本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選治療缺血性腦卒中的藥物中應(yīng)用，以及IRF6的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療缺血性腦卒中疾病的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腦卒中是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，目前已成為世界范圍內(nèi)首要致死和致殘的原因^[1,2]。腦卒中大體可分成兩大類：缺血性腦卒中，約占70％～80％％；出血性腦卒中，約占20％～30％^[3]。缺血性腦卒中是由于血栓或栓子阻塞了腦大血管或其分支，導(dǎo)致的永久性或暫時(shí)性腦組織缺血缺氧損傷，目前是全球第四大致死因素及第二大致殘因素，其發(fā)后數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)即出現(xiàn)不可逆轉(zhuǎn)的腦損傷，對(duì)患者的生命和健康造成嚴(yán)重危害。

缺血性腦卒中的病理生理改變主要涉及以下幾個(gè)因素：興奮性中毒、Ca²⁺離子超載、氧化應(yīng)激、炎癥、凋亡和梗死周邊區(qū)去極化。在缺血性卒中發(fā)生后，腦組織由于能量代謝障礙而導(dǎo)致興奮性氨基酸如谷氨酸大量且迅速的釋放，并伴有興奮性氨基酸的再攝取障礙。大量聚集的谷氨酸過(guò)度激活一系列下游的信號(hào)通路，包括鈣超載、活性氧的產(chǎn)生?；钚匝跷镔|(zhì)會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體和DNA損傷、激活或抑制許多炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死相關(guān)的信號(hào)通路^[4]。與此同時(shí)，缺血的腦組織會(huì)釋放損傷相關(guān)模式分子如熱休克蛋白、ATP、硫酸乙酰肝素、DNA、RNA等，進(jìn)而在趨化因子和粘附分子的調(diào)節(jié)下產(chǎn)生無(wú)菌性炎癥反應(yīng)^[5,6]。缺血性腦卒中其病因可分為以下5類：大動(dòng)脈粥樣硬化、心源性、穿支動(dòng)脈疾病、其他病因、病因不確定^[7]。多數(shù)研究認(rèn)為，恢復(fù)腦組織供血是治療腦缺血最有效的方法。1996年起組織纖溶酶原激活劑(tPA)即批準(zhǔn)用于缺血性腦卒中治療，迄今為止其仍然是美國(guó)藥監(jiān)局(FDA)唯一審核通過(guò)的溶栓藥物。闡明腦卒中發(fā)生后較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)促進(jìn)或保護(hù)腦組織損傷的分子機(jī)制對(duì)于研究有效的卒中治療靶點(diǎn)或者策略具有重要意義。

IRF家族是一大類對(duì)IFN起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。IRF家族有10個(gè)成員，其中，IRF1-9普遍表達(dá)于哺乳動(dòng)物中，IRF10則特異性地在鳥(niǎo)類和魚(yú)類中表達(dá)^[8,9]。在結(jié)構(gòu)上，IRF家族成員的N末端含有相對(duì)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain，DBD)，C末端包含有IRF相關(guān)結(jié)構(gòu)域(IRF associateddomain，IAD)、自我抑制結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)等，提示著IRF家族成員生物學(xué)功能的統(tǒng)一性和特異性^[10]。IRF家族在天然免疫網(wǎng)絡(luò)中起著重要調(diào)控作用，IRF6雖然在結(jié)構(gòu)上與IRF家族其他成員類似，但是IRF6在天然免疫上的功能知之甚少，甚至大量的研究認(rèn)為IRF6與天然免疫沒(méi)有關(guān)系。目前關(guān)于IRF6的研究主要集中在調(diào)控上皮細(xì)胞的成熟分化方面，并且IRF6執(zhí)行其生物學(xué)功能都通過(guò)非免疫依賴的方式實(shí)現(xiàn)的^[11,12]。但是，IRF6能否通過(guò)非免疫依賴的方式調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是缺血性腦卒中尚不清楚。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mozaffarian D,Benjamin E J,Go A S,et al.Heart Disease and Stroke Statistics-2016Update:A Report From the American Heart Association[J].Circμlation.2016,133(4):e38-e360.

[2]Rothwell P M,Algra A,Amarenco P.Medical treatment in acute and long-term secondary prevention after transient ischaemic attack and ischaemic stroke[J].Lancet.2011,377(9778):1681-1692.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)腦血管病學(xué)組.中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014[J].中華神經(jīng)科雜志.2015,48(4):246-257.

