgataagga attggttcac atgatttctt gggctaagaa aattccaggt 960

ttcgttgaat tgtctttatt cgatcaagtt agattattgg aatcatgttg gatggaagtt 1020

ttgatgatgg gtttaatgtg gagatcaatc gatcatcctg gtaaattgat cttcgctcca 1080

gatttggttt tagatagaga tgagggtaaa tgtgttgaag gtattttaga aatttttgat 1140

atgttattgg ctactacttc aagattcaga gaattgaaat tgcaacataa ggaatatttg 1200

tgtgttaagg caatgatctt gttaaattct tctatgtacc cattagttac tgctacacaa 1260

gatgcagatt cttcaagaaa attggctcat ttgttgaatg ctgttactga tgcattagtt 1320

tgggttattg caaaatctgg tatttcttca caacaacaat caatgagatt agctaatttg 1380

ttgatgttgt tgtctcatgt tagacatgca tcaaataagg gtatggaaca tttgttgaac 1440

atgaagtgta agaacgttgt tccagtttac gatttgttgt tagaaatgtt gaacgctcat 1500

gttttgagag gttgtaagtc ttcaatcaca ggttctgaat gttcaccagc agaagattct 1560

aagtcaaagg aaggttctca aaatccacaa tcacaataag tcgac 1605

<210> 2

<211> 655

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

agtttatcat tatcaatact cgccatttca aagaatacgt aaataattaa tagtagtgat 60

tttcctaact ttatttagtc aaaaaattag ccttttaatt ctgctgtaac ccgtacatgc 120

ccaaaatagg gggcgggtta cacagaatat ataacatcgt aggtgtctgg gtgaacagtt 180

tattcctggc atccactaaa tataatggag cccgcttttt aagctggcat ccagaaaaaa 240

aaagaatccc agcaccaaaa tattgttttc ttcaccaacc atcagttcat aggtccattc 300

tcttagcgca actacagaga acaggggcac aaacaggcaa aaaacgggca caacctcaat 360

ggagtgatgc aacctgcctg gagtaaatga tgacacaagg caattgaccc acgcatgtat 420

ctatctcatt ttcttacacc ttctattacc ttctgctctc tctgatttgg aaaaagctga 480

aaaaaaaggt tgaaaccagt tccctgaaat tattccccta cttgactaat aagtatataa 540

agacggtagg tattgattgt aattctgtaa atctatttct taaacttctt aaattctact 600

tttatagtta gtcttttttt tagttttaaa acaccagaac ttagtttcga cggat 655

<210> 3

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg 60

aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct aggtccctat ttattttttt atagttatgt 120

tagtattaag aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt 180

acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt 240

taatttgcgg cc 252

<210> 4

<211> 8654

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaagtac ctcccaacta cttttcctca 60

cacttgtact ccatgactaa accccccctc ccattacaaa ctaaaatctt acttttattt 120

tcttttgccc tctctgtcgc tctgccttaa ctacgtattt ctcgccgaga aaaacttcaa 180

tttaagctat tctccaaaaa tcttagcgta tatttttttt ccaaagtgac aggtgccccg 240

ggtaacccag ttcctcacta ttttttactg cggaagcgga agcggaaaat acggaaacgc 300

gcgggaacat acaaaacata caaaatatac ctttctcaca caagaaatat atgctacttg 360

caaaatatca taccaaaaaa cttttcacaa ccgaaaccaa aaccaacgga tatcatacat 420

tacactacca ccattcaaac tttactacta tcctcccttc agtttccctt tttctgcctt 480

tttcggtgac ggaaatacgc ttcagagacc ctaaagggaa atccatgcca taacctagga 540

cagttatgac gccagatggc agtagtggaa gatattcttt attgaaaaat agcttgtcac 600

cttacgtaca atcttgatcc ggagcttttc tttttttgcc gattaagaat tcggtcgaaa 660

aaagaaaagg agagggccaa gagggagggc attggtgact attgagcacg tgagtatacg 720

tgattaagca cacaaaggca gcttggagta tgggtaagga aaagactcac gtttcgaggc 780

cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgagataatg 840

tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt 900

ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa 960

actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg 1020

atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gcaaaacagc attccaggta ttagaagaat 1080

atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt 1140

cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc 1200

aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct 1260

ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca ccggattcag 1320

tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag 1380

gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat 1440

ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta 1500

ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaat 1560

cagtactgac aataaaaaga ttcttgtttt caagaacttg tcatttgtat agttttttta 1620

tattgtagtt gttctatttt aatcaaatgt tagcgtgatt tatatttttt ttcgcctcga 1680

catcatctgc ccagatgcga agttaagtgc gcagaaagta atatcatgcg tcaatcgtat 1740

gtgaatgctg gtcgctatac tgctgtcgat tcgatactaa cgccgccatc cagtgctagg 1800

ttgcggccga attcggtcac agtgaccggt cacagtgacc ggtcacagtg accgctagcg 1860

caacttcttt tctttttttt tcttttctct ctcccccgtt gttgtctcac catatccgca 1920

atgacaaaaa aatgatggaa gacactaaag gaaaaaatta acgacaaaga cagcaccaac 1980

agatgtcgtt gttccagagc tgatgagggg tatctcgaag cacacgaaac tttttccttc 2040

cttcattcac gcacactact ctctaatgag caacggtata cggccttcct tccagttact 2100

tgaatttgaa ataaaaaaaa gtttgctgtc ttgctatcaa gtataaatag acctgcaatt 2160

attaatcttt tgtttcctcg tcattgttct cgttcccttt cttccttgtt tctttttctg 2220

cacaatattt caagctatac caagcataca atcaactatc tcatatacaa tgaccgccct 2280

gacagaaggc gccaaattgt ttgagaaaga gatcccatat atcactgaat tggaaggtga 2340

cgtggaaggc atgaaattta tcattaaagg tgagggcact ggcgacgcta ctacaggcac 2400

tattaaagct aaatacatct gtaccacagg tgacttgcca gtgccatggg ccactttggt 2460

ttctactttg tcttacggcg tccaatgctt cgcaaagtac ccatctcaca tcaaggattt 2520

ctttaagtct gcaatgccag aaggctatac tcaggagagg actatctctt tcgaaggtga 2580

cggtgtttac aagacaaggg cgatggtcac ttacgaaaga ggcagcatct acaacagggt 2640

gacattgacc ggcgagaatt ttaagaaaga cggccacatt ttgaggaaga atgtcgcctt 2700

ccagtgtcca ccttctattt tgtatatttt gcccgacact gtcaataacg gtatcagagt 2760

cgagttcaat caagcttacg atattgaagg cgttactgaa aaattggtca ctaaatgttc 2820

tcagatgaac aggccactgg ctggtagtgc tgccgttcat atcccaaggt atcatcacat 2880

tacttaccac actaaattgt ctaaagacag agacgagaga agggatcaca tgtgcttggt 2940

agaggtggtt aaagctgtcg atttggacac atatcagtaa tgactcgagt catgtaatta 3000

gttatgtcac gcttacattc acgccctccc cccacatccg ctctaaccga aaaggaagga 3060

gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tattttttta tagttatgtt agtattaaga 3120

acgttattta tatttcaaat ttttcttttt tttctgtaca gacgcgtgta cgcatgtaac 3180

attatactga aaaccttgct tgagaaggtt ttgggacgct cgaaggcttt aatttgcggc 3240

cgagctcaca ggaaagtaac atcccaatgc ggactatacc accccaccac actcctacca 3300

ataacggtaa ctattctatg ttttcttact cctatgtcta ttcatctttc atctgactac 3360

ctaatactat gcaaaaatgt aaaatcatca cacaaaacat aaacaatcaa aatcagccat 3420

ttccgcacct tttcctctgt ccactttcaa ccgtccctcc aaatgtaaaa tggcctatcg 3480

gaatacattt tctacatcct aactactata aaacaacctt tagacttacg tttgctactc 3540

tcatggtctc aatactgccg ccgacattct gtcccacata ctaaatctct tcccgtcatt 3600

atcgcccgca tccggtgccg taaatgcaaa acaaatacca tctatgtctt ccacaccatc 3660

attttactat gcctgccacc atccatttgt cttttgcacc atatcttcat aacctgtcac 3720

cttgaaacta cctctgcatg ccacctacgt cgactatatc cggattggcg aatgggacgc 3780

gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac 3840

acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt 3900

cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc 3960

tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc 4020

gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact 4080

cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg 4140

gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc 4200

gaattttaac aaaatattaa cgtttacaat ttctggcggc acgatggcat gagattatca 4260

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 4320

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 4380

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 4440

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4500

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4560

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4620

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4680

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4740

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4800

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4860

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4920

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 4980

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 5040

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 5100

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 5160

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 5220

caatcatgat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 5280

tatttagaaa aataaacaaa taggtcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 5340

actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc 5400

gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg 5460

atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa 5520

atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 5580

ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 5640

gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 5700

cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 5760

tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 5820

cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 5880

ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat 5940

gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc 6000

tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg 6060

ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc 6120

gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc 6180

atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc 6240

cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc 6300

cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 6360

tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 6420

ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag 6480

atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg 6540

cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac tgatgcctcc 6600

gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc 6660

acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa 6720

ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc 6780

gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg 6840

aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg 6900

aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt 6960

cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg 7020

gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcta gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg 7080

actgggttga aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg gtgcctaatg agtgagctaa 7140

cttacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag 7200

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgccagggt 7260

ggtttttctt ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg 7320

agagagttgc agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat 7380

ggtggttaac ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga 7440

gatgtccgca ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc ccagcgccat 7500

ctgatcgttg gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt 7560

ttgttgaaaa ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg gctgaatttg 7620

attgcgagtg agatatttat gccagccagc cagacgcaga cgcgccgaga cagaacttaa 7680

tgggcccgct aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct ccacgcccag 7740

tcgcgtaccg tcttcatggg agaaaataat actgttgatg ggtgtctggt cagagacatc 7800

aagaaataac gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca gcaatggcat cctggtcatc 7860

cagcggatag ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg agaagattgt gcaccgccgc 7920

tttacaggct tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc accacgctgg cacccagttg 7980

atcggcgcga gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg ccagactgga 8040

ggtggcaacg ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt tgttgtgcca cgcggttggg 8100

aatgtaattc agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg cagaaacgtg 8160

gctggcctgg ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac 8220

atcgtataac gttactggtt tcacattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta 8280

tcatgccata ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg tccgggatct cgacgctctc 8340

ccttatgcga ctcctgcatt aggaagcagc ccagtagtag gttgaggccg ttgagcaccg 8400

ccgccgcaag gaatggtgca tgcaaggaga tggcgcccaa cagtcccccg gccacggggc 8460

ctgccaccat acccacgccg aaacaagcgc tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt 8520

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cggccacgat gcgtccggcg tagcctagga tcgagatcga tctcgatccc gcgaaattaa 8640

tacgactcac tata 8654

<210> 5

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gagcagatcc gccaggcgtg tatatatagc gtggatggcc aggcaacttt agtgctgaca 60

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<210> 6

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列

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taagaattcg gtcgaaaaaa gaaaaggaga gggccaagag ggagggcatt ggtgactatt 60

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtcacagtg accggtcaca gtgaccggtc acagtgacc 39