[4]Chamorro A,Dirnagl U,Urra X,et al.Neuroprotection in acute stroke:targeting excitotoxicity,oxidative and nitrosative stress,and inflammation[J].Lancet Neurol.2016,15(8):869-881.

[5]Chen G Y,Nunez G.Sterile inflammation:sensing and reacting to damage[J].Nat Rev Immunol.2010,10(12):826-837.

[6]Gelderblom M,Leypoldt F,Steinbach K,et al.Temporal and spatial dynamics of cerebral immune cell accumμlation in stroke[J].Stroke.2009,40(5):1849-1857.

[7]Adams H J,Bendixen B H,Kappelle L J,et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke.Definitions for use in a mμlticenter clinical trial.TOAST.Trial of Org 10172in Acute Stroke Treatment[J].Stroke.1993,24(1):35-41.

[8]Zhang X J,Zhang P,Li H.Interferon regμlatory factor signalings in cardiometabolic diseases[J].Hypertension.2015,66(2):222-247.

[9]Li S,Lu L F,Feng H,et al.IFN regμlatory factor 10is a negative regμlator of the IFN responses in fish[J].J Immunol.2014,193(3):1100-1109.

[10]Chen W,Royer W J.Structural insights into interferon regμlatory factor activation[J].Cell Signal. 2010,22(6):883-887.

[11]Moretti F,Marinari B,Lo I N,et al.A regμlatory feedback loop involving p63and IRF6links the pathogenesis of 2genetically different human ectodermal dysplasias[J].J Clin Invest.2010,120(5):1570-1577.

[12]Restivo G,Nguyen B C,Dziunycz P,et al.IRF6is a mediator of Notch pro-differentiation and tumour suppressive function in keratinocytes[J].EMBO J.2011,30(22):4571-4585.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決臨床防治腦卒中疾病現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的是確定IRF6基因的表達(dá)與腦卒中疾病之間的相互關(guān)系。提供一種以IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選防治腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種IRF6的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以神經(jīng)元特異性IRF6基因敲除小鼠以及IRF6基因過(guò)表達(dá)小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷造成腦卒中模型，研究IRF6基因與腦卒中的關(guān)系，結(jié)果表明與野生型小鼠(對(duì)照組)相比，IRF6基因敲除小鼠梗死體積明顯降低，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少；IRF6基因過(guò)表達(dá)小鼠梗死體積明顯增加，神經(jīng)功能明顯惡化，死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，腺病毒介導(dǎo)的IRF6干擾可保護(hù)原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞由缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的損傷，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。這提示IRF6具有惡化神經(jīng)功能的作用，能加重促進(jìn)腦卒中的發(fā)展，將為研究預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的新靶點(diǎn)和新策略提供了理論依據(jù)和臨床基礎(chǔ)。

因此，IRF6基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建IRF6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物；IRF6基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過(guò)基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的目的。例如以IRF6為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾IRF6表達(dá)的雙鏈siRNA，通過(guò)化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過(guò)RNA干擾的方法使IRF6基因沉默來(lái)治療腦卒中疾??；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建IRF6的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)IRF6原形的作用底物，從而抑制IRF6的功能，起到治療目的；此外，還可以以IRF6為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用IRF6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制IRF6的分子，從而為腦卒中疾病的治療提供新的治療策略。

針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制劑在制備保護(hù)神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)IRF6的上述功能，提供IRF6的抑制劑在制備治療腦卒中疾病的藥物中的應(yīng)用。

一種預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物，包含IRF6的抑制劑。

所述的IRF6的抑制劑優(yōu)選為IRF6基因的siRNA、IRF6基因的RNA干擾載體，IRF6的抗體及其他能夠抑制IRF6表達(dá)的抑制劑。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)IRF6的新功能，即IRF6具有惡化腦卒中疾病的作用。

(2)基于IRF6在惡化腦卒中疾病中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物提供靶標(biāo)。

(3)IRF6的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療腦卒中疾病的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠和神經(jīng)元特異性IRF6敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定結(jié)果圖

A為神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建圖；

B為神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果圖；

C為神經(jīng)元特異性IRF6敲除小鼠的構(gòu)建圖；

D為神經(jīng)元特異性IRF6敲除小鼠的鑒定結(jié)果圖；

圖2是NTG小鼠和IRF6-TG4小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估結(jié)果圖(*：p＜0.05vs NTG對(duì)照組)

A為T(mén)TC染色結(jié)果圖；

B為腦梗體積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；

C為神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)柱狀圖；

圖3是IRF6^flox/flox和IRF6-KO小鼠大腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估結(jié)果圖(*：p＜0.05vs IRF6^flox/flox對(duì)照組)

A為T(mén)TC染色結(jié)果圖；

B為腦梗體積統(tǒng)計(jì)柱狀圖；

C為神經(jīng)功能評(píng)分統(tǒng)計(jì)柱狀圖；

圖4是NTG和IRF6-TG4小鼠Fluoro Jade B小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測(cè)定結(jié)果圖(*：p＜0.05vs NTG組)

A為Fluoro Jade B檢測(cè)顯示圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

B為T(mén)UNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

圖5是IRF6^flox/flox和IRF6-KO小鼠Fluoro Jade B小鼠的腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測(cè)定結(jié)果圖(*：p＜0.05vs IRF6^flox/flox組)

A為Fluoro Jade B檢測(cè)顯示圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

B為T(mén)UNEL細(xì)胞凋亡圖和統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

圖6為經(jīng)腺病毒AdshIRF6轉(zhuǎn)染后OGD處理的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活性和乳酸脫氫酶釋放的結(jié)果圖(*：p＜0.05vs AdshRNA組)

A為神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活性檢測(cè)結(jié)果圖；

B為乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用雄性，8-12周齡，體重在24-27g，背景為C57BL/6的野生型小鼠(WT，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，質(zhì)量合格證號(hào)：949431)、神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF6-TG，由武漢大學(xué)李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)、非轉(zhuǎn)基因小鼠(NTG，同窩對(duì)照非轉(zhuǎn)基因小鼠)、IRF6^flox/flox小鼠(IRF6^flox/flox，由武漢大學(xué)李紅良教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建)及神經(jīng)元特異性IRF6基因敲除(IRF6-KO)小鼠(由IRF6^flox/flox小鼠與CaMKIIα-Cre(購(gòu)自Jackson Laboratory,Stock No.005359)小鼠雜交得到)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

(1)神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建過(guò)程(構(gòu)建策略見(jiàn)圖1A)：

載體構(gòu)建：用上游引物：5’-GCTCTAGAGCCACCATGGCCCTCCACCCCC -3’；下游引物：5’-GCTCTAGATTACTGGGGAGGCAGGGC-3’擴(kuò)增小鼠IRF6基因(NCBI,Gene ID:54139,NM_006147.3)cDNA，把擴(kuò)增的IRF6基因cDNA和pCAG-CAT-LacZ載體(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院楊青林老師實(shí)驗(yàn)室提供，制備過(guò)程參見(jiàn)參考文獻(xiàn)：Kim T,Zhelyabovska O,Liu J,et al.Generation of an Inducible,Cardiomyocyte-Specific Transgenic Mouse Model with PPAR b/d Overexpression[J].Peroxisome Proliferator-Activated Receptors(PPARs),57.)經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI(NEB，R0145L)酶切后連接，形成pCAG-loxP-CAT-loxP-IRF6-hGHpA載體。IRF6的表達(dá)由CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)得到。將構(gòu)建的載體通過(guò)顯微注射構(gòu)造成受精胚胎(C57BL/6J背景)，得到IRF6-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠。神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠由IRF6-floxed轉(zhuǎn)基因小鼠和CaMKIIα-Cre小鼠雜交繁殖得到。

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織中IRF6蛋白的表達(dá)量：提取不同轉(zhuǎn)基因鼠腦組織蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗(yàn)證IRF6過(guò)表達(dá)。我們構(gòu)建了幾株神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因小鼠(IRF6-TG2、3、4、6)，在不同轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)IRF6蛋白表達(dá)含量相對(duì)于NTG小鼠有不同程度提高(圖1B)。為了反映病理生理狀態(tài)下IRF6的改變，我們選擇了IRF6-TG4小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，Western Blot及定量分析顯示，其腦組織中IRF6表達(dá)量約為正常組織3.12倍。

(2)神經(jīng)特異性IRF6基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見(jiàn)圖1C)：

利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建神經(jīng)特異性IRF6基因敲除小鼠。首先，通過(guò)在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(http://crispr.mit.edu)分別在內(nèi)含子2和3中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)，靶序列分別為：

IRF6 sgRNA1：GAATTGAGTTATTGGGCACCTGG

IRF6 sgRNA2：GTCTGGGGCGACATTGTACAGCAGG

此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒，它包括兩側(cè)同源臂它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子3以及兩個(gè)同向的loxp序列。

①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4 DNA連接酶連入經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶XbaI處理過(guò)的pUC57-sgRNA(Addgene 51132)載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

②條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp的構(gòu)建：

分別合成4條寡聚單鏈核苷酸序列：

loxp1-F：

AGCTTGACGTCATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACCGGTGAT；

loxp1-R：

ATCACCGGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGACGTCA；

loxp2-F：

GATCCCTTAAGATAACTTCGTATAGCATACATTATAGCAATTTATACGCGTA；

loxp2-R：

CTAGTACGCGTATAAATTGCTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTTAAGG；

上述寡核苷酸序列退火后形成loxp1和loxp2兩條雙鏈。將pBluescript II SK(+)載體用HindIII(NEB，R0104L)和EcoRV(NEB，R0195L)雙酶切后連接入loxp1退火雙鏈，再將測(cè)序正確的載體用BamHI(NEB，R0136L)和SpeI(NEB，R0133L)雙酶切，連接入loxp2退火雙鏈，得到條件性敲除骨架載體，命名為pBluescript SK(+)-2loxp。

③供體載體(Donor Vector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物(表1)，以小鼠gDNA為模板，擴(kuò)增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。上述擴(kuò)增得到的產(chǎn)物及pBluescript SK(+)-2loxp載體經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后一一連接，得到供體載體。

表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)

④打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體pST1374-Cas9(Addgene 44758)用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進(jìn)行純化。

⑤IRF6^flox/flox條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過(guò)PCR方法篩選陽(yáng)性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得IRF6^flox/flox純合小鼠。

⑥神經(jīng)特異性IRF6基因敲除小鼠的制作

將上述IRF6^flox/flox小鼠與神經(jīng)細(xì)胞特異性CaMKIIα-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到IRF6^flox/flox/CaMKIIα-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到神經(jīng)細(xì)胞特異性IRF6基因敲除小鼠。

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝細(xì)胞特異性IRF6基因敲除小鼠腦組織中IRF6蛋白的表達(dá)量：提取腦、脂肪、肺、腎臟組織蛋白，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，驗(yàn)證IRF6表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)圖1D，在小鼠脂肪、肺、腎臟組織中，WT型小鼠和基因敲除小鼠IRF6蛋白表達(dá)含量變化不大，而在腦組織中，相比于WT型小鼠，基因敲除小鼠IRF6蛋白表達(dá)含量明顯降低。

飼養(yǎng)環(huán)境：所有實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SRF級(jí)小鼠飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。

【實(shí)施例1】小鼠腦梗死模型獲得

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：小鼠腦梗死模型由大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(I/R)獲得。動(dòng)物被隨機(jī)分為4組，每組10只小鼠，分別為對(duì)照組：非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照I/R術(shù)組(NTG I/R)、IRF6^flox/flox I/R術(shù)組(IRF6^flox/flox I/R)以及神經(jīng)元特異性IRF6轉(zhuǎn)基因I/R術(shù)組(IRF6-TG4I/R)、神經(jīng)元特異性IRF6基因敲除I/R術(shù)組(IRF6-KO I/R)

2.線栓法腦梗死I/R手術(shù)MCAO(middle cerebral artery occlusion，大腦中動(dòng)脈閉塞)模型操作流程：

(1)抓取小鼠，使用3％異氟烷麻醉小鼠，8％硫化鈉脫去頸部的鼠毛，顱頂鼠毛用手術(shù)剪迅速剪掉，3％活力碘消毒頸部及顱頂皮2次，75％酒精脫碘1次。

(2)在小鼠的顱頂部位橫向切口，暴露顱骨，用鑷子輕輕剝離顱骨表面的結(jié)締組織。將激光多普勒血流儀的光纖探頭用生物膠固定在前囟后方2mm、左側(cè)5mm的部位。

(3)將小鼠仰臥固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內(nèi)緣分離肌肉和筋膜，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)。用微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉ICA、CCA，在ECA遠(yuǎn)心端結(jié)扎和剪一小口，將線栓由剪口送入ICA，當(dāng)線栓進(jìn)入深度在9-11mm左右至血流下降遇阻力停，整個(gè)過(guò)程必須維持小鼠的肛溫在37±0.5℃。

(4)從線栓進(jìn)入腦血管至血流下降遇阻力時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，45min后將線栓拔出，并將ECA近心端結(jié)扎，迅速松開(kāi)CCA處動(dòng)脈夾。注意觀察血流恢復(fù)情況，選擇血流下降75％以上，血流恢復(fù)達(dá)70％以上的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。

(5)縫合小鼠頸部及頭部皮膚，并用活力碘消毒傷口。手術(shù)結(jié)束后，將小鼠放在溫箱中，箱溫維持在28℃，給水和飼料，分別在24h、72h取材。

【實(shí)施例2】小鼠腦梗死模型腦梗死體積測(cè)定

腦缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括大腦梗死體積和神經(jīng)功能評(píng)分，這些指標(biāo)均與缺血/再灌注損傷嚴(yán)重程度正相關(guān)。

(1)分別在手術(shù)后24h、72h取材前進(jìn)行神經(jīng)功能及行為學(xué)評(píng)分；

基于Berderson神經(jīng)功能評(píng)分改進(jìn)方法(9分制)：

0分：無(wú)神經(jīng)受損的癥狀；

1分：提尾時(shí)對(duì)側(cè)前肢蜷曲，或者不能完全到達(dá)患側(cè)前肢；

2分：提尾時(shí)對(duì)側(cè)肩膀內(nèi)收；

3分：平推：向?qū)?cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降；

4分：可自發(fā)的向各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)，但在脫尾巴時(shí)只向?qū)?cè)轉(zhuǎn)彎；

5分：自發(fā)運(yùn)動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)圈或只向?qū)D(zhuǎn)；

6分：無(wú)自主運(yùn)動(dòng)，只在刺激時(shí)運(yùn)動(dòng)；

7分：無(wú)自主運(yùn)動(dòng)，刺激時(shí)也無(wú)運(yùn)動(dòng)；

8分：與腦缺血有關(guān)的死亡。

(2)抓取小鼠，腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉小鼠，取腦。

(3)將取下的腦組織放入1mm小鼠腦模，置于-20℃冰箱凍存。

(4)腦組織2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloricej，TTC)染色：從-20℃冰箱取出腦組織，立即切成1mm厚的切片，共切7片。將切片立即置于10mL 2％TTC溶液中，37℃恒溫孵育10min。正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。

(5)用10％中性福爾馬林溶液固定腦組織切片，大體拍照。

(6)腦梗體積計(jì)算(Image-Pro Plus 6.0軟件)：梗死體積％＝(對(duì)側(cè)大腦半球體積-梗死側(cè)未梗死體積)/(對(duì)側(cè)大腦半球體積×2)×100％；

總梗死體積為各自7張大腦切片結(jié)果數(shù)據(jù)之和。

TTC是脂溶性光敏感復(fù)合物，它是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色，而缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降，不能反應(yīng)，呈蒼白色。

NTG、IRF6-TG4組TTC染色結(jié)果如圖2A所示，經(jīng)過(guò)I/R缺血45min再灌注24小時(shí)后IRF6-TG4小鼠梗死體積較對(duì)照組小鼠增加，且在I/R術(shù)后72小時(shí)仍然持續(xù)(圖2B)；且I/R組IRF6-TG4小鼠神經(jīng)功能評(píng)分在術(shù)后24小時(shí)、72小時(shí)均比對(duì)照組小鼠高(圖2C)。相反的，IRF6-KO小鼠I/R術(shù)后24h、72h梗死體積較對(duì)照組小鼠均降低(圖3A、B)，神經(jīng)功能評(píng)分也比對(duì)照組小鼠低(圖3C)。這一結(jié)果表明IRF6基因的缺失可減少缺血再灌注損傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死體積，可保護(hù)神經(jīng)功能，即IRF6基因?qū)θ毖俟嘧p傷引起的腦卒中小鼠的大腦梗死以及神經(jīng)功能損傷具有惡化作用。

【實(shí)施例3】腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測(cè)定

1.腦組織冰凍切片制備

(1)抓取小鼠，腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉小鼠。

(2)開(kāi)胸暴露心臟，用注射針頭穿刺入左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心房。

(3)用PBS(0.01M，pH 7.4)100mmHg壓力灌流至肝臟變白后，用4％多聚甲醛灌流15min。

(4)開(kāi)顱迅速取出小鼠大腦，室溫4％多聚甲醛后固定6-8h。

(5)切除腦組織的嗅球和小腦，再延正中線將大腦分為先后兩個(gè)部分，用先前的固定液再固定15min。

(6)隨后浸沒(méi)于含30％蔗糖的PBS(0.01M，pH 7.4)中，4℃冰箱沉底過(guò)夜。

(7)30％蔗糖與OCT包埋劑按1:1(v/v)混合后，倒適量到包埋框中，將前一步的組織取出，在紗布上吸去液體后在該包埋框中浸泡一會(huì)兒，再將其轉(zhuǎn)入到先已加入2滴OCT的另一個(gè)包埋框中，調(diào)整組織的位置，使其正好位于包埋框的正中。

(8)將盛組織的包埋框，移入干冰中，盡量使其處于水平位，稍待一會(huì)兒后，繼續(xù)加入OCT，浸沒(méi)組織一定的高度，待OCT凝固后，將其儲(chǔ)存于-80℃的冰箱中。

(9)用冰凍切片機(jī)的標(biāo)準(zhǔn)程序切5μm的冰凍切片備用。

2.FJB(Fluoro Jade B)染色

(1)將冰切組織切片在烘箱中烘干1小時(shí)；

(2)1％NaOH+80％無(wú)水乙醇5min；

(3)70％無(wú)水乙醇2min；

(4)ddH₂O 2min；

(5)Flouro Jade B稀釋液(AG310,Millipore,Billerica,MA)，室溫，避光20min；

(6)ddH₂O 1min×3；

(7)在烘箱中烘片5-10min；

(8)二甲苯>1min；

(9)封片，拍照。

3、TUNEL試劑盒染色檢測(cè)凋亡

用TUNEL試劑盒染色檢測(cè)凋亡。(TUNEL試劑盒： Plus In Situ Apoptosis Fluorescein Detection Kit(S7111，Chemicon)):

(1)將冰切組織切片置于(pH 7.4)1％的多聚甲醛中，室溫固定水解10分鐘；

(2)PBS洗兩次，每次5min；

(3)置于預(yù)冷的乙醇：乙酸(2：1)溶液中，-20℃浸泡5分鐘，去除多余液體，但注意不要干燥；

(4)PBS洗兩次，每次5min；

(5)濾紙小心吸去多余液體，立即在切片上按75μl/5cm2直接加入平衡緩沖液，室溫孵育1-5min；

(6)濾紙小心吸去多余液體，立即在切片上按55μl/5cm²直接加入TdT酶反應(yīng)液，置于避光保濕盒中作用1h(陰性對(duì)照加入不含TdT酶的反應(yīng)液)；

(7)將切片置于終止/洗滌緩沖液中，輕輕搖動(dòng)15sec，室溫孵育10min；此時(shí)準(zhǔn)備適量抗地高辛抗體，預(yù)熱至室溫，注意避光；

(8)PBS洗三次，每次1min；

(9)濾紙小心吸去多余液體，直接在切片上按65μl/5cm²加入抗地高辛抗體，室溫下于避光保溫濕盒中作用1h；

(10)PBS洗四次，每次2min；

(11)SlowFade Gold antifade reagent with DAPI(Invitrogen，S36939)封片；

(12)熒光鏡下觀察，拍照。若需保存，于暗濕盒中4℃保存。在熒光顯微鏡下觀察，拍照，計(jì)數(shù)凋亡神經(jīng)元細(xì)胞。(若需保存，于暗濕盒中4℃保存)

腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況測(cè)定結(jié)果如圖4、圖5所示。圖4是是IRF6-TG4小鼠和NTG小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)luoro Jade B染色(A)和TUNEL染色(B)結(jié)果顯示IRF6-TG4小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率均比NTG小鼠增大。圖5是IRF6-KO小鼠和IRF6^flox/flox小鼠I/R術(shù)后24小時(shí)腦組織梗死周邊區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況，F(xiàn)luoro Jade B染色(A)和TUNEL染色(B)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示IRF6-KO小鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比IRF6^flox/flox組小鼠低。這些結(jié)果表明，減少I(mǎi)RF6基因的表達(dá)可以改善腦組織缺血/再灌注損傷，且可能與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡密切相關(guān)；IRF6基因可惡化腦組織缺血/再灌注損傷的發(fā)生，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

【實(shí)施例4】IRF6干擾(AdshIRF6)對(duì)缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力的影響

4.1新生SD乳鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)

Sprague-Dawley乳鼠購(gòu)買(mǎi)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

(1)準(zhǔn)備培養(yǎng)平皿，加入DMEM培養(yǎng)基，在冰上預(yù)冷。

(2)將出生1天的SD乳鼠，75％乙醇浸泡消毒。

(3)用小剪和鑷子逐層分離乳鼠皮膚及顱骨，取出腦放入平皿并在冰上分離皮層。

(4)將腦皮層轉(zhuǎn)入置于冰上的盛有DMEM液的培養(yǎng)皿中，剪碎腦組織。

(5)將剪碎的腦組織轉(zhuǎn)入15mL離心管，將DMEM液吸盡，加入0.125％酶消化液5mL。

(6)將離心管置于37℃水中消化20min左右，用含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液終止消化。

(7)1000r/min離心×5min，吸棄上清，加入4ml含20％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，用200目網(wǎng)篩過(guò)濾。

(8)將細(xì)胞接種于10mg/L多聚賴氨酸過(guò)夜包被的培養(yǎng)皿。

(9)4-6h后全量換成Neurobasal+B27培養(yǎng)基。

(10)接種第2d，根據(jù)情況加入終濃度5μmol/L的阿糖胞苷處理24h后，全量換Neurobasal+B27培養(yǎng)液。

(11)每隔兩天半量換液,第5d左右細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

4.2氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)(OGD)：將細(xì)胞培養(yǎng)皿Neurobasal+B27培養(yǎng)液棄去，換成無(wú)血清無(wú)糖的OGD液，放入95％N₂和5％CO₂低氧培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)1h，到時(shí)間后取出培養(yǎng)皿棄去ODG液換成Neurobasal+B27培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，到相應(yīng)的時(shí)間后，收集樣品。對(duì)照組在正常培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。

4.3構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞：

(1)AdshRNA和AdshIRF6載體的構(gòu)建方法參見(jiàn)文獻(xiàn)：Chen K,Gao L,Liu Y,et al.Vinexin-βprotects against cardiac hypertrophy by blocking the Akt-dependent signalling pathway[J].Basic Res Cardiol,2013,108(2):1-14.。

(2)腺病毒的包裝：

1)用Pac I處理重組的陽(yáng)性質(zhì)粒，用乙醇沉淀后重懸于20μl無(wú)菌水中。

2)使用VigoFect將6μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染匯合率為50～70％的293A細(xì)胞，8h后移除混合液，加入4ml含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液，觀察綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染效率。

3)轉(zhuǎn)染后的7～10d，觀察到細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)時(shí)，用移液器將細(xì)胞吹下，移到50ml錐形離心管中。離心后用1ml PBS使細(xì)胞重懸。液氮凍結(jié)細(xì)胞，再用37℃水浴融化，并劇烈振蕩，重復(fù)4次。之后離心，取上清液，得到第一代病毒，-80℃保存。

4)將293A細(xì)胞鋪在100mm培養(yǎng)皿內(nèi)，匯合率為50～70％，加入含病毒的上清液0.5ml。2～3d可觀察到明顯的細(xì)胞裂解或CPE現(xiàn)象。感染后3～5d，當(dāng)1/3～1/2的細(xì)胞脫離時(shí)收集病毒，并按上述方法獲得病毒上清液。

5)將獲得的病毒上清液感染100mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞，收集病毒，使其感染150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的293A細(xì)胞，進(jìn)一步擴(kuò)增，獲得足量病毒。

6)將富集的病毒顆粒上清液滴加在CsCl梯度溶液上，30000rpm超速離心，4℃，16h。離心后出現(xiàn)兩個(gè)條帶，顏色弱、位置高的條帶為腺病毒空殼；顏色亮、位置低的條帶含活病毒顆粒，用16號(hào)針頭收集該條帶。

7)之后在TBS中透析1h，再用含有10％甘油的TBS透析兩次，每次1h。將獲得的純化腺病毒裝進(jìn)EP管中。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定透析液中的總蛋白，1μg病毒蛋白≈4×109病毒顆粒。腺病毒短期保存在4℃冰箱，長(zhǎng)期應(yīng)保存在-80℃超低溫冰箱。

(3)腺病毒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)細(xì)胞：通過(guò)梯度感染法確定所需病毒用量。感染原代神經(jīng)細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)(mμltiplicity of infection,MOI)為100：1。將Ploybrene加入培養(yǎng)液，二者比例為1：1000。感染后8～12h換液，加入適量完全培養(yǎng)基。

4.4細(xì)胞活性的測(cè)定：細(xì)胞活性檢測(cè)用CCK8試劑盒，其原理是WST-8在電子耦合劑存在時(shí)，可以被活細(xì)胞中的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物，進(jìn)而可以反應(yīng)活細(xì)胞數(shù)量。用CCK8試劑盒(CK04,Dojindo,Japan)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞活性，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)：

(1)在神經(jīng)元培養(yǎng)96孔板中，感染相應(yīng)腺病毒，并OGD處理指定時(shí)間后。

(2)加入10μl/每孔CCK-8溶液，空白對(duì)照組加入相應(yīng)量的培養(yǎng)液。

(3)將培養(yǎng)板放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h。

(4)在450nm測(cè)定吸光度,同時(shí)使用630nm的波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行波長(zhǎng)測(cè)定。

4.5細(xì)胞LDH釋放檢測(cè)：活細(xì)胞的胞漿內(nèi)含有乳酸脫氫酶(LDH)，正常情況下，LDH不能透過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。進(jìn)而可以通過(guò)測(cè)定LDH的釋放來(lái)反應(yīng)細(xì)胞損傷毒性。用LDH試劑盒(G1782,Promega)檢測(cè)細(xì)胞釋放LDH，具體操作步驟按照說(shuō)明書(shū)：

(1)將培養(yǎng)的神經(jīng)元感染相應(yīng)病毒，并用OGD處理指定時(shí)間。

(2)將待測(cè)的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板從細(xì)胞培養(yǎng)箱取出，放進(jìn)離心機(jī)以250g,離心4分鐘。

(3)分別移取50μl/孔上清液到新的96孔板的相應(yīng)孔里，避免觸摸細(xì)胞，同時(shí)注意做好標(biāo)記。

(4)每孔分別加入50μl底物混合液，混勻，在室溫下孵育30分鐘，避免光照。

(5)每孔分別加入50μl終止液。在波長(zhǎng)490nm測(cè)定吸光度值。

IRF6干擾(AdshIRF6)對(duì)缺氧復(fù)氧(OGD)處理刺激的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞活力結(jié)果如圖6所示。經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活力降低，乳酸脫氫酶的釋放量增加，而經(jīng)AdshIRF6轉(zhuǎn)染的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)活力的下降程度以及乳酸脫氫酶釋放的增加程度明顯小于AdshRNA對(duì)照組。說(shuō)明體外敲低IRF6基因可保護(hù)原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)抗缺氧/復(fù)氧損傷，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

研究結(jié)果表明，在大腦中動(dòng)脈缺血再灌注引起的損傷中，IRF6敲除小鼠梗死體積顯著減少，神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯減少；IRF6過(guò)表達(dá)小鼠梗死體積顯著增加，神經(jīng)功能明顯惡化，凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也明顯增多，體外利用AdshIRF6敲低IRF6基因表達(dá)獲得與載體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)一致的結(jié)果，敲低IRF6基因表達(dá)的原代皮層神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)OGD處理后，細(xì)胞活力增加；這些結(jié)果說(shuō)明IRF6在腦卒中疾病模型中有著重要的惡化作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 干擾素調(diào)節(jié)因子6及其抑制劑在腦卒中疾病中的應(yīng)用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctctagagc caccatggcc ctccaccccc 30

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctctagatt actggggagg cagggc 26

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人類

<400> 3

gaattgagtt attgggcacc tgg 23

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人類

<400> 4

gtctggggcg acattgtaca gcagg 25

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 8

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgctcgagc gatctcgatc tcgttcctc 29

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgcgtcgac agcaggcttt atgaaaccct t 31

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tctaccggtg tacaatgtcg ccccaga 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcgatatcg cccaataact caattcaagt 30

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggactagtac ctggagcctc tgtttctt 28

<210> 14

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ataagaatgc ggccgccaag ttgttcgtgg cacagt 